2. 江苏纳克生物工程有限公司, 江苏 淮安 211700
为了提高养殖水体中氮、磷、有机质的去除效率以及降低处理成本[1-2],固定化微生物原位修复技术得到了越来越多的关注[3-4]。与游离微生物不同,固定化微生物具有更高的细胞密度和生物活性[5],更强的抗环境干扰能力,对水质有较好的修复作用[6],并且原位修复可以在较长时间内保持水质稳定,降低了后期尾水处理设施的负担。
然而,选择合适的固定方法、固定载体、微生物菌种对于固定化微生物能否保持自身活性与发挥功能至关重要[7]。固定方法中吸附法方便操作、经济实惠,能最大限度保持微生物活性[8]。同时,凹凸棒土是一种应用广泛,价格低廉的无机固定化载体,具有较大的比表面积和发达的微孔结构,能更有效的吸附微生物[9]。并且已有研究证实,芽孢杆菌能够快速降解和转化养殖环境中的有机物[10]。但目前固定化微生物在处理高浓度有机废水、重金属污染水体等方面应用广泛,在原位处理养殖池塘水体方面可借鉴的实践案例经验相对较少。
因此,采用吸附法将芽孢杆菌固定于凹凸棒土小球,制作成固定化微生物颗粒。在实验室配置模拟养殖尾水,以现场养殖池塘中排放超标率较高的CODMn和氨氮两个污染指标作为研究对象,在实验室小试开展固定化微生物颗粒性能包括颗粒强度、微生物缓释性能、固定化微生物颗粒去除污染物的动力学以及去除效率的主要影响因素进行研究,旨在为凹凸棒土固定化微生物颗粒原位处理养殖池塘尾水并达标排放提供实验支持和理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料固定化微生物菌种来自养殖池塘土著微生物,包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等六类,按照质量等比例混合菌液加入培养基(葡萄糖10 g/L,牛肉浸膏10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化钠5 g/L,pH为7)中浓缩发酵。其中发酵培养基为葡萄糖5 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母粉6 g/L,硫酸铵2.5 g/L,七水硫酸镁0.2 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,磷酸氢二钾1 g/L,乙酸钠0.1 g/L,黄豆粉8 g/L,柠檬酸钠1 g/L,pH 7.0,配制而成;发酵条件控制在6 h内通入无菌空气通风比为1∶ 0.5,12 h内通风比为1∶ 1.5,温度控制于37~37.5 ℃,pH控制于6.8~7.1。微生物涂布所需固体基础培养基(g/L):营养肉汤18 g,蛋白胨15 g,用去离子水配置,pH为7。
将凹凸棒土小球(购自江苏纳克生物工程有限公司)过10目筛,制备成直径2 mm的球状。将混合菌液浓缩发酵后均匀多次(3~5次)喷洒至凹凸棒土小球表面后,阴干24 h待用,凹凸棒土小球与菌液体积比10∶ 1,固定后颗粒负载微生物约20亿/g。
根据《淡水池塘养殖水排放要求》(SC/T 91012007)内规定的淡水受纳水域养殖尾水排放限值,在去离子水中配置模拟养殖废水包含CODMn质量浓度为25 mg/L左右,氨氮质量浓度为6 mg/L左右,TN质量浓度为8 mg/L左右,TP质量浓度为2 mg/L左右,pH调节至7.0~7.3。
1.2 实验方法 1.2.1 固定化微生物颗粒性能测定将固定化微生物颗粒放在装有100 mL去离子水的锥形瓶中,置于200 r/min的摇床中振荡(剪切力约为1.176×10-7 N),记录颗粒破损情况,破损颗粒与最初颗粒比值为破损百分比,破碎速率为破损百分比随时间变化的速率,以此判断颗粒强度。
将固定化微生物颗粒置于装有100 mL去离子水或营养液(含葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾等营养成分,C∶ N∶ P=100∶ 5∶ 1)的锥形瓶中,持续曝气,每天取适量水样进行平板涂布,记录微生物数量,测定微生物缓释性能。
取固定化微生物降解动力学中1、8、16、24 h定容后未过滤水样进行平板涂布测定微生物数量,得出环境条件变化对固定化微生物颗粒缓释性能的影响。
取1 g固定化微生物颗粒加入到体积为100 mL的模拟养殖废水中,控制起始污染物浓度以及曝气时间,进行固定化微生物颗粒降解CODMn和氨氮动力学实验。实验过程中调节气体流量为2 L/min(DO=8.3±0.028 mg/L),溶液温度20 ℃、溶液pH为7。取1、2、4、8、12、16、20、24、28 h样品,将随时间蒸发的水样用去离子水定容至100 mL以固定体积,并用0.45 μm混合纤维素(MCE)过滤,测定溶液中的污染物浓度。
