2022,
Vol. 31
2. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306
胰岛素样生长因子2 (insuline-like growth factor 2，IGF2)在细胞增殖、分化、迁移和凋亡等调控过程起着关键性作用[1]，在哺乳动物中，IGF2主要通过磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)途径和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径将信号传递到细胞核内，促使IGF2分泌，发挥细胞增殖等广泛的生物学功能[2]。过表达IGF2后，牦牛(Bos grunniens)胎儿成纤维细胞S期细胞明显增加，采用细胞激光全息技术发现细胞的数量增加了1倍，细胞的厚度明显增加[3]；WANG等[4]研究表明加入IGF2后，分离的大鼠(Rattus norvegicus)脂肪基质细胞ADSCs表现出更高的增殖能力和干细胞相关标志物Nanog、octamer-binding transcription factor 4 和SRY-box transcription factor 2的高表达，并具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的巨大潜力。因此，IGF2具有作为LL促生长因子来促进细胞体外增殖活力的潜力。
三角帆蚌是中国特有的淡水珍珠蚌，其珍珠产量占所有人工养殖淡水珍珠的95%以上[5]。外套膜是贝壳和珍珠矿化中最重要的组织[6]，外套膜细胞的培养具有重要意义，但其在体外培养进程中增殖能力较低，至今没有建立稳定传代的细胞系[7]。鉴于种属差异，利用蚌同源促生长因子促进其细胞体外增殖是解决这一问题的新思路。本实验在前期实验基础上，通过构建pEGFP-IGF2和pET32a-IGF2重组质粒，进行IGF2亚细胞定位、原核表达载体构建，以及重组蛋白在三角帆蚌外套膜细胞体外培养进程中对细胞增殖活性的作用研究，旨在促进贝类细胞体外增殖活力，为下一步建立贝类细胞系提供依据，同时为探究IGF2在贝类生长发育调控过程中的研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料健康的一龄三角帆蚌购自浙江省金华市武义养殖场；DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、Trizol、DNA Marker购自TaKaRa公司(大连)；羊抗鼠IgG(HRP标记)购自北京源畅致和生物科技有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型)、His-tag抗体(小鼠单抗)、DAPI、EcoRⅠ限制性内切酶、BCA试剂盒、4%多聚甲醛购自碧云天生物有限公司(上海)；LipofectamineTM 2000转染试剂盒购自英潍捷基贸易有限公司(上海)；感受态DH5α、BL21 (DE3)购自天根生化科技有限公司；质粒pEGFP-N1和pET32a(+)均由本实验室保存。
1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成按照Trizol法提取总RNA，采用Q6000微量分光光度计(Quawell，USA)检测RNA含量，1%琼脂糖凝胶检测RNA的质量。按照Evo M-MLV反转录预混合试剂盒(Accurate Biology，中国)说明书将总RNA反转录为cDNA，-20 ℃保存。
1.2.2 pEGFP-IGF2、pET32a-IGF2载体构建根据实验室前期基于RACE (rapid amplification of c DNA ends)方法所克隆的三角帆蚌IGF2基因序列, 分别设计带有酶切位点和同源臂的特异性引物(表 1)，交由上海生工生物公司合成。以外套膜cDNA为模板，进行PCR，切胶回收。同时利用EcoRⅠ内切酶对pEGFP-N1在37 ℃条件下酶切2 h，按照无缝克隆试剂盒说明书将胶回收产物和酶切后的质粒进行连接，连接产物转化到DH5α中，热激90 s，摇床上继续培养2 h，涂板后37 ℃培养10~12 h，挑取单菌落，条带大小经验证正确后，随机选取3个菌液送到上海金唯智公司测序。测序无突变后进行扩大培养，重组质粒的提取参照质粒小量抽提试剂盒说明书，同时使用EcoRⅠ酶切重组质粒进行验证。构建pET32a-IGF2载体的方法同上。
