2. 上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心,上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心,上海 201306
青鱼(Mylopharyngodon piceus),是我国四大家鱼中唯一的肉食性鱼类,也是我国养殖较为广泛的鱼类之一[1-3]。2021年我国青鱼养殖产量约71.66万t,相比2020年产量增长了3.17%[4]。青鱼具有体型大、肉质鲜美等特点,市场需求较高,常用于鱼干腌制[5],同时也被引进到美国等地用于河道治理[6]。作为我国的重要养殖物种,在过去的几十年受全球气候变化、生态环境破坏等因素的影响,天然水域的优良种质资源逐渐减少[7]。而在青鱼养殖业中也存在许多问题,如在育苗过程中忽视对种质资源的管理,使用来源不明、遗传背景不明确的青鱼作为亲本,近亲交配及品种混杂等,这些问题最终导致了生长速度减慢、抗逆性降低、个体变小等种质资源退化现象,严重影响了我国青鱼养殖业的发展[8]。因此,为实现青鱼养殖业的健康、稳定和可持续发展,一个有效的方法就是采用遗传学手段,发掘与优良性状相关的分子标记,找出优势基因型来构建优良群体或家系,从而实现对青鱼的遗传改良[8]。但目前,鲜有关于青鱼遗传育种的报道。
先前的研究中我们对邗江、湘江和石首群体进行了养殖实验[9],比较了3个不同地理群体生长差异性,但该结果只是从表型上评估出了3个群体的生长性能差异,其分子组成方面的差异尚不清楚。之后,我们对青鱼的生长相关性状进行了QTL定位[10],在QTL区间中开发出2个与体质量相关的SNP,由于QTL定位的结果是基于特定的家系产生,尚不明确所定位到的QTL区间及开发出的相关分子标记是否适用于其他家系或群体。
本研究以石首、邗江和湘江青鱼为实验材料, 利用先前研究[10]所开发出的与体质量相关的SNP及序列片段,结合通过3个群体的养殖实验得到的结果[9],采用基因型分析、遗传多样性和中性检验等方法, 目的是为了验证通过QTL定位得到的体质量和体长相关SNP标记是否存在并能应用于其他群体,从遗传和群体动态角度阐述了邗江群体具有育种价值的分子基础并分析了先前养殖实验中不同地理群体的青鱼存在生长差异的原因,为今后青鱼的良种选育提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料青鱼实验群体分别取自湖北石首、江苏邗江和湖南湘江的国家四大家鱼原种场,每个地理群体样本数量为30,位置信息如(表 1),取鳍条置于无水乙醇,保存在-20 ℃冰箱备用。
参照YUE等[11]用96孔过滤板提取DNA的方法。剪取大小相同的鳍条组织,置于1.5 mL离心管中,在加入300 μL SET缓冲液和50 mg蛋白酶K (10 mg/μL)后颠倒混匀,简短离心后置于55 ℃的水浴锅中加热3~4 h以充分溶解鳍条样本;向上层96孔过滤板中加入180 μL现配的6 mol/L NaI溶液和60 μL溶解后的裂解液,废液由下层的96孔细胞培养板收集,4 ℃ 4 000 r/min离心2 min后弃去废液;向上层过滤板中加入240 μL漂洗缓冲液后4 ℃ 4 000 r/min离心2 min后弃去废液;室温等待2~5 min以晾干过滤板中的酒精;最后加入120 μL的双蒸水(ddH2O)并等待5~15 min以充分溶解DNA;更换下层96孔细胞培养板后4 ℃ 4 000 r/min离心2 min以收集DNA;所提DNA的浓度采用NanoDrop 2000C型分光光度仪检测,最后将所提DNA样本置于-20 ℃保存。
1.3 引物设计选取先前研究[10]体质量QTL区间中的分子标记snp8107和snp9562,利用开发分子标记时包含所有分子标记信息的中间文件,找到SNP在scaffold上的位置并制作用于后续序列提取所需要的bed文件,提取序列的范围为SNP标记的左右300 bp碱基,首先利用软件BWA(v 0.7.17)[12]构建青鱼参考基因组索引,通过bedtools提取出bed文件中要求的序列。软件Primer Premier 5用于引物的设计,要求扩增出的片段包含SNP位点。
