杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.]是我国南方重要的优良造材树种，分布面积广，栽培历史悠久，具有重要的经济价值。在杉木种子发育过程中，会受各种因素的影响而出现败育。刘志敏^[1]曾报道在雌配子体的发育、传粉、受精、胚和胚乳的发育等每一环节都有可能败育。这种败育现象严重影响杉木种子后期萌发，对杉木人工林的可持续发展极为不利。

一般杉木涩籽率达到50%~60%，种子园的杉木涩籽率相对较低，但也达到30%左右^[2]。高涩籽率是杉木种子发芽率低的主要原因，严重地影响种子园的产量和质量。目前，对杉木种子的研究多集中在杉木种子萌发、激素、蛋白和基因方面^[3-8]，此外也有关于杉木胚胎发育过程的形态变化、涩粒物质的研究^[9-11]。但这些针对杉木涩籽的研究也多集中在胚的败育过程，而对在受精前就已经发生败育的杉木胚珠，其败育过程的研究相对较少，且研究方法仅局限于常规制片法，此方法往往存在染色不易控制、分辨率低、不利于观察等问题。鉴于此，采用清晰度和分辨率较优的半薄切片法，在超微结构上对杉木胚珠进行观察，以杉木健籽胚珠为对照，与在受精前就已经发生败育的杉木胚珠的形态结构进行比较分析，可为杉木种子生产中降低涩籽率提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料的采集与保存

杉木胚珠采自福建省三明市尤溪县林木良种基地，该林场杉木从2009年开始采种。2013年5月初至6月中旬，定期采集同种家系的杉木球果若干枚，用福尔马林-乙酸-乙醇 (formalin-aceto-alcohol, FAA) 固定液 (浓度70%的酒精、冰醋酸和甲醛以18:1:1的比例配制) 固定带回，放到4 ℃冰箱保存，备用。

1.2 杉木胚珠的外部形态观察

将杉木胚珠置于解剖镜下用解剖针除去种翅，操作时胚珠不能离开FAA固定液过久，避免胚珠干燥变形，且针头不能划破胚珠，以免影响形态观察结果。将解剖好的胚珠按不同采集时间分别在体视解剖镜下观察并拍照。

1.3 杉木胚珠的内部结构特征观察

观察种子内部结构主要采用半薄切片法，将除去种翅的杉木胚珠用Epon 812环氧树脂包埋剂渗透、包埋。其主要步骤为漂洗、脱水、丙酮置换、渗透、聚合，在切片机上分别切片，在显微镜下观察、照相。

1.3.1 取材

取每个时期的杉木胚珠各30粒左右，剥去种翅，放FAA固定液里，作好标记。

1.3.2 漂洗和脱水

将处理后的胚珠用1xPBS洗2次，每次30 min，然后用乙醇进行脱水：分别在体积分数为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇中逐级脱水各20 min，然后在体积分数为95%的乙醇中脱水30 min，体积分数为100%的乙醇中脱水3次, 各30 min。

1.3.3 丙酮置换

把1.3.2处理后的材料放入等体积无水乙醇和无水丙酮的混合液中30 min，再转入无水丙酮中过夜。

1.3.4 渗透

将1.3.3处理后的材料依次放入体积比分别为3:1和1:1的丙酮和Epon 812包埋液中3 h，然后转入纯Epon 812包埋液中2次, 各12 h，各级处理温度都为30 ℃。

1.3.5 聚合

将1.3.4处理后的材料挑入包埋树胶板的胶囊内，待放好位置后，填满新配的Epon 812包埋液，先置于40 ℃温度下12 h，然后转入60 ℃温度下3 d，待包埋液干燥后取出包埋小块。

1.3.6 半薄切片

根据材料在固定块中的位置和方向，修整样品块 (在保证样品完整的情况下, 与切刀的接触面尽可能小，周边光滑平整)，然后把包埋小块固定到固定台上进行切片，切片厚度为2~4 μm。

1.3.7 展片及粘片

将铁丝的一端拧成一个小圆圈，用来捞水槽中的切片，然后将切片小心地放在干净的载玻片上，放在40 ℃干燥台上干燥。

1.3.8 染色和观察

在切片上均匀地滴上甲苯胺蓝，3 min后用吸水纸吸掉多余的染色液，在显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析 2.1 杉木胚珠的外部形态

杉木胚珠外形多种多样，外侧有翅，将种翅剖开后会发现正常发育的胚珠呈乳白色，败育胚珠呈灰黄色，但在形成初期从外形上无法辨认。杉木可育胚珠的形态如图 1A~D所示，败育胚珠的形态如图 1E~H所示。从图 1A~D中可以看出，可育胚珠颜色呈乳白色，籽粒饱满，到5月下旬 (图 1C)，胚珠迅速膨大；由图 1E~H可以看出，败育胚珠表面色泽较暗，籽粒干瘪，败育初期的胚珠仅珠孔端颜色较深呈灰黑色，后期胚珠表面全都变成灰黑色。

