文章信息
- 张扬, 叶建仁, 赵阳, 马仕波
- ZHANG Yang, YE Jianren, ZHAO Yang, MA Shibo
- 红绒盖牛肝菌发酵条件及对杨树溃疡病的防治效果
- Fermentation conditions of Xerocomus chrysenteron and its control effect on poplar canker disease
- 森林与环境学报,2016, 36(4): 397-403.
- Journal of Forest and Environment,2016, 36(4): 397-403.
- http://dx.doi.org/10.13324/j.cnki.jfcf.2016.04.003
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文章历史
- 收稿日期: 2015-12-16
- 修回日期: 2016-02-29
2. 江西农业大学林学院, 江西 南昌 330045
2. College of Forestry, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China
外生菌根真菌红绒盖牛肝菌[Xerocomus chrysenteron(Bull.: Fr.)Quél,Xc]是与松属植物根系共生的一种真菌,可与植物形成菌根。研究表明,红绒盖牛肝菌能扩大林木根系的吸收面积和范围,增强元素吸收和利用[1-2],且可分泌多种激素和各类酶来提高寄主植物的抗逆性,对植物有显著的促生长作用[3-6],刘辉等[7]还发现Xc具有较好的溶磷能力,提高林木对不溶磷元素的吸收。研究表明,红绒盖牛肝菌可与大多数杨树形成菌根,以提高对不良环境适应性和抗逆性[8-10]。
杨树溃疡病是一种杨树寄主主导型枝干病害,病原种类繁多,症状多种多样,严重影响杨树长势[11]。如水泡型溃疡病感病品种的杨树幼林发病率高达80%-100%,死亡率可达30%-50%[12]。另外杨树溃疡病发生面积广,地理分布和寄主范围也不断的扩大,已严重障碍了中国杨树人工林的发展[13]。红绒盖牛肝菌对杨树具有显著的促生抗病效应,对幼林的成活率也有显著提高[14-16]。可目前有关红绒盖牛肝菌发酵培养的研究报道较少,未进行工业化生产。文中对Xc发酵条件进行探索,并对该菌株进行了田间防治试验,以期用于生产实践。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株及发酵罐菌株保存于南京林业大学资源与环境学院江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室。液体发酵罐为上海国强公司生产的50 L自动机械搅拌发酵罐。消泡剂采用有机硅消泡剂,型号WX-gs530,生产于苏州百斯盾化工有限公司。
1.1.2 培养基种子培养基(1 L):土豆200 g 、蔗糖20 g 、MgSO4 · 7H2O 1.5 g 、KH2PO4 3 g 、VB1 0.05 g。
发酵培养基(1 L):蔗糖20 g 、玉米粉20 g 、黄豆粉15 g 、酵母膏5 g 、MgSO4 0.5 g 、KH2PO4 1 g。土豆、玉米粉、黄豆粉加水煮沸后过滤,去除滤渣取其汁液。
1.2 方法 1.2.1 种子液的制备将保存的菌种接入PDA固体平板培养基中,于25 ℃培养8 d,待菌丝长满平板,在无菌条件下,用打孔器(d=7 mm)在菌落边缘打成菌饼,再转接装有150 mL液体培养基的250 mL三角瓶中扩繁,每瓶挑取20粒菌饼。置于培养温度30 ℃和培养转速121 r · min-1培养条件下培养至菌丝体旺盛期,用灭菌的匀浆机粉碎,制备成种子液。
1.2.2 取样与在线监测每隔5 h取样,每次取200 mL发酵液离心(5 000×g,20 min),弃上清,收集菌丝体,55 ℃烘干至恒重,用电子天平准确称重。溶解氧、pH值、温度、转速、通气量等参数由发酵罐的探头自动在线监测。
1.2.3 临界溶解氧浓度的测定溶解氧是需氧发酵控制的重要参数,微生物在生长繁殖旺盛时,会呈现耗氧高峰,与之相对应有个溶解氧低谷,若溶解氧低于临界溶解氧浓度,会出现供氧不足,进而影响到真菌细胞正常生长和生物量的积累。测定这段时期的临界溶解氧浓度对整个发酵期的溶解氧控制有决定意义。本试验采用METTLER溶解氧电极动态法测定临界溶解氧浓度[17]。
1.2.4 Xc发酵条件的优化在实验室前期对Xc掌握的生物学特性条件下[18-22],将初始发酵条件设定如下:温度30 ℃,罐压0.05 MPa,装料系数0.5,按发酵体积的0.05%加消泡剂,接种量为4.8%,初始溶解氧80%,流量10 L · M-1,转速保持100 r · min-1,pH值自然,培养时间为150 h。
在初始发酵条件下,设置不同发酵条件的罐批,每批次3个重复,研究不同发酵条件对菌丝生物量的影响程度,找出最适发酵条件。
