森林与环境学报  2017, Vol. 37 Issue (1): 54-59   PDF    
http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2017.01.009
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杨德明, 张娅欣, 沈少炎, 荣俊冬, 何天友, 郑郁善
YANG Deming, ZHANG Yaxin, SHEN Shaoyan, RONG Jundong, HE Tianyou, ZHENG Yushan
福建柏叶片蛋白质双向电泳技术优化
Protocols optimization in two-dimensional electrophoresis of Fokienia hodginsii leaves total protein
森林与环境学报,2017, 37(1): 54-59.
Journal of Forest and Environment,2017, 37(1): 54-59.
http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2017.01.009

文章历史

收稿日期: 2016-04-07
修回日期: 2016-09-16
福建柏叶片蛋白质双向电泳技术优化
杨德明1,2, 张娅欣1, 沈少炎2, 荣俊冬1, 何天友3, 郑郁善1     
1. 福建农林大学林学院, 福建 福州 350002;
2. 福建农林大学工业原料研究所, 福建 福州 350002;
3. 福建农林大学艺术园林学院, 福建 福州 350002
摘要: 蛋白质双向电泳是蛋白质组学研究方法之一,但蛋白质双向电泳技术体系却因物种不同而有所差异,因而蛋白质双向电泳体系的建立是进行蛋白质分离、鉴定的首要步骤。本文对福建柏叶片蛋白质提取方法、IPG胶条、等电聚焦参数设定、丙烯酰胺分离胶浓度等因子进行单因素分析,对福建柏双向电泳技术进行优化。结果表明,采用三氯乙酸-丙酮提取福建柏叶片的蛋白点多且图像清晰,pH4~7的IPG胶条最适合福建柏叶片蛋白的分离,等电聚焦参数设定为20 000 Vh,浓度为10%的分离胶进行福建柏双向电泳最好。本研究初步建立了福建柏叶片蛋白质双向电泳体系,为深入研究福建柏蛋白质组学提供依据。
关键词双向电泳     福建柏     蛋白质组     等电聚焦     pH    
Protocols optimization in two-dimensional electrophoresis of Fokienia hodginsii leaves total protein
YANG Deming1,2, ZHANG Yaxin1, SHEN Shaoyan2, RONG Jundong1, HE Tianyou3, ZHENG Yushan1     
1. College of forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
2. Institute of Bamboo, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
3. College of Landscape, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
Abstract: In order to study the most efficient 2-DE protocol of Fokienia hodginsii proteomics, three different methods including TCA-acetone, phenol extraction method and TCA-phenol extraction method were tested in the experiment. Besides, three different IPG strips of pH3~10, pH5~8, pH4~7 combined with three different focusing parameter which showed 20 000, 25 000, 30 000 Vh respectively were performed in IEF. Finally, different concentration separation gel (10%,12.5%)were performed in all SDS-PAGE trial. The results indicated that more protein spots were detected on 2-DE gels by phenol extraction method, IPG strips of pH4~7, 25 000 Vh focusing parameter, and 10% separate gel were the best settings of the 2-DE protocol. The experiment preliminary established the 2-DE protocols of F. hodginsii leaves which would be beneficial for the further study of proteinmics.
Key words: two-dimensional electrophoresis     Fokienia hodginsii     proteomics     isoelectric focusing     pH    

福建柏[Fokienia hodginsii (Dunn) Henry et Thomas]是柏科福建柏属常绿乔木,国家2级保护植物,为福建省珍稀乡土树种,树形优美,材质优良,具有耐瘠薄的生长特性[1]。 近年来有关福建柏研究主要有栽培、 生理生化等研究,植物抗性、 基因功能的开发等分子生物学研究也逐渐发展。 蛋白质是基因表达的产物,在植物的生长发育与生命活动调节中发挥着重要作用,从蛋白质水平研究福建柏生命活动的基因调控、 翻译后修饰等生命机制有重要的意义。

自1975年起用双向电泳技术进行蛋白质的分离至今已逾40 a[2],在后基因组时代,蛋白质组研究被推向了一个新的高度。 从限制蛋白质稳定性的两性电解质载体聚丙烯酰胺电泳法至如今的固定pH梯度胶的出现使得蛋白质双向电泳更加稳定。双向电泳技术是研究蛋白质组学的主要技术手段之一,具有重复性高、 可操作性强、 可见性好的特点,被众多研究蛋白质的学者倾睐[3]。MALTMAN et al[4]利用双向电泳分析发现发芽5和25 d蓖麻种子的内质网膜蛋白表达存在明显的差异,鉴定发现这些蛋白大多参与类脂化合物代谢作用。许珂等[5]对运用双向电泳分离出差异蛋白发现在玉米中谷氨酸脱氢酶(GDH)的高表达会影响正常的氮代谢,影响细胞能量供应,可能导致雄性不育。

