石榴(Punica granatum L.)是石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica)落叶灌木或乔木，原产于巴尔干半岛至伊朗及其邻近地区，全世界的温带和热带地区均有种植。中国的石榴栽培可追溯至汉代，至今已有2 000多年的栽培历史。1986年，突尼斯软籽石榴品种的成功引种，弥补了中国传统硬籽石榴难以下咽的缺陷，适合老年人和儿童食用。在国家林业局 “948”项目推动下，本课题组进行了以色列优异石榴品种的引种工作，先后进行了不同繁殖方式、适应性分析、冬季低温防寒等相关研究工作。

低温是制约中国石榴发展的重要因素之一，突尼斯软籽石榴尽管在中国黄河流域以南地区均可栽培，但越冬冻害依然是制约其丰产的主要因素之一。目前，有关石榴抗寒性的研究相对较少，宋尚伟等^[1]结合组织褐变及相对电导率，对10个品种石榴的抗寒性进行了研究；杨雪梅等^[2]、张艳侠等^[3]依据低温胁迫过程中相对电导率、保护酶活性、膜脂过氧化程度等生理指标的变化，对多个品种石榴进行抗寒性评价。本课题组以8个不同品种石榴1年生枝条为试材，测定不同低温胁迫下膜透性、保护酶活性及渗透调节物质含量的变化，对其抗寒性进行综合性评价，为其在中国的推广应用提供参考依据。

试验材料均采自河南省洛阳市农林科学院石榴基地，供试品种有以色列软籽品种石榴 ‘以色列1号’ (Punica granatum L.‘Israel 1’ ) 、‘ 以色列2号 ’ (P. granatum L.‘Israel 2’ ) 、‘以色列3号’ (P. granatum L.‘Israel 3’ ) 、‘以色列M’(P. granatum L.‘Israel M’ )及 ‘以色列Y’(P. granatum L.‘Israel Y’ )，突尼斯软籽品种石榴 ‘突尼斯’ (P. granatum L.‘Tunisia’ )和 ‘中农红’ (P. granatum L.‘Zhongnonghong’ )，以本地硬籽品种石榴 ‘豫大籽’ (P. granatum L.‘Yudazi’ )为对照(CK)，共计8个品种。其中，以色列软籽品种石榴以 ‘豫大籽’ 的2年生植株进行嫁接繁殖，而突尼斯软籽品种石榴及‘豫大籽’均为2年生的扦插苗。2014年9月中旬，选取各品种生长健壮、无病虫害的1年生枝条(营养枝)，每个品种取10-20条，用湿纱布包好，并迅速带回实验室备用。

将备用枝条用自来水冲洗干净后，再用蒸馏水冲洗，吸水纸吸干水分，剪成10 cm左右小段，自封袋包装后置于4 ℃低温冰箱进行冷冻处理；以-4 ℃ · h^-1的速度降至设定温度(0、-5、-10、-15 ℃)后持续冷冻处理24 h；低温处理结束后，再以同样速度缓慢升温解冻，达到室温时取出，进行相关指标的测定。每个处理枝条3段，3次重复。

处理后的枝条分为2部分。其中，一部分避开芽眼，剪成0.5 cm薄片，混匀后称取0.5 g，放入三角瓶中，加入25 mL去离子水，静置24 h，用DDSJ-308A型电导仪测定溶液初始电导率。用保鲜膜封口三角瓶，置于100 ℃恒温水浴锅中煮30 min，冷却后测定终电导率。另一部分用于其它指标测定。

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法，蒽酮比色法测定叶片内可溶性糖含量，酸性茚三酮法测定脯氨酸含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的测定采用氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)光照化学还原法^[4]。

利用隶属函数法进行抗寒性综合评价^{[5, 6]}。

式中 ： f(x_ij)为i树种的j项指标隶属函数值；X_ij为测定值；X_jmax和X_jmin 分别为j指标最大测定值和最小测定值。与抗寒性负相关的电导率、MDA含量采用公式(1)计算；与抗寒性正相关的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质含量采用公式(2)计算。

试验数据用Excel及SPSS软件进行相关分析和方差分析。

不同品种的石榴经过低温处理后，枝条的相对电导率随处理温度的下降而逐渐升高 ，整体呈“S” 型曲线变化。从4 ℃降至0 ℃时，8个品种石榴中，‘以色列2号’ 、 ‘以色列3号’ 和 ‘以色列Y’ 相对电导率增幅相对较大，均达到50%以上，‘豫大籽’ 增幅最小，仅为22.02%；0 ℃降至-5 ℃时，除 ‘豫大籽’ 相对电导率增幅为37.82%，其余品种增幅较之前(4 ℃至0 ℃)均出现急剧增加，‘以色列Y’ 和 ‘突尼斯’ 的增幅甚至达到90%以上；-5 ℃降至-10 ℃时，仅 ‘豫大籽’ 增幅达到50.08%，其余品种增幅较之前(0 ℃至-5 ℃)均出现明显下降，都小于30%；-10 ℃降至-15 ℃时，各品种增幅均在20%以下。

