鳄梨(Persea americana Mill.)又称油梨，属樟科(Lauraceae)鳄梨属(Persea)常绿乔木，原产墨西哥中部及西印度群岛，早在20世纪80年代就引种到澳大利亚、南非、以色列及美国，是热带、亚热带地区重要经济果树^[1]，中国广东、福建、台湾、海南、广西、云南及四川等地均有少量引种栽培^[1-2]。鳄梨果实富含多种蛋白质、碳水化合物、维生素、矿质元素等^[3]，且不饱和脂肪酸含量高达80%，为高能低糖水果，其β-谷甾醇具有降低胆固醇及血脂，保护心血管和肝脏系统等重要生理功能，深受消费者青睐^[4]。鳄梨繁殖方法主要采取实生法、嫁接法和高压法^[5-6]，存在繁殖系数低，不能满足市场对种苗需求的问题。国外研究人员利用不成熟合子胚^[1] 、胚珠^[7]通过体细胞胚诱导植株再生，虽然再生率可以达到58.3%^[1]，但所需时间久，同时受到取材的限制。文中以优质鳄梨带腋芽茎段为外植体，利用不含有激素的木本植物用培养基(woody plant medium，WPM)作为基本培养基建立无菌株系，后转接到含有不同浓度植物生长调节剂6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)；萘乙酸(1-Naphthylacetic acid，NAA)和天然植物细胞分裂素——玉米素(zeatin，ZT)的WPM培养中诱导潜伏芽萌发丛生芽继代增殖和生根，从而获得大量整齐一致的健壮鳄梨植株对于生产应用具有重要意义。

试验材料取自福建农林大学园艺学院实践基地，2014年11月，从生长健壮无病虫害鳄梨植株上选取饱满带腋芽茎段作为外植体。

将鳄梨枝条剪成长2-3 cm带腋芽茎段，用饱和漂白粉上清液漂洗10 min，并用软毛刷清洗茎段表层垢，置自来水下滴冲1 h，双蒸水冲荡2-3次，在超净工作台内，用75%酒精消毒30 s，0.1%HgCl₂溶液消毒10-13 min，无菌水冲洗3-4次，用消毒滤纸吸干材料表面水分，用手术刀将茎段两端接触HgCl₂溶液的组织切除，切除后的茎段基部向下插入无激素WPM培养基中培养，4-5 d后转移到含有不同激素浓度的WPM培养基中诱导无菌株系，对于3种激素(6-BA，NAA和ZT)的各3种不同浓度采用全因素试验设计(表 1)，共27组。每一种培养基接种带腋芽茎段50个，每隔1周观察污染情况和记录腋芽发芽状况，30 d后记录发芽个数，并算出各处理培养基下茎段腋芽出芽率。

诱导无菌苗达2-3 cm时，切下1-2 cm茎段接种于诱导潜伏芽培养基上(表 2)。每种培养基配方接种芽苗20个，每隔1周观察其污染情况并记录生长变化过程，50 d后记录诱导潜伏芽萌发的无菌株数，并计算出每种培养基配方下无菌株系潜伏芽的诱导率。

将诱导产生高约1.5-2.0 cm的植株从瓶中取出，切去黄叶片和基部褐化部分，转接到含有不同激素浓度的WPM培养基中进行增殖培养(表 3)，每种培养基10瓶，每瓶接种3个芽，每隔1周观察其污染情况并记录增殖培养过程中丛生芽增殖状况，50 d后记录增加的芽个数，计算每种培养基的增殖倍数。

当丛生芽长至1.5-3.0 cm，2-3片叶时，将无根单个植株切下，接入不同的生根培养基中(表 4)诱导生根。每种培养基接种50株，每隔1周观察其污染情况并记录生根状况，50 d后记录生根株数及每株生根数，并计算各生根培养基中幼苗的生根率及平均生根数。

以WPM 、1/2WPM为基本培养基，根据试验的不同目的和培养阶段，添加不同种类和浓度的植物激素[6-BA 、ZT 、NAA 、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IBA)]，所有的培养基均加有2%蔗糖、0.65%琼脂、0.1%活性炭，pH=5.8。培养条件为：温度(23±2)℃，光照强度1 500-2 000 lx，光照时数12 h · d^-1。

当培养苗根系长至2-3条，根长2-3 cm时，将培养瓶苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，瓶口不打开培养7 d，打开瓶盖培养2 d。将培养苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，定植在园土:泥碳:珍珠岩=6 : 3 : 1(V : V : V)的基质中，定植60 d后统计存活率。