双向电泳技术的原理是将蛋白质通过电泳进行分离,第一向根据蛋白等电点不同,从而在等电聚焦中固定在相应等电点的IPG胶条上,第二向则根据蛋白质的结构、 质量以及带电量的不同在丙烯酰胺凝胶上移动。 由于蛋白组包含该物种或组织的全部蛋白,数量及种类十分庞大,各物种或组织的蛋白种类与含量不尽相同[6],为获得福建柏叶片清晰、 分离度好的高质量双向电泳凝胶图,研究前应进行技术体系优化。

1 材料与方法 1.1 材料

福建柏叶片材料来自福建农林大学工业原料研究所,于2016年3月5日进行取样,选取长势良好、 无病虫害叶片,用剪刀剪下并迅速用液氮冷冻,存于-80 ℃超低温冰箱,以备后续实验。

1.2 主要仪器与试剂

Bio-Rad垂直电泳仪; Bio-Rad等电聚焦仪; Umax powerlook扫描仪; IPG胶条购于Bio-Rad,USA公司; 两性电解质; 二硫苏糖醇(DDT); 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸钠盐(CHAPS); 四甲基二胺(TEMED)、 碘乙酰胺、 PMSF、 丙烯酰胺、 过硫酸铵(AP)、 十二烷基磺酸钠(SDS); 低熔点琼脂糖、 交流聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 甲叉双丙烯酰胺。溶液试剂纯度均采用分析纯。

1.3 福建柏蛋白提取方法 1.3.1 三氯乙酸-丙酮-酚法

取1 g福建柏叶片剪碎在液氮中研磨成粉末(研磨时加入少量的PVPP),粉末分装于2 mL离心管中,每管0.3 g,加满在4 ℃预冷的丙酮(含10%的三氯乙酸和0.07%的β-巯基乙醇)、 振荡均匀后离心(15 000 g 8 min 4 ℃),小心吸取上清液丢弃。向离心管中加满4 ℃预冷的80%甲醇(含0.1 mol·L-1的醋酸铵)溶液,混合均匀后离心(15 000 g 8 min 4 ℃),将上清液丢弃。加入3倍体积80%预冷丙酮,涡旋振荡摇匀离心(15 000 g 8 min 4 ℃)后,将上清液丢弃,重复数次,直到上清液清澈为止。将离心管风干以去除多余丙酮,向离心管加入0.6 mL的Tris-饱和酚和0.6 mL的SDS提取液(30%蔗糖; 5%β-巯基乙醇; 2%SDS; 6.67%pH8.8,1.5 mol·L-1 Tris-HCl)完全混合均匀后,静置5 min,离心(15 000 g 8 min 4 ℃)后将含有蛋白质的“酚相”液体提取装入新的离心管中,并加满0.1 mol·L-1醋酸铵甲醇溶液,储存于-20 ℃冰箱中0.5 h直至看到离心管中有絮状物质后离心(15 000 g 8 min 4 ℃),小心吸取上清液丢弃。 沉淀用100%预冷甲醇清洗1次,振荡离心(15 000 g 8 min 4 ℃)后风干或真空干燥成蛋白粉,于-80 ℃保存[7]

1.3.2 三氯乙酸-丙酮法

取2 g福建柏叶片剪碎在液氮中研磨成粉末(研磨时加入少量的PVPP),粉末分装于2 mL离心管中,每管0.3 g; 加满4 ℃预冷的丙酮(含10%的三氯乙酸和0.07%的β-巯基乙醇)、 混合均匀后离心(15 000 g 8 min 4 ℃),将上清液丢弃。向离心管中加满4 ℃预冷的80%甲醇(含0.1 mol·L-1的醋酸铵)溶液,涡旋振荡反复摇匀后离心(15 000 g 8 min 4 ℃),将上清液丢弃。加满80%预冷的丙酮,涡旋振荡摇匀离心(15 000 g 8 min 4 ℃),将上清液丢弃,重复数次,直到上清液清澈为止,风干样品以去除多余丙酮,于-80 ℃保存[8]