随处理温度的下降，不同品种石榴枝条内MDA含量呈先降后升的变化规律(表 2)。MDA含量前期的下降可能是低温处理初期，石榴自我保护调节的结果，而后其含量逐渐增加与低温胁迫持续增强有关。从4 ℃降至0 ℃时，各品种石榴MDA含量均略有下降，其中以 ‘豫大籽’ 降幅最大，表明其通过自身调节抵御低温胁迫的能力相对较强；从0 ℃降至-5 ℃时，‘豫大籽’ 升幅最小，由此证明此阶段的低温对其影响相对较小；至-15 ℃时，与0 ℃时相比，8个品种石榴中，‘豫大籽’ 、 ‘以色列3号’ 和 ‘突尼斯’ 增幅最小，其余增幅均达到2倍以上，表明这3个品种受低温伤害的程度相对较低。

从表 3中可以看出，低温胁迫下不同品种石榴枝条内脯氨酸含量整体呈先升后降的变化规律。由此表明，不同品种石榴通过体内脯氨酸含量的增加应对低温胁迫，而后期其含量下降可能与过度胁迫有关。 ‘豫大籽’ 脯氨酸含量峰值出现在-10 ℃，其余品种均出现在-5 ℃，表明与其他品种相比，‘豫大籽’ 通过保持较高的脯氨酸含量从而应对更低的温度胁迫。与4 ℃相比，‘豫大籽’ 、 ‘以色列3号’ 和 ‘突尼斯’ 的峰值增加量相对较大。至-15 ℃时，‘豫大籽’ 脯氨酸含量最高，‘以色列Y’ 最小。

随着处理温度的降低，不同品种石榴可溶性糖含量呈现出与脯氨酸含量类似的变化趋势(表 4)，且除 ‘豫大籽’ 可溶性糖含量峰值出现在-10 ℃外，其余品种均出现在-5 ℃。由此表明，可溶性糖作为渗透调节物质参与了石榴的抗寒过程。其中，与4 ℃处理时相比，以 ‘豫大籽’ 峰值增加量最大，达到3.81倍，以 ‘以色列Y’ 最小，仅为1.77倍。至-15 ℃时，‘豫大籽’ 可溶性糖含量最大，且远高于其它几个品种。后期可溶性糖含量的降低，可能与低温胁迫超过了石榴的承受范围相关。

低温处理过程中，可溶性蛋白质含量同样呈先升后降的变化(表 5)。 8个品种石榴可溶性蛋白质含量峰值均出现在-5 ℃，与4 ℃时相比，以 ‘豫大籽’ 增加量最大 ，‘以色列Y’ 增加量最小。至-15 ℃时，‘豫大籽’ 可溶性蛋白质含量最高，与峰值相比，其降低量也最小，由此表明设置的低温胁迫对 ‘豫大籽’ 的影响相对较小。

从表 6可看出，随着处理温度的下降，不同品种石榴枝条内SOD活性整体均呈先升后降的变化。前期的上升是植物自我保护的应激反应，而后期的下降可能与低温的过渡胁迫有关。 ‘豫大籽’ SOD活性峰值出现在-10 ℃，而其余品种均出现在-5 ℃。与4 ℃时相比，以 ‘豫大籽’ 、 ‘以色列3号’ 和 ‘突尼斯’ 峰值的增加量最大，以 ‘以色列Y’ 增加量最小。至-15 ℃时，‘突尼斯’ 较峰值降低量最小，且SOD活性远高于其它品种，由此表明其对低温胁迫的适应能力相对较强。

植物的抗寒性是多指标综合作用的结果，因此应利用多个指标进行综合评价，而避免采用不具代表性的单一指标评价方式。结合模糊隶属函数法，综合各项指标用平均隶属度对8个品种石榴的抗寒性进行综合评价。运用公式(1)、(2)求出不同品种石榴各指标参数的隶属函数值，再乘以各指标权重后求取平均值得到综合评价值，该值越大，抗寒性越强，反之抗寒能力越弱。结果表明(表 7)，以 ‘豫大籽’ 综合评价值最大，‘以色列Y’ 最小。几个品种石榴的抗寒性强弱的排序为 ：‘豫大籽’ > ‘以色列3号’ > ‘突尼斯’ > ‘以色列1号’ > ‘以色列2号’ > ‘中农红’ > ‘以色列M’ > ‘以色列Y’ 。