1.2.5 红绒盖牛肝菌Xc野外防治试验2010年3月,在江苏淮安集沭选择造林地,试验林位于集沭河旁;土壤为沙壤土;气候类型为北温带半湿润季风气候;年平均气温为14.1-14.8 ℃,年平均降水量在906-1 007 mm;日照时间2 136-2 411 h。该林地地势平坦,靠近河流,林下植被稀少。造林地选用1年生NL895杨( P.×euramericana CL “NL895”),该杨树苗来源于杨树溃疡病高发区苗圃。
采用随机区组设计试验,四周设置保护行,设3个重复区,采用灌根法。株行距4 m×8 m,设处理1(Xc菌剂)及处理2(空白对照CK)。将发酵液配制成菌剂,灌于杨树根后覆土,菌剂配比为发酵液:水=1.5 L : 8.5 L,菌液浓度为15%,每棵树用量500 mL。每处理300棵,其它管理按常规方法进行。接种30 d后调查1年生杨树苗溃疡病发病级别,统计杨树死亡率、病情指数及防治效果。分级标准见表 1。
$ 病情指数{\rm{=}}\frac{{\sum {\left({各级病树株数{\rm{ \times }}代表值} \right)} }}{{总树株数{\rm{ \times }}发病最高级代表值}}{\rm{ \times }}100 $ | (1) |
$ 防治效果{\rm{=}}\frac{{对照病情指数-防治后的病情指数}}{{对照病情指数}}{\rm{ \times }}100{\rm{\% }} $ | (2) |
病级Disease stage | 分级标准 The classification standard | 代表值 Central value |
Ⅰ | 健康,无病斑Healthy, no disease spot | 0 |
Ⅱ | 病斑1-25个1-25 disease spots | 1 |
Ⅲ | 病斑26-50个或病斑无扩展26-50 disease spots or no extension | 2 |
Ⅳ | 病斑51-75个或病斑扩展成片51-75 disease spots or extended sheet outward | 3 |
Ⅴ | 整株死亡The whole plant death | 4 |
发酵第19-25 h为耗氧高峰期,临界溶解氧浓度在8%-33%之间。接种后培养22 h耗氧达最高峰,临界溶解氧浓度亦达最大值,为33%,在22 h以后,临界溶解氧浓度明显呈下降趋势(图 1)。
2.2 初始发酵条件的Xc菌丝生物量培养体系中前24 h Xc菌丝生物量增加不明显,菌丝生长处于延滞期,到64 h时,可增至6.5 g · L-1;此后进入稳定期,菌丝体生物量保持稳定,在80-112 h期间,菌体生物量始终保持在7.4 g · L-1左右,其中在96 h时菌体生物量达到最大,为7.8 g · L-1;112 h后,菌丝生物量开始下降,进入衰亡期(图 2)。
试验还发现,溶解氧变化与生物量变化存在一定关系。前24 h菌体由于处于延滞期,生长缓慢,生物量累积速度很慢,基本没有变化,所以耗氧量少,罐内溶解氧高达80%左右;24-56 h细胞进入迅速指数生长期,生长迅速,代谢旺盛,生物量迅速增加,耗氧量大,使罐内溶解氧几乎下降到0;56 h之后进入稳定期,耗氧量变化不大,生物量趋于稳定。
2.3 初始发酵条件Xc培养基中pH值变化在发酵培养过程中,培养基pH值变化较大,范围为4.5-6.5。在56 h内,pH先是随着发酵时间的延长而下降,最低为4.5左右;56 h之后,pH开始逐步上升,最终可升至6.56,发酵环境接近中性。
2.4 不同溶解氧对Xc菌丝生物量的影响罐批2(图 3)与罐批1(图 2)进行比较,其他条件都相同,但罐批2在溶解氧降至0.9%时,通过提高通气量来增加罐内溶解氧,56 h时,罐内溶解氧又降至0.9%,调节通气量可使溶解氧提高到30.4%,第74 h时,溶解氧又降至0.9%,再次调节通气量使溶解氧提高到25.6%。通过调节通气量使罐批2的溶解氧条件明显优于罐批1,使菌体生物量从7.8 g · L-1提高到11.68 g · L-1,生物量要高于罐批1。
另外,罐批2中菌体生长的延滞期短于罐批1,罐批2的发酵终点约在86 h,比罐批1提前了近10 h。罐批2和罐批3(图 4)比较,初始转速均设为100 r · min-1,罐批2当溶解氧降低到零左右,只通过通气量提高罐内溶解氧,虽然溶解氧有所上升,但之后又会降低到零左右。说明提高通气量的措施不能满足此阶段Xc菌体速生长的溶解氧需要。而罐批3通过提高转速和通气量来调节罐内溶解氧,利用溶解氧转速联动,将罐内溶解氧保持在33%,以满足菌丝生长对氧的最低需求。结果表明,罐批2中最大生物量为11.68 g · L-1;罐批3中最大生物量可达至16.80 g · L-1,发酵终点在55-60 h之间。
2.5 不同接种量和pH值对菌丝生物量的影响罐批2 、3 、4的接种量均为7.2%,比罐批1的接种量增加了2.4%,罐批1最大生物量为7.8 g · L-1,明显小于罐批2 、3 、4。结果表明提高接种量可以使菌丝在罐中的延滞期缩短;提高接种量能够明显地增加菌丝生物量,且缩短发酵时间。