Monod动力学模拟:当水中污染物浓度较低时,微生物降解速率受到基质浓度的限制,可描述为一级动力学反应。
式中:S为污染物质量浓度,mg/L;T为固定化微生物降解时间,h;K为反应速率常数,h-1。
随着污染物浓度的增加,降解速率也逐渐增加,直至稳定在最大降解速率,呈现零级动力学反应模式,这与已有研究结论相似[11]。污染物降解动力学通过拟合Monod模型进行分析,计算模型如式(2)所示。
式中:μ为污染物降解速度,h-1;μmax为污染物的最大比降解速度,h-1;S为污染物质量浓度,mg/L;Ks为饱和常数,mg/L。
1.2.2 固定化微生物降解污染物的影响因素将1 g固定化微生物颗粒加入到100 mL模拟养殖废水中,在温度20 ℃、气体流量2 L/min(DO=8.300±0.028 mg/L)的条件下,调节pH并分别保持在酸性条件(pH=4)、中性条件(pH=7)和碱性条件(pH=9),持续曝气1、4、8、16、18、20、24、28 h,并采集样品。
调节模拟废水的pH为7,温度20 ℃,调节曝气强度,设置气体流量为1 L/min(DO=7.500±0.028 mg/L)、2 L/min(DO=8.300±0.028 mg/L)、3.5 L/min(DO=8.600±0.028 mg/L),其他条件同上,持续曝气1、4、8、16、20、24、28 h,并采集样品。
调节模拟养殖废水中的气体流量为2 L/min(DO=8.300±0.028 mg/L)、温度为20 ℃和pH为7的条件下,改变污染物的初始浓度:分为低、中、高3种水平,CODMn质量浓度分别为10、25和100 mg/L,氨氮质量浓度为2.4、6和24 mg/L,持续曝气1、4、6、8、16、20、24 h,并采集样品。
调节模拟废水的pH=7,温度分别为10、20、30、35 ℃,其他条件同上,持续曝气1、4、8、16、20、24、28 h,并采集样品。同时在废水的生物处理中,反应速率与温度之间的关系式可以用公式(3)表示,且通常以20 ℃为基准温度来计算θ值[12],即令T0= 20 ℃。
式中:k1、k0分别为T1、T0时的反应速率常数,h-1;θ为温度系数。
以上实验结束后,将随时间蒸发的水样用去离子水定容至100 mL以固定体积,用0.45μm混合纤维素(MCE)过滤测定后测定剩余污染物的浓度。
1.3 分析检测方法污染物的测定均参照标准方法进行(国家环境保护总局,2002),CODMn测定采用高锰酸钾滴定法,NH4+-N测定采用纳氏试剂分光光度法,文中浓度皆为质量浓度,所有指标检测均取2个平行样以保障数据准确性。采用Origin 2021软件完成数据拟合及绘制,误差棒均为标准差,使用软件SPSS 18.0单因素ANOVA检验进行显著性分析,P<0.05为有显著差异。
2 结果与分析 2.1 凹凸棒土固定化微生物颗粒性能 2.1.1 颗粒强度将颗粒放入200 r/min的摇床中连续振荡,模拟养殖水体持续曝气(图 1a)。固定化微生物颗粒随振荡时间增长,破损百分比逐渐升高,破碎速率也呈上升趋势。在实验开始的10 d内未见破损,连续振荡60 d后破损百分比达23%±2.828 %。
由图 1(b)可知,在每日都补充营养物质的前提下,凹凸棒土小球释放的微生物的数量维持在1.5×106 CFU/mL。在未补充营养物质的情况下,微生物因缺少生长所需的营养物质导致其数量小于前者并在第四天时骤减。
如图 1(c)、(e)所示,在不同pH与污染物初始浓度下,固定化微生物颗粒缓释的微生物数量没有显著性差异(P>0.05)。如图 1(f)可得,除在曝气8 h,温度条件为35 ℃以外,其余条件下颗粒缓释的微生物数量均无显著性差异(P>0.05)。不同曝气强度对固定化微生物颗粒缓释性能有一定影响,如图 1(d)所示,当气体流量为2 L/min(DO=8.3±0.028 mg/L)时释放的微生物数量多于其他两个条件且有显著性差异(P<0.05)。
2.1.3 固定化微生物颗粒的污染物降解动力学根据固定化微生物颗粒降解动力学模型结果(图 2)可知,随着污染物浓度的增大,其降解速率相应增加。本实验中固定化微生物降解CODMn的μmax为(39.730±4.835) h -1,Ks为(353.914±47.196) mg/L,R2为0.864,拟合效果较好;此外,固定化微生物降解氨氮的μmax为(9.208±0.904) h -1,Ks为(112.166±17.194) mg/L,R2为0.962,拟合效果较好。