1.3.3 酚法

取2 g福建柏叶片剪碎在液氮中研磨成粉末(研磨时加入少量的PVPP),粉末分装于2 mL离心管中,每管0.3 g。加入3倍体积蛋白提取液(体积分数3.3%1.5 mol·L-1 Tris-HCl(pH8.8) ; 质量分数0.75%KCl; 体积分数30%甘油; 质量分数1%DDT)放置5 min后离心(15 000 g 8 min 4 ℃)取上清液; 用提取液再次进行提取,离心(15 000 g 8 min 4 ℃),2次上清液混合加入Tris-饱和酚; 在冰箱中静置1 h后离心(15 000 g 8 min 4 ℃),取含有蛋白质的酚相加入甲醇(含0.1 mol·L-1醋酸铵),于-20 ℃静止过夜; 离心(15 000 g 8 min 4 ℃),丢弃上清液,加入-20 ℃预冷丙酮(含0.1%DDT)离心,丢弃上清液后干燥,蛋白粉于-80 ℃保存[9]

1.4 蛋白质裂解

按每1 mg蛋白干粉加入50 μL预冷蛋白质裂解液(质量分数4%CHAPS; 体积分数0.63%DTT; 质量分数42%尿素; 质量分数15.2%硫脲)再加入1 μL的蛋白酶抑制剂,待蛋白粉溶解后振荡摇匀(15 000 g 8 min 4 ℃) 后取上清液,即为蛋白质样品。蛋白质浓度参照BRADFORD[10]方法测定。

1.5 等电聚焦

使用BIO-RAD,USA公司生产的IPG胶条进行水化上样,取20 μL提取裂解好的蛋白质样品,加入120 μL水化上样缓冲液(质量分数48%尿素、 质量分数4%的CHAPS、 质量分数1%DTT,体积分数为0.005% pH3~10的两性电解质)120 μL,胶面朝下进行水化,不要在胶面下产生气泡,水化时在表面覆盖一层矿物油防止水分的挥发,水化时间12 h。分别对pH3~10、 pH4~7、 pH5~8的IPG胶条的分离效果进行比较。 等电聚焦参数设定见表 1

表 1 等电聚焦参数 Table 1 Setting of focusing parameter
聚焦程序Step of focusing电压Volt/V升压Boosting volt时间Time作用Purpose
S1250线性 Linear30 min除盐 Desalting
S2500 快速 Rapid30 min除盐 Desalting
S34 000线性 Linear3 h升压 Pump voltage
S44 000快速 Rapid20 000 Vh/25 000 Vh/30 000 Vh聚焦 Focusing
S5500快速 Rapid保持 Hold
1.6 胶条的平衡

等点聚焦完成后立刻进行IPG胶条的平衡,为了避免平衡液充分接触IPG胶条,事先用湿滤纸除去多余的矿物油。两步平衡,第一步加入平衡缓冲液1(质量分数为36%尿素、 质量分数2%SDS、 体积分数为25%的1.5 mol·L-1 pH8.8Tris-Hcl、 体积分数为20%的甘油、 质量分数为2%DDT)平衡15 min后,丢弃平衡液1,并用湿润的滤纸吸净加入平衡缓冲液2(质量分数为36%尿素、 质量分数为2%碘乙酰胺质量分数2%SDS、 体积分数为25%的1.5 mol pH8.8 Tris-HCl、 体积分数为20%的甘油)平衡15 min。

1.7 SDS-PAGE垂直电泳与染色

将平衡好的胶条安放在丙烯酰胺凝胶上。设置了浓度为10%的丙烯酰胺凝胶(体积分数为40%H2O 体积分数为25%的1.5 mol Tris-Hcl; 质量分数为0.1%的SDS; 质量分数为0.1%AP; 体积分数为10%的丙烯酰胺(含5%的甲乙双丙烯酰胺); 体积分数为0.04%TEMED); 浓度为12%的丙烯酰胺凝胶(体积分数为33%H2O 体积分数为25%的1.5 mol·L-1 Tris-Hcl; 质量分数为0.1%的SDS; 质量分数为0.1%AP; 体积分数为12%的丙烯酰胺(含5%的甲乙双丙烯酰胺); 体积分数为0.04%TEMED),用低熔点琼脂糖(含1%溴酚蓝)封胶液进行封胶,转移到垂直电泳槽中,加入电泳缓冲液,先用60 V恒压进行电泳,待溴芬蓝指示剂压缩成一条直线后改用150 V恒压,直到溴芬蓝指示剂刚好跑出凝胶,电泳结束,采用硝酸银进行染色[11]