1.4 SNP分型鳍条样本在进行DNA提取后,对目标序列进行PCR扩增,引物的详细信息如表 2。通过琼脂糖凝胶电泳检查每个样本扩增出片段的长度和条带的清晰度,检查后交由上海迈浦生物科技有限公司进行Sanger测序,根据测序峰图判断分子标记处的碱基类型。
使用软件Senquencher(v5.4.6)对测序结果进行多序列比对、删除首尾测序错误区域,单倍型数h、单倍型多样性Hd及核苷酸多样性Π(Pi)等遗传多样性参数由软件dnasp 5.0完成,中性进化分析(Tajima Test)由软件dnasp 5.0完成。
2 结果 2.1 SNP分型结果及基因型分析所有SNP的突变方式均为转换突变,snp8107位置为A/G,snp9562位置为G/A,将snp8107的AA型和snp9562的GG型统一命名为AA型,snp8107的GG型和snp9562的AA型统一命名为BB型,snp8107的AG型和snp9562的GA型统一命名为AB型。2个SNP在不同群体中的基因频率和基因型频率如表 3。邗江群体的等位基因A(A基因型)的频率最高,达到95%,等位基因G(B基因型)的基因频率最低,为5%。
dnasp5、Cervus用于遗传多样性分析和多态性分析,结果见表 4和表 5,邗江snp8107侧翼序列片段的单倍型数量最多,核苷酸多样性达到0.003 29;湘江snp8107侧翼序列片段的单倍型数量最少,核苷酸多样性为0.001 60。检测到snp9562侧翼序列片段在3个群体中具有相同的单倍型数,但湘江群体的核苷酸多样性最高,达到0.003 30,邗江群体最低,核苷酸多样性为0.001 32。对3个群体的2个SNP位点进行多态性分析,结果显示在3个不同群体中,snp9562位点的多态信息含量(polymorphic information content, PIC)高于snp8107位点,snp9562位点的预期杂合度(expected heterozygosity, He)高于snp8107位点。在观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)方面除湘江群体外,其他两个群体的snp9562位点的观测杂合度均高于snp8107位点。
分别将石首、湘江和邗江的snp8107、snp9562位点侧翼序列片段整合,Tajima Test、Fu and Li’s D & F test采用软件dnasp 5.0进行,结果如表 6,其中snp8107和snp9562侧翼序列片段的D值显著偏离0。
部分基因型与生长数据的关联分析见表 7~10(石首生长数据缺失),湘江群体在snp8107处检测到AA、AG两种单倍型,在snp9562处检测到AA、GG两种单倍型,其中snp8107的AG型和snp9562的AA型在体质量和体长的平均值上呈现优势(表 7);邗江群体在snp8107处检测到AA、AG两种单倍型,在snp9562处检测到GG、GA两种单倍型(表 8)。湘江群体snp8107和snp9562组合成的二倍型D3(AGAA)在体质量和体长上存在优势,邗江群体中二倍型D1(AAGA)与D3(AGGA)在体质量和体长平均值上差异显著(P<0.05),见表 10。
从基因或基因组与性状的关系中获得的标记是目前选择育种工作中的重要工具,受QTL作图区间大小和环境因素的影响,可能会导致对QTL效应评估发生偏离,使得在实验群体或家系中定位到的QTL可能不适用于另一个家系或者群体。因此想要成功应用到分子标记辅助育种(MAS)当中,就必须对定位到的QTL进行验证。目前,水产上已有很多关于对QTL定位结果验证的报道,余成晨等[13]利用4个侧翼微卫星标记对前期在草鱼1号连锁群中发现的与生长性状相关的QTL进行了验证,分别在雌鱼和雄鱼中发现了与体质量和体长相关的优势基因型。韦国建等[14]利用马氏珠母贝(Pinctada martensii) QTL区间中的2个与生长性状相关SNP位点,对2个不同养殖群体进行了关联分析,验证了QTL定位结果。本研究在前期高密度遗传连锁图谱和QTL分析获得的SNP位点的基础上,对不同地理群体是否同样存在并能应用该SNP进行初步验证,发现在不同地理群体中均可使用先前所开发出的分子标记,并可利用表型与不同基因型间的多重比较来估计不同地理群体的优势基因型。但限于样本数量,一些低频的等位基因未被检测到。因此,今后的研究中应首先扩大实验群体数量,尽可能检测出所有基因型,从而提高优势基因型的准确性。总之,本研究结果说明先前所开发的分子标记并不是特定地理条件下某个家系或群体所特有的,可能是普遍存在的,这也将为今后在不同水系的扩展群体中进一步验证及应用提供参考。