细胞膜作为植物细胞与环境进行物质交换、信息传递以及能量交换的重要场所和媒介，它是植物细胞感受外界环境胁迫最为敏感的部位，也是低温伤害的原初部位^[7]。研究证明，生物膜与植物寒害及抗寒性之间存在密切的关系^[8-9]。诸多研究已证明，不同梯度低温的胁迫过程中，随着温度的降低，植物电导率呈持续上升的变化^{[10, 11, 12]}。试验结果表明，随着处理温度的下降，8个品种石榴枝条的相对电导率呈 “S” 型曲线上升，这与前人的研究结果^{[2, 3]}一致。4 ℃至-5 ℃，8个品种石榴中均以 ‘豫大籽’ 相对电导率增幅最小。另外，至-10 ℃时，其相对电导率才达到55.35%，而其它品种相对电导率均在-5 ℃时超过50%。由此表明，设置的低温胁迫对 ‘豫大籽’ 的影响程度相对小于其它品种。

当遭受到低温等逆境胁迫时，植物体内自由基的产生与消除平衡就会遭到破坏，通过Haber-Weiss反应产生大量的活性和毒性极高的-OH，侵害细胞内大部分的生物大分子^[13]。另外，积累的自由基还会引发膜脂发生过氧化，从而对细胞膜系统造成伤害^[14-15]。MDA作为脂过氧化的主要产物质之一，因此，其含量的高低可以反映植物遭受逆境伤害的程度^[16]。低温胁迫下8个品种石榴的MDA含量变化呈先降后升的变化，与杨雪梅等^[2]、张艳侠等^[3]的研究略有不同。前期MDA含量的下降可能与低温胁迫初期石榴树自身调节相关，而之后的上升则是低温持续胁迫的结果。而这种变化与郑国华等^[17]对枇杷、周建等^[18]对广玉兰的研究结果一致。

当植物遭受低温等逆境胁迫时，细胞通过渗透调节以维持其内外的渗透平衡，从而达到提高植物抗逆性，避免伤害的发生。诸多研究已表明，脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白质参与了调控抗寒能力的形成^[19,20]。低温胁迫过程中，8个品种石榴的脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白质含量均呈先升后降的变化，前期的上升表明石榴树通过渗透调节物质含量的增加来提高其自身的抗寒能力，随着胁迫温度的持续降低，3个指标又出现下降变化，这可能与胁迫温度超过石榴树的承受范围，造成其调节能力下降有关。这与杨雪梅等^[2]、冯献宾等^[21]的研究结果一致。与其它7个品种的脯氨酸和可溶性糖含量峰值均出现在-5 ℃不同，而 ‘豫大籽’ 2个指标的峰值出现相对较晚，均在-10 ℃，且在-15 ℃时依然保持在较高含量水平。由此表明，相同的低温胁迫下，与其它品种相比，‘豫大籽’ 通过增加渗透调节物质含量以适应胁迫的能力更强。

植物体内的保护酶系统的存在，使其体内活性氧的产生与清除处于动态平衡。SOD作为植物细胞内最重要的清除活性氧的酶之一，其活性的高低直接反映了活性氧的清除能力大小，与植物的抗逆性关系密切^[22]。强度的逆境胁迫下，酶活性一般随胁迫的增加而增加，或者呈现增加后降低的变化^[23]。本研究中，低温胁迫过程中，不同品种石榴SOD活性均呈先升后降的变化，前期的上升与其自身调节以抵御低温胁迫有关，而后期的下降则可能是胁迫低温达到了其承受的临界温度，导致SOD活性出现钝化的结果，这也与杨雪梅等^[2]、段肖翠等^[24]、令凡等^[25]研究结果一致。8个品种石榴中，仅有 ‘豫大籽’ SOD峰值出现在-10 ℃，晚于其他品种，且在-15 ℃时依然保持在明显高于其他品种的水平。由此说明，‘豫大籽’ 通过增加体内SOD活性清除低温造成的活性氧能力较其它品种强。

植物的抗逆性是受多因素影响的复杂的数量性状，因此利用单一指标进行植物抗逆性的评价具有较大的片面性，多个指标结合并根据其各自贡献率的大小进行综合评价才能真实的反映植物的抗逆性^[26-27]。结合主成分分析，利用隶属函数加权法对植物抗寒性进行综合评价已得到广泛的应用^[28-29]。本课题组运用同样的方法，结合不同低温胁迫中相对电导率、MDA、SOD、可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸6个抗寒相关指标，综合评价8个品种石榴抗寒新强弱顺序为 ‘豫大籽’ > ‘以色列3号’ > ‘突尼斯’ > ‘以色列1号’ > ‘以色列2号’ > ‘中农红’ > ‘以色列M’ > ‘以色列Y’ 。