1.8 图像扫描与处理

用Umax powerlook 2100扫描仪对凝胶进行扫描,分辨率为1 000 dpi,并使用Image Master 2D Platinum 7.0进行图像的扫描分析与处理。

2 结果与分析 2.1 提取方法对福建柏叶片蛋白质双向电泳的影响

双向电泳结果表明不同提取方法对蛋白质双向电泳影响较大(图 1)。 三氯乙酸-丙酮-酚法提取的蛋白图像清晰,点的分离度好,但是蛋白点较少,只有158个。 酚法提取蛋白质含量251个,但存在色素、核酸等杂质,对电泳的清晰度影响较大。 三氯乙酸-丙酮法提取的蛋白点226个,且图像清晰,较适合福建柏的双向电泳。

图 1 提取方法对福建柏蛋白质电泳结果的影响 Fig. 1 Effects of extraction methods on 2-DE maps of F. hodginsii protein (a) 三氯乙酸-丙酮-酚法 (b) 酚法 (c) 三氯乙酸-丙酮法 TCA-Acetone-phenol method Phenol method TCA-Acetone method
2.2 不同IPG胶条对比试验

不同胶条试验对比发现(图 2),采用pH3~10的IPG胶条时,蛋白点主要聚集在酸性端至中性端范围,而酸性端范围过于集中没有得到很好的分离。 pH5~8的IPG胶条蛋白分布均匀,蛋白点之间距离空隙大,分离度好,但是部分蛋白质没有有效分离,造成蛋白点分布的缺失。 pH4~7的IPG胶条分离度好,可以较大程度地体现福建柏叶片的蛋白同时蛋白点清晰,分离范围最适合福建柏蛋白。蛋白质等电聚焦是根据蛋白质等电点排列,因此找到一个合适的pH范围在满足pH点的分布范围以外,还要有最优的分离度,先用宽范围(pH3~10) 的IPG胶条,发现福建柏叶片蛋白点主要集中在酸性端到中性端的位置,蛋白点过于密集没有得到高效的分离,因此实验还采用了pH5~8的IPG胶条但是由于酸性端pH不足导致部分等电点低pH端的蛋白质没有得到有效分离,因此选用pH4~7的IPG胶条,条带清晰分离范围合适,此时的蛋白点和分离度都可以很好的满足福建柏叶片双向电泳。

图 2 不同pH范围的IPG胶条对福建柏蛋白质电泳的影响 Fig. 2 Effects of ph gradient of IPG strip on the 2-DE maps of F. hodginsii protein
2.3 等电聚焦时间对福建柏叶片双向电泳的影响。

不同等电聚焦时间发现,20 000 Vh检查到226个蛋白点; 25 000 Vh检查到235个蛋白点; 30 000 Vh检测到149个蛋白点,表明20 000~25 000 Vh之间参数变化不大。第一向电泳等电聚焦结果的好坏直接影响了蛋白质的水平分布,聚焦时间不足会出现蛋白没有跑到对应的等电点,而聚焦时间太会造成pH的改变,从而影响电泳结果。在设置的3个聚焦时间中,20 000 Vh与25 000 Vh的聚焦效果相当,没有明显的变化,当聚焦参数设定为30 000 Vh时,蛋白点变少,丢失严重,初步断定是由于水的电离使电泳溶液中pH的变化造成部分蛋白“跑出”IPG胶条,或是聚焦时间过长造成部分蛋白质沉淀在IPG胶条中,在竖向电泳中没有分离。可以认为20 000~25 000 Vh之间是福建柏叶片双向电泳较好的等电聚焦参数。

图 3 等电聚焦参数对福建柏双向电泳的影响 Fig. 3 Effects of isoelectric focusing setting of F. hodginsii protein
2.4 分离胶浓度对福建柏双向电泳的影响