保持罐批3的培养条件,在罐批4发酵45 h时,培养基的pH降到5左右时,通过酸碱蠕动泵流加氨水,自动调节pH至5.5,结果表明:罐批4的菌丝体生物量在60 h达到最大,为18.36 g · L-1,生物量比罐批3增加了1.56 g · L-1(图 5)。
3 红绒盖牛肝菌对杨树溃疡病的防治效果调查发现杨树溃疡病野外发病类型共2种,包括不规则黑斑和水泡型(图 6)。防治试验结果表明,施加Xc对杨树的成活率有显著地提高,对溃疡病有显著的防治效果,防治效果达到54.5%(表 2)。
处理 | 调查株数 Investigated plants | 发病株数 Infected plants | 死亡率 Death rate/% | 感病指数 Disease index | 防治效果 Control effect/% |
X. chrysenteron | 300 | 194 | 14.5 | 27.7 | 54.5 |
CK | 300 | 236 | 34.2 | 60.9 | - |
从接种量、溶解氧浓度、通气量、培养基pH值及转速对Xc的发酵条件进行了初探,结果表明这些因素都会对Xc生物量产生影响,通过一系列实验数据得出Xc最适发酵工艺为装料系数0.5,0.05%装料体积的消泡剂,接种量7.2%,发酵温度30 ℃,初始溶解氧浓度80%,初始通气量0 L · M-1,发酵中后期调至10 L · M-1, 初始搅拌转速100 r · min-1,发酵过程中pH保持5.5左右,发酵中后期保持溶解氧浓度在33%左右,发酵周期60 h。将Xc液体发酵产物配制成一定浓度的液体菌剂,采用灌根法对1年生NL-895杨树幼苗溃疡病进行防治试验,田间防治效果可达到54.5%,感病指数显著低于CK。
4.2 讨论杨树溃疡病是杨树枝干重要病害之一,此病害有多种类型,主要由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、疡壳孢属(Dothichiza)、腐皮壳属(Valsa)等真菌引起[23],发展速度快,面积广,特别是杨树幼林发生为害较重,与病原菌生物学特性、杨树栽培、树势衰弱及健康情况密切相关,近年此病害发生较为严重,特别是幼树时期,从而造成造林失败[13]。据报道,在发病严重的地区,林木发病率可达96.1%-100%,感病指数为68.7-95.8[12]。近年来,植物病害生物防治取得长足发展,研究深度和广度也逐年增加,筛选出了一批高效的生防细菌和真菌[23-24]。杨蕾等从土壤中筛选出对杨树溃疡病有高效生物防治效果的拮抗真菌木贼镰刀菌,对杨树离体组织溃疡病防治效果可达76.04%[25],并且对杨树内生菌进行筛选,发现内生真菌黄绿木霉对杨树溃疡病有良好防治效果,防治效果达到76.47%[26],一系列研究表明微生物资源中存在着众多对杨树溃疡病具有防治效果的菌株,这是一种控制杨树溃疡病可行性方法。
外生菌根真菌Xc能改善杨树根系构型,提高杨树的光合作用和细胞酶活性,增强杨树N 、P 、K等营养元素的吸收,在温室试验中发现Xc对杨树溃疡病等病害具有较好防治效果,促进杨树的生长[14-15],研究发现Xc属好氧性微生物,在其发酵过程中供氧不足会抑制菌体的生长代谢,在以收集Xc菌体为目的的深层发酵中,进入指数期后应增加通气量以满足菌体迅速生长的需要,另外转速过高培养基会产生大量的泡沫,影响菌体生长,在提高溶解氧浓度时也相应提高通气量,尽量保持转速不要过高。本试验只是在实验室条件下对发酵条件进行优化,而生防菌制剂的生防作用的发挥与制备工艺、使用方法和菌剂使用时温度、湿度、pH值等环境因素密切相关[27],因此,在红绒盖牛肝菌商业化过程中,要继续加大对其最适发酵工艺的研究,也要加大此菌剂发挥最佳作用条件的研究,另外Xc在杨树根际土壤中定殖情况及其对杨树溃疡病的生防机制、Xc的代谢产物活性成分及Xc相关剂型的开发都是后续研究的重点方向。
杨树造林地溃疡病病害一般在2月底3月初的初春发生,4-5月发病达到高峰期,秋季较少有病斑出现[28]。Xc能有效的防治杨树溃疡病的发生,减少造林损失。杨树溃疡病菌是弱寄生菌,在造林前期,苗木长势较弱,根系在移苗时会有损伤还没有形成健全的吸收体系及移苗过程中造成的根部受损,都会影响树势强弱。任嘉红[29]在江苏省黄码乡进行生防菌株吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对新造林杨树溃疡病的田间防治试验,采取不同浓度菌剂灌根法,试验发现并不是菌剂施用量越高,防治效果就越好,在适当施用量下,JK-SH007对杨树溃疡病的防治效果可达40.54%。在以后的防治试验中,不仅要着重研究本菌株与寄主共生关系建立的机制及其代谢产物的抑病机制,还要注意生防菌株施用量问题。
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