生物在不同水平上所体现出的遗传多样性本质上是由遗传物质产生的可遗传变异逐渐积累所致。遗传多样性具有多方面、多层次的表现形式,但不同物种的基因库和遗传组织形式往往有所不同,因此,遗传多样性的本质实际上就是DNA的多样性。遗传多样性是漫长进化的产物,也是生物生存适应和发展进化的前提。一个物种的遗传多样性越高或越丰富,越容易产生适应环境的突变,这也代表着该物种对环境的适应性越强,越容易适应新的环境和扩展种群范围。有研究[15]表明,物种进化的速率越快其产生的遗传变异就越多,因此,这也有助于对研究物种的进化和未来命运提供参考。目前,在鱼类的遗传多样性研究方面,常用的手段之一是利用在线粒体D-Loop区基因序列中检测出的SSR或SNP变异位点,通过计算等位基因数(allele number)、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量等指标的大小,完成对群体进行遗传多样性检测和种群结构的分析[16-17],如鲢鱼[18]、黄姑鱼(Nibea albiflora)[19]、草鱼[20]等。谢启明等[21],利用SNP标记对5个鳜鱼养殖群体的线粒体D-loop区进行了遗传多样性分析,发现5个群体可能经历过瓶颈事件,养殖群体的单倍型多样性与核苷酸多样性有较多的流失。纪达等[22],采用线粒体D-loop区基因结合Cyt b基因测序分析方法,对贵州省5个地理种群金背鲤(Cyprinus carpio var.Jinbei)进行了遗传多样性与遗传结构分析,发现贵州金背鲤的总体遗传多样性适中,中性检验结果表明群体在历史上未出现种群扩张。王丰等[23]利用微卫星标记对包含邗江群体在内的4个野生群体和1个吴江养殖群体进行遗传多样性分析,结果显示邗江群体遗传多样性最高,吴江养殖群体遗传多样性最低。本研究对3个群体的遗传多样性分析结果显示:在包含体质量性状效应最高的分子标记snp8107的序列片段中,邗江群体较其他2个群体呈现出较高的遗传多样性,石首群体次之,湘江群体最少,表明邗江群体已在体质量方面对环境产生了适应性变异,因此具有良好的育种潜力,苏玉红等[9]通过养殖实验测量初始时体质量和终止时体质量对邗江、石首、湘江3个群体进行了比较分析,通过比较增重率及特定增重率等参数,同样得到了邗江群体可在育种实验中作为重要的选育群体的结果,本研究的结果可作为对先前研究的进一步佐证。
中性进化学说在分子水平上阐明了生物的进化机制,强调是生物分子本身随机的自由组合,分子进化的方向同样也与环境和自然选择无关,即没有任何外界的因素来诱导生物进化的方向,进化的方向是完全随机的。水产上常采用线粒体Cyt b等基因序列进行中性检验[24],如杨金权等[25]利用线粒体控制区全序列进行中性检验,估计出长江及其南部邻近水域刀鲚(Coilia nasus)约在0.17~0.13百万年前发生过种群扩张。杨彦平等[26]对长江刀鲚群体进行中性检验后发现长江刀鲚群体积累了较多的低频率突变,佐证了之前的研究。本研究利用SNP侧翼序列对3个群体进行Tajima检测,结果中总体的D值显著大于0,由此可以推断种群间可能存在瓶颈效应或平衡选择,即在世代交替的过程中,种群在经历瓶颈时可能导致稀有等位基因的丢失或发生过中等频率等位基因占主导的平衡选择现象。在3个群体基因型频率和等位基因频率的比较中发现邗江群体和湘江群体中存在缺失或者含量极低的基因型,因此可以推断种群间极有可能发生过瓶颈效应使得稀有等位基因丢失。另外,在遗传多样性比较中,邗江群体总的平均核苷酸差异数要大于其他群体,同时遗传多样性也高于其他群体。因此,可以推测这3个种群在经历瓶颈效应时,邗江群体的稀有等位基因丢失的最少,保留下来的稀有等位基因数量越多,遗传多样性就越高,物种对环境的适应能力就越强,也越容易扩大其生存范围,这也说明了邗江群体蕴含着较大的进化潜力和具备较强的育种及遗传改良的能力。
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