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表 1 本实验使用的引物 Tab.1 Primers used in this experiment |
使用LipofectamineTM 2000转染试剂盒将重组质粒pEGFP-IGF2转染到293T中，37 ℃、5%CO2条件下培养48 h；去除培养基，使用缓冲液清洗细胞，重复3次后；加入4%多聚甲醛，固定20 min；去除多聚甲醛，缓冲液重复清洗3次；每孔加入100 μL工作浓度的DAPI染液；避光条件下左右摇床染色15 min；吸出DAPI；缓冲液清洗3次，每次10 min。在荧光显微镜(OLYMPUS DP80)下拍片观察。
1.2.4 IGF2的原核表达和蛋白纯化将测序正确的pET32a-IGF2重组质粒转入到BL21 (DE3)中，37 ℃恒温箱中培养10~12 h，挑取单菌落后，继续培养至OD600为0.4~0.6时，一部分加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，分别在37 ℃条件下诱导3 h，25 ℃条件下诱导3 h，16 ℃条件下诱导5 h，另外一部分未经诱导正常培养。菌液离心，收集下层沉淀；加入适量裂解液进行破碎；离心后，将上清和沉淀收集到EP管中；100 ℃条件下变性5 min后；SDS-PAGE电泳分析蛋白的可溶性以及确定蛋白的诱导条件。蛋白纯化的方法参照His标签蛋白纯化试剂盒说明书。将洗脱后的蛋白进行电泳分析以检测纯化蛋白的质量，最后测定蛋白浓度，-80 ℃保存备用。
1.2.5 Western blot检测将第4次洗脱的蛋白经过SDS-PAGE电泳后，在半干转膜仪(Bio-Rad, USA)上将蛋白转印到PVDF膜上，使用封闭液封闭2 h，TTBS洗涤3次后，加入1∶ 1000的His-tag抗体(小鼠单抗)孵育10 h，洗涤3次后，加入1∶ 1000稀释的二抗继续孵育3 h，清洗3次，每次8 min，最后使用ECL化学发光超敏显色试剂盒显色，拍照并保存图片。
1.2.6 IGF2重组蛋白的生物活性采用CCK8法检测IGF2的生物学活性，CCK8中含有WST-8, 它在电子载体的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可以利用这一特性直接进行细胞增殖分析。参照文献[8]中外套膜游离细胞的获取方法，将三角帆蚌外套膜细胞接种到96孔板中，每孔细胞数量1×105个，每孔加入100 μL培养基(10%蚌自体血清+RPMI 1640基础培养基+1%三抗)进行培养，使其贴壁后，去除培养基，使用含有不同质量浓度纯化蛋白(0、2.5、5.0、7.5、12.5、17.5、22.5 μg/mL；每组设有6个重复)的培养基继续培养，分别在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d时间点每孔加入10 μL CCK8溶液，继续培养2 h，测定450 nm波长下的OD值。
1.2.7 统计与分析所有数据均表示为平均值±标准误，采用SPSS 19.0 (SPSS Inc., USA) 进行统计学分析，多重比较使用Duncan氏法进行分析，显著水平为P < 0.05，极显著水平为P < 0.01，使用SigmaPlot 13.0(SYSTAT，USA)进行绘图。
2 结果与分析 2.1 目的基因的获取和载体构建鉴定以三角帆蚌外套膜组织的cDNA为模板，PCR扩增后电泳结果显示，在目的条带大小处(705 bp)出现单一的特异性条带。通过EcoRⅠ将空质粒酶切后，使用无缝克隆试剂盒将目的片段分别连接到酶切后的质粒上，获得重组质粒，两个重组质粒均通过EcoRⅠ酶切验证和测序是否正确。酶切验证结果见图 1，目的条带大小和载体片段大小均符合预计大小。
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(a)pEGFP-IGF2质粒; (b)pET32a-IGF2质粒; M1. 15 000DNA Marker；M2. 2 000 DNA Marker；1、3. 酶切后条带；2、4. PCR扩增条带。 (a) pEGFP-IGF2 plasmid; (b) pET32a-IGF2 plasmid. M1. 15 000 DNA Marker; M2. 2 000 DNA Marker; 1, 3. bands after enzyme digestion; 2, 4. PCR amplified bands. 图 1 重组质粒酶切验证和PCR扩增 Fig. 1 Validation of recombinant plasmid enzymatic digestion and PCR amplification |