剪切鳄梨带腋芽茎段时会分泌乳白色汁液，该汁液会抑制茎段腋芽的萌发，因此先将茎段接种到无激素无活性碳的WPM培养基上培养4-5 d后(图 1A)，转接到腋芽诱导培养基中诱导腋芽萌发，1周后腋芽开始萌动膨大，基部有褐色酚类物质产生，25 d后长出小叶(图 1B)，50 d左右长成具4-5片叶的芽体。

	图 1 无菌体系建立 Fig. 1 Establishment of sterile strains 注：A.接种5 d后的茎段；B.接种25 d后的茎段。 Note:A. stem section after inoculation for 5 d; B. stem section after inoculation for 25 d.
图选项

试验所用的27种培养基均能诱导腋芽萌发，其中A18培养基(WPM+1.0 mg · L^-16-BA+0.3 mg · L^-1NAA+0.5 mg · L^-1ZT+2%蔗糖+0.2%活性炭+0.65%琼脂)出芽率最高，可达54%(表 5)。当6-BA和NAA浓度一定时，茎段的出芽率随着ZT浓度的升高而增加，说明ZT浓度在0.1-0.5 mg · L^-1范围内对茎段腋芽的萌发具有促进作用；当6-BA和ZT浓度一定时，茎段的出芽率随着NAA浓度的升高而增加，说明NAA浓度在0.1-0.3 mg · L^-1范围内对茎段腋芽的萌发具有促进作用；当NAA和ZT浓度一定时，出芽率随着6-BA浓度的升高先增加后下降，说明低浓度6-BA对茎段腋芽的萌发具有促进作用，高浓度6-BA则会抑制腋芽的萌发，且高浓度6-BA会导致玻璃化苗的出现，使诱导出来的无菌芽体死亡。

将诱导产生的无菌苗接种在诱导潜伏芽培养基上，1周后芽体基部开始萌动膨大，25 d后长出小芽(图 2A)，50 d左右长成具3-5片叶的芽体(图 2B)。

	图 2 潜伏芽诱导 Fig. 2 Germination of latent buds 注：A.25 d后长出小芽；B.50 d左右长成具3-5片叶的芽体。 Note:A. growth situation of later buds after 25 d; B. growth situation of later buds after 50 d.
图选项

潜伏芽着生于枝芽基部皮层内，一般情况下不萌发，但受到外源激素刺激后可能萌发。不同配比激素浓度的培养基均能诱导潜伏芽的萌发，其中B17培养基(WPM+2.0 mg · L^-16-BA+0.5 mg · L^-1NAA+1.0 mg · L^-1ZT+2%蔗糖+0.1%活性炭+0.65%琼脂)诱导率最高，达65%(表 6)。当6-BA和NAA浓度一定时，潜伏芽诱导率随着ZT浓度升高而先增加后下降，说明ZT对潜伏芽诱导具有促进作用，但不宜过高，过高则抑制潜伏芽诱导；当6-BA和ZT浓度一定时，茎段出芽率随着NAA浓度升高而增加，说明NAA浓度在0.1-0.5 mg · L^-1范围内对于茎段腋芽萌发具有促进作用；当NAA和ZT浓度一定时，诱导率随着6-BA浓度升高先增加后下降，说明适宜浓度6-BA对潜伏芽诱导具有促进作用，但浓度越高，对潜伏芽诱导越不利。

培养基中添加不同浓度激素对鳄梨丛生芽的继代增值均有促进作用，C11培养基(WPM+3.0 mg · L^-16-BA+0.3 mg · L^-1NAA+1.0 mg · L^-1ZT+2%蔗糖+0.1%活性炭+0.65%琼脂)的效果最为显著，且增殖苗健壮(图 3)，增殖倍数达3.70(表 7)。当6-BA浓度一定时，丛生芽增值倍数随着NAA浓度由0.1增加到0.3 mg · L^-1而增加，当NAA浓度为0.4 mg · L^-1时增殖倍数反而下降，说明NAA浓度在0.1-0.3 mg · L^-1范围内对鳄梨丛生芽增值具有促进作用。当NAA浓度一定时，丛生芽增值倍数随着6-BA浓度升高先增加后下降，说明丛生芽增值培养基中，6-BA浓度不宜过高，过高会抑制其增殖。