通过2种不同分离胶浓度的对比,浓度为10%比12.5%的聚丙烯酰胺凝胶分离度好(图 4)。蛋白质在不同浓度的分离胶中迁移的速度不同,在研究福建柏叶片双向电泳的时候,要根据福建柏叶片的蛋白质的质量和结构的实际情况来选择分离胶的浓度,先利用浓度为12.5%的丙烯酰胺凝胶进行实验,发现蛋白分布在凝胶的中间部分,上下两端还有很多距离,因此改用浓度为10%的丙烯酰胺凝胶,发现其分离度较好,蛋白质点之间的距离更大,更利于后期分析,适合福建柏双向电泳技术体系。

图 4 分离胶浓度对福建柏双向电泳的影响 Fig. 4 Effects of separation gel concentrations of F. hodginsii protein
3 讨论 3.1 蛋白提取方法对福建柏的影响

样品制备是双向电泳研究的基础,目前蛋白质提取方法均有一定的局限性,因此在研究福建柏蛋白质双向电泳前,对其提取方法的比较,是一个必要的实验手段。 三氯乙酸-丙酮法是比较经典的方法,该法操作简单且高效,但存在一个沉淀蛋白复溶问题,尤其酚类物质易与蛋白产生不可逆的共价物质,导致蛋白质的拖尾。 酚法主要利用相似相溶的原理,样品中大部分杂质为水溶性,因此可以把大部分杂质去除,但同时也丢失部分水溶性蛋白。刘海衡等[16]发现在组织研磨过程中加入少量PVPP可以有效减少酚类物质的影响。沈少炎等[17]发现,运用三氯乙酸-丙酮法与酚法结合可以有效降低绿竹中杂质的干扰,获得清晰的双向电泳凝胶图。 本实验发现三氯乙酸-丙酮法最适合福建柏叶片蛋白质提取。

3.2 不同IPG胶条与分离胶浓度对双向电泳的影响

相同物种或组织的蛋白在不同IPG胶条中的分离有明显的差异。根据需要研究的目标进行筛选,在实验中发现福建柏叶片的蛋白质大多集中在酸性端至中性端。因此选用窄范围的IPG胶条可以提升分辨率,对于等电点差异不大的蛋白有较好的分离能力。对于未知蛋白的样品,建议采用宽范围pH3~10的IPG胶条进行初选,根据蛋白的分布情况选择最佳pH范围的胶条。对于极端窄范围的蛋白质可以选用1个pH范围的胶条进行分离。OGURI et al[12]用7种1个pH单位的窄范围IPG胶条对蛋白样品进行分离,结果比用pH3~10胶条分离蛋白高出7倍。胡敏等[13]在对梨叶片总蛋白分离是,采用17 cm的胶条比7 cm胶条多分离出900多个蛋白。不同分离胶浓度对蛋白质的迁移速率有直接影响。蛋白质由于带电荷数以及结构、 质量的不同在SDS-PAGE凝胶电泳中的迁移率不同,应根据样品的实际情况选择合适的分离胶浓度。王显生等[14]利用不同浓度分离胶成功分离了大豆中α′、 α和β三个难分离的亚基。郑亚军等[15]在对椰子蛋白进行研究时设置了5个梯度的分离胶浓度,结果发现当分离胶浓度为11.5%时分离效果最好。

3.3 等电聚焦的影响

等电聚焦中,蛋白样品的迁移与等电聚焦的参数设定有直接的关系,不恰当的等电聚焦会引起电泳图谱出现横条纹或纵条纹、 拖尾等,影响图像的分辨[18]。样品中有盐分的干扰,聚焦前需要先用低电压进行除盐。设置等电聚焦参数是要注意样品中蛋白是否都能达到预设的等电点。如果达不到等电点易引起水平方向的横条纹,或过度聚焦会造成电内渗,蛋白质沉降以及漂移等,影响实验结果。如本研究中的设置25 000 Vh的聚焦强度电泳的效果最好,而30 000 Vh则引起很多蛋白的丢失 。电泳程序的选择也非常重要,目前多用恒压、 恒流或恒功率。本研究选择恒压,发现恒压效果较好,而恒流电泳图谱模糊,这可能是由电流太小、 电泳时间过长引起的。

4 结论

结果表明不同蛋白质提取方法、 IPG胶条pH范围、 等点聚焦参数设置、 凝胶浓度均会对福建柏蛋白质双向电泳结果产生影响,采用三氯乙酸-丙酮法提取福建柏叶片的蛋白样品最适合双向电泳,pH4~7的IPG胶条最适合福建柏叶片蛋白的分离,等电聚焦参数设定为25 000 Vh,浓度为10%的分离胶进行福建柏双向电泳较好。

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