为了分析IGF2蛋白表达后的亚细胞定位分布，将质粒pEGFP-N1和pEGFP-IGF2分别转染到293T细胞中，结果显示，转染pEGFP-N1的细胞中，细胞质和细胞核中均出现绿色荧光，符合预期结果。转染pEGFP-IGF2的细胞中，细胞核和细胞质中也均有绿色荧光，这表明IGF2蛋白在293T细胞的细胞核和细胞质中均表达(图 2)。
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图 2 IGF2在293T细胞中的亚细胞定位 Fig. 2 The subcellular localization of IGF2 in 293T cells |
把构建的重组质粒pET32a-IGF2转入BL21 (DE3)中，经IPTG诱导后，超声波破碎，收集上清液和沉淀，经SDS-PAGE检测结果显示，37 ℃诱导3 h处理组上清液和沉淀在约25 ku处均有1条明显的条带，符合目的条带大小(26.27 ku)。25 ℃诱导3 h处理组、16 ℃诱导5 h处理组以及空白组均未见明显的目的条带(图 3)。
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1. 未诱导菌的上清; 2. 未诱导菌的沉淀; 3. 37 ℃诱导3 h后的上清; 4. 37 ℃诱导3 h后的沉淀; 5. 25 ℃诱导3 h后的上清; 6. 25 ℃诱导3 h后的沉淀; 7. 16 ℃诱导5 h后的上清; 8. 16 ℃诱导5 h后的沉淀. 1. Supernatant of uninduced bacteria; 2. Precipitation of uninduced bacteria; 3. Supernatant after 3 h induction at 37 ℃; 4. Precipitation after 3 h induction at 37 ℃; 5. Supernatant after 3 h induction at 25 ℃; 6. Precipitation after 3 h induction at 25 ℃; 7. Supernatant after 5 h induction at 16 ℃; 8. Precipitation after 5 h induction at 16 ℃. 图 3 IGF2蛋白的可溶性分析 Fig. 3 Soluble analysis of IGF2 protein |
将37 ℃诱导3 h后的破碎上清液使用镍柱过滤，使用50 mmol/L浓度的咪唑进行多次洗脱。结果显示，第2次洗脱后，纯化蛋白的量最多，但是有明显的杂带，第4次洗脱后，蛋白条带单一，但蛋白含量较低(图 4)。
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1、2、3、4、5分别代表第1、2、3、4、5次洗脱。 1, 2, 3, 4, and 5 represent the 1st, 2nd, 3rd, 4th, and 5th elution, respectively. 图 4 IGF2蛋白的SDS-PAGE分析 Fig. 4 SDS-PAGE analysis of IGF2 protein |
pET32a(+)质粒上带有His标签，使用带有抗His的小鼠单抗作为一抗进行Western blot检测，结果显示，在约25 ku处有一条特异性的条带，条带大小与预期的目的条带大小一致，对照组无明显条带(图 5)。
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1. pET-32a (+)空载体对照；2.IGF2蛋白；箭头标记目的条带。 1. pET-32a (+) empty vector control; 2. IGF2 protein; arrows mark the target bands. 图 5 Western blot鉴定 Fig. 5 Western blot identification |