	图 3 C11培养基中不定芽增殖培养 Fig. 3 Adventitious bud proliferation on C11 culture medium 注：A.不定芽增殖；B.增殖苗的生长。 Note:A. adventitious bud multiplication; B. the growth of seedings.
图选项

将增殖培养获得高约3.0-4.0 cm丛生芽分割成单个植株接入不同的生根培养基诱导生根。不同浓度IBA与NAA配比都能够使无根植株生根，D9培养基(1/2WPM+0.5 mg · L^-1IBA+0.5 mg · L^-1NAA+2%蔗糖+0.2%活性炭+0.65%琼脂)的生根率最高，达到90%，平均生根数为3.4条(图 4A)，移栽60 d后成活率达到96%。植株在温室中生长正常，叶片逐渐舒展(图 4B)。

	图 4 生根与移栽 Fig. 4 Rooting and transplanting 注：A.生根诱导；B.瓶苗移栽。 Note:A. rooting induction; B. transplanting.
图选项

当NAA浓度一定时，生根率随着IBA浓度升高先增大后减小，说明在鳄梨幼苗生根培养基当中，IBA浓度不宜过高，这与梁日高^[8]观点一致。当IBA浓度一定时，生根率随着NAA浓度升高而增大，说明NAA浓度在0.1-0.3 mg · L^-1范围内对鳄梨生根具有促进作用(表 8)。

外植体的选择在鳄梨组培快繁技术中起着关键性作用。在外植体积累了充分的营养物质时，再生植株才能保持良好的遗传性，杨增海^[9]曾利用果实作为外植体，经过愈伤组织培养并诱导成苗。PLIEGO-ALFARO et al^[10]及MÁRQUEZ-MARTÍ et al^[11]利用未成熟果实的胚进行离体培养，通过愈伤组织途径诱导新植株，诱导率达到30%。选择茎段作为外植体更具优点，因其未经愈伤组织可利用腋芽诱导植株再生，具有遗传性状稳定特点^{[8, 12]}，且发育良好的腋芽具有足够营养给予芽体良好的生长^[13]。

鳄梨带腋芽茎段经剪切后会分泌乳白色汁液，抑制茎段腋芽的萌发，试验中先将茎段接种到无激素WPM培养基培养4-5 d，待茎段不再分泌乳白色汁液后再转移到含激素的诱导培养基中。梁日高^[8]利用带节茎段作为外植体进行诱导，接种10 d芽即启动生长，生长30 d增殖系数达到7，生长30 d根长可达到2-3 cm，培养效果均优于本研究，但最终成活率低于本研究结果，可能与种质的差异和外植体采集的季节有关，但木本植物能达到报道中的增殖系数确属少见。

防止材料褐变是木本植物成功获得植株的关键，褐变主要原因是材料伤口分泌出酚类化合物，在多酚氧化酶作用下转变成醌类物质引起的^[14]。每升培养基添加1 g活性炭对于茎段腋芽诱导和幼苗生根生长具有不可或缺的作用，可防止材料出现褐化，还有助于根系培养^[15]。试验中添加了0.1%活性炭，一定程度上降低了材料褐变现象。

试验选用优质鳄梨突变株带腋芽茎段为外植体，通过筛选获得诱导腋芽萌发较适宜培养基配方为WPM+1.0 mg · L^-16-BA+0.3 mg · L^-1NAA+0.5 mg · L^-1ZT+2%蔗糖+0.2%活性炭+0.65%琼脂；诱导潜伏芽萌发较适宜培养基配方为WPM+2.0 mg · L^-16-BA+0.5 mg · L^-1NAA+1.0 mg · L^-1ZT+2%蔗糖+0.2%活性炭+0.65%琼脂；丛生芽继代增殖培养较适宜培养基为WPM+3.0 mg · L^-16-BA+0.3 mg · L^-1NAA+1.0 mg · L^-1ZT+2%蔗糖+0.2%活性炭＋0.65%琼脂；幼苗生根培养较适宜培养基配方1/2WPM+0.5 mg · L^-1IBA+0.5 mg · L^-NAA ¹+2%蔗糖+0.2%活性炭+0.65%琼脂。在适宜条件下可培养出完整植株，短期内获得大量优质种苗，并且植株能够保持原有高蛋白突变株系的遗传特性，植株健壮，根系发达。本研究的创新点在于针对优质鳄梨种质以带腋芽茎段作为外植体诱导潜伏芽萌发，针对茎段分泌液和褐化严重等问题通过培养技术进行调节，对于不受季节影响的周年采取外植体培养具有重要意义。