2.2 杉木胚珠的内部结构

图 2A~D分别为5月10日、20日、30日和6月10日的可育胚珠纵切显微图。从图 2A可以观察到胚珠顶端的珠孔、花粉管，而在胚珠中央的珠心组织内刚发育形成雌配子体。5月10—30日是雌配子体快速发育的时期，珠心组织大部分被分解吸收，仅顶端还残留纸帽形状的薄层，颈卵器已经形成，花粉管向颈卵器方向延伸。到6月10日 (图 2D)，花粉管伸长至颈卵器内。

图 2E~H分别为5月10日、20日、30日和6月10日的败育胚珠纵切显微图。5月10日 (图 2E) 胚珠刚出现败育的现象，胚珠瘦小，顶端有珠孔、花粉管，珠心组织萎缩且内部未形成雌配子体。到5月30日 (图 2G)，珠孔退化消失，近珠孔部分明显收缩，花粉管伸长到珠心内部，雌配子体仍没有发育。到6月10日 (图 2H)，部分珠心组织解体，胚珠内部组织松散。

综上所述，胚珠败育在正常授粉后不能形成健全的雌配子体完成受精，它与健全的胚珠结构变化有很大区别。此外，与可育胚珠相比，败育胚珠发育较快，如5月30日时可育胚珠刚形成颈卵器时，败育胚珠花粉管已经延伸到胚珠内部，到6月10日可育胚珠花粉管伸长至胚珠内部的颈卵器时，败育胚珠的内部结构已基本定型。

2.3 可育与败育胚珠的内部结构 2.3.1 可育与败育胚珠的顶端结构

图 3为胚珠珠孔端的纵切显微图。杉木的雄配子体即花粉粒，经珠孔直接进入到胚珠，在珠心上方萌发，形成花粉管进入胚囊，将由生殖细胞所产生的精子送到颈卵器内。可育和败育胚珠均能正常形成珠孔，花粉都会萌发形成花粉管，且无论是健全还是败育的胚珠，其花粉管都能够向珠心组织内部延伸，为受精活动做准备。

2.3.2 可育与败育胚珠的内部细胞结构

图 4A~C和图 4H~J分别为可育和败育胚珠5月10日的珠孔端、两侧和底端结构的放大图。可育胚珠内部细胞轮廓清晰，排列紧密，可清楚观察到细胞核结构。在败育胚珠的珠孔端，大多数细胞坏死，细胞核消失，少数细胞会解体退化，细胞间存在间隙；与珠孔端相比，两侧和底端的细胞保持较好，轮廓清晰，细胞未出现解体现象，细胞核明显。

图 4D~F和图 4K~N为可育和败育胚珠6月10日的珠孔端、两侧和底端结构放大图。可育胚珠内部细胞分层排列，结构清晰。败育胚珠萎缩较严重已经看不到完整细胞结构，内部组织解体退化，仅留下组织残痕，胚珠内部充满灰褐色物质。

与可育胚珠的内部正常形成的完整细胞形态和结构相比较而言，在败育胚珠的内部，细胞会发生解体，未解体的细胞会被灰褐色物质填充，细胞解体最先出现在胚珠的珠孔端。

3 结论与讨论

在可育和败育胚珠珠心内，花粉都能萌发，形成的花粉管能持续向胚珠内部延伸。在败育胚珠内花粉萌发，形成花粉管向着珠心内部延伸。裸子植物中普遍存在受精延迟现象，太白红杉 (Larix chinensis Beissn)^[12]、白豆杉 (Pseudotaxus chienii Cheng)^[13]从传粉到受精大约需要一个月，在授粉后不久，花粉就开始从珠孔端向下生长，而此时胚珠还没有出现败育现象。另外汤红明等^[14]研究表明花粉萌发离不开矿质元素和植物生长激素。这些说明胚珠尚未败育时，花粉已经萌发，而在败育初期，胚珠的结构功能未完全消失，仍然能为花粉的萌发提供所需营养物质。

可育胚珠的珠心组织中央会形成健全的雌配子体，而败育胚珠的珠心组织较瘦弱，其内未形成健全雌配子体。5月10日时在可育胚珠的珠心组织内，雌配子体开始发育，到6月10日时雌配子体发育成熟，其近珠孔端形成颈卵器结构，而同时期的败育胚珠，其珠心组织较弱小，珠心内部未形成雌配子体。苏建英等^[15]、贾桂霞等^[16]认为雌配子体从周围的珠心组织中吸收营养，另外史忠礼^[17]也认为杉木胚的败育是因为雌配子体 (胚乳) 营养不充足造成的。故杉木胚珠的败育可能是珠心组织较瘦小，无法为雌配子体的发育提供充足营养。

在败育胚珠的珠孔端，最先出现细胞坏死和解体，导致珠孔端的组织变得松散，组织间出现涩粒物质，然后胚珠中下端逐渐开始出现这种现象, 说明胚珠败育时珠孔端先出现涩粒物质，然后向下蔓延。

雌配子体从其周围的珠心组织内吸收营养，体积快速增大，败育胚珠内部无雌配子体形成，内部主要是被涩粒物质填充的珠心组织。刘成运、苏建英等认为珠心组织主要是为雌配子体的发育提供营养, 而因败育胚珠内部未能形成雌配子体，珠心组织得以保留，后期败育胚珠的内部主要是珠心组织。