IGF2重组蛋白对三角帆蚌外套膜细胞的促生长效果研究结果表明，与对照组(0 μg/mL添加组)相比，各质量浓度添加组均能有效促进细胞的增殖活性(P＜0.05)，且随着添加质量浓度的增高，增殖活性呈现先上升后缓慢下降的趋势。具体来说，7.5~22.5μg/mL添加组在3~6 d内，均能显著促进细胞增殖活性(P＜0.05)，其中12.5 μg/mL添加组的促增殖活性作用最大，与其他添加组存在显著差异(P＜0.05)，且与对照组相比，能够极显著促进细胞增殖活力(P＜0.01)，质量浓度继续上升，促生长效果下降；2.5 μg/mL添加组在1~4 d内均能促进细胞增殖活性(P＜0.05)，但5~6 d促增殖效果不显著(P＞0.05, 图 6)。
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同一天数的不同字母表示差异显著(P＜0.05)。 Different letters for the same day count indicate significant differences (P < 0.05). 图 6 不同质量浓度IGF2蛋白对三角帆蚌外套膜细胞生长的影响 Fig. 6 Effect of different mass concentrations of IGF2 protein on the growth of mantle cells of the mussel |
IGFs是一种活性蛋白多肽物质，通过自分泌、旁分泌或内分泌的形式来发挥生物学作用[9]。研究[10-11]表明，IGFs参与到了酪氨酸蛋白激酶/转录激活因子(JAK/STAT)信号通路，JAK2能够激活STAT5，激活后的STAT5能够形成二聚化，然后进入到细胞核内，与IGFs的转录调控位点相结合，从而促进IGFs的表达和分泌。亚细胞定位结果显示IGF2在细胞核中表达，表明该蛋白可能参与到转录调控过程，尤其是细胞增殖、凋亡和免疫调节相关的转录过程。IGFs在促进线粒体自噬和减少内质网应激等方面起着保护作用[12-13]。本实验中，IGF2蛋白也在细胞质中表达，表明该蛋白可能参与细胞内多种生物过程。
原核表达系统具有操作简单、成本低廉、需时较短、表达产量高等优点，成为目前最成熟的蛋白表达系统[14]。本文使用pET32a(+)作为原核表达载体，在羧基末端有6个组氨酸残基(6×His)，附着在所表达的蛋白尾部，同时增加重组蛋白的可溶性表达[15]。SDS-PAGE结果显示pET32a-IGF2在DE3中在上清液和包涵体中均有表达，但主要以可溶性的上清液形式存在，满足后续纯化的要求，这可能主要与蛋白的本身特性以及载体有关。本文同时选择了3个温度进行诱导，结果表明37 ℃诱导3 h可溶性比例较高，可能是因为在37 ℃条件下合成蛋白的速度较快，蛋白来不及折叠形成包涵体[16]。蛋白主要以可溶性形式存在，更好地保持了蛋白的活性，为下一步蛋白活性分析奠定基础。
研究[17]表明，人IGF2重组蛋白显著促进了神经干细胞NSPs的增殖和自我更新, 并增加了NSPs中Oct4、Sox1和FABP7 等几种干细胞基因的mRNA表达水平，哲罗鱼(Hucho taimen)IGF2重组蛋白能够有效地刺激虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞和鲤(Cyprinus carpio)上皮细胞的增殖[18]，说明了动物同源原核表达系统获得的IGF2蛋白能有效促进细胞的增殖活力，这与本研究结果一致。曹传平等[19]研究结果表明, 在最低质量浓度为12.5 μg/mL时，人IGF1重组蛋白才能有效促进人乳腺癌细胞的增殖，存在浓度作用效应。本实验结果显示IGF2蛋白在3~4 d时间内，各质量浓度组均起到有效促进细胞增殖的作用，但作用水平存在差异；在5~6 d时间内，质量浓度为2.5 μg/mL的IGF2蛋白对三角帆蚌外套膜细胞的促增殖效果不显著，这可能是因为添加到培养基中的IGF2重组蛋白被消耗殆尽；质量浓度为12.5 μg/mL时促增殖效果最显著，当质量浓度上升到17.5 μg/mL、22.5 μg/mL时，促增殖效果下降，同样存在质量浓度作用效应，这可能与IGF2对细胞同时具有促进生长和诱导凋亡的双重作用有关[20]。本研究为制备抗体，Pull-Down互作验证等后续功能研究奠定了基础。
本研究对IGF2蛋白进行了亚细胞定位、原核表达、活性分析等方面的研究，为进一步研究IGF2在贝类中的生理功能打下了基础，此外，对于突破细胞体外培养的屏障，促进贝类细胞系的建立具有重要的意义。
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