其中当污染物浓度小于半饱和常数(即S <Ks)时,水体中污染物的一级降解速率与污染物浓度成正比[13],动力学符合一级反应。当污染物浓度远远大于半饱和常数Ks值[14],即CODMn浓度>>(353.914±47.196) mg/L,氨氮浓度>>(112.166±17.194) mg/L时,动力学符合零级反应。
2.2 环境条件对固定化微生物颗粒降解污染物的影响研究 2.2.1 pH的影响由表 1可知,污染物的降解基本符合一级动力学反应(除酸性条件下降解氨氮)。对于CODMn,中性(pH=7)条件下一级速率常数k=(0.122±0.014) h-1最高(P<0.05),说明酸性或碱性条件均不利于固定化微生物降解CODMn;对于氨氮,中性和碱性条件下的降解效率均好于酸性条件。
由表 1可知,三种气体流量下固定化微生物降解CODMn一级反应速率无显著性差异(P>0.05),其中气体流量为1 L/min[DO=(7.500±0.028) mg/L]时最低。且气体流量为1 L/min[DO=(7.500±0.028) mg/L]时,固定化微生物降解氨氮一级反应速率最低(P<0.05),气体流量为3.5 L/min[DO=(8.600±0.028) mg/L]时,对氨氮的降解最优。
2.2.3 污染物初始浓度的影响由表 1可知,固定化微生物降解CODMn一级反应速率常数k为(0.093±0.013)~(0.163±0.008) h-1, 随着污染物初始浓度的增加,一级反应速率常数k值逐渐增加。氨氮一级反应速率常数k为(0.033±0.023)~(0.129±0.021) h-1,初始污染物浓度最高时k值低于中等浓度。
2.2.4 温度的影响由表 1可知,固定化微生物颗粒降解CODMn的一级反应速率常数为(0.085±0.002)~(0.243±0.023) h-1,降解氨氮的一级反应速率常数k为(0.012±0.011)~(0.062±0.006) h-1,随温度的升高,降解速率增大。通过计算得到固定化微生物降解CODMn、氨氮不同温度下的温度系数θ值如表 2所示,分别为1.003~1.105、1.039~1.088。可以发现随着温度的波动,温度系数也有小幅波动。固定化微生物颗粒降解CODMn、氨氮温度系数θ取平均值分别为1.037、1.060,由此在10~35 ℃范围内速率常数k与温度(℃)的关系分别为k=0.230×1.037T-20(k20=0.230±0.037)、k=0.028×1.060T-20(k20=0.028±0.019)。
颗粒强度是固定化微生物颗粒的一个重要物理指标。如果固定化颗粒强度太低,养殖过程中复杂的环境会使其在未发挥作用时破碎,不但无法发挥固定化微生物的作用,并可能对水体造成二次污染。本实验所用颗粒破碎速率总体上随时间延长而增大,但在开始的10 d内未见破损,连续振荡60 d后破损百分比达23%±2.828%。而郑华楠等[15]将固定化颗粒置于240 r/min的摇床中搅拌振荡2 d后,颗粒破损率为5.2 %,说明本实验使用的固定化微生物颗粒具有较好的机械强度,适用于原位修复养殖水体。
3.1.2 微生物缓释性能缓释性能是尾水处理的一个重要参数,缓慢释放在养殖池塘中的微生物不仅可以增加养殖池塘中的有益微生物的数量,也可以改善养殖池塘水体中微生物的群落结构,以改善养殖池塘的水质。而凹凸棒土小球缓释微生物的机理主要分为两部分,首先是凹凸棒土作为一种天然一维纳米材料,具有较大的比表面积和较强的吸附性能可以大量吸附微生物,且其晶体呈棒状,纤维状,内部结构复杂[16],使得微生物固定后缓慢释放;其次固定后微生物会在凹凸棒土小球表面形成生物膜[17],进一步增加微生物缓释时间,使得固定化微生物颗粒能持续地净化水体。
在每日都补充营养物质的前提下,凹凸棒土小球释放的微生物的数量维持在1.5×106 CFU/mL,远高于养殖水体自身微生物数量102 ~103 CFU/mL[18]。因此,本实验中的固定化微生物颗粒处理尾水时,可利用尾水中的残余饵料作为微生物营养物质,有效提高池塘中有益土著微生物的数量,进一步提高养殖尾水的自净能力。
在不同pH、污染物初始浓度以及温度下,固定化微生物颗粒缓释的微生物数量基本没有显著性差异,表明凹凸棒土固定化微生物可以较好地适应养殖条件内pH、温度变化并且在有足够浓度的有机物作为微生物的基质时,可以稳定地向养殖水体释放土著微生物。叶正芳等[19]也发现在不同温度、pH、以及高有机负荷的情况下,其使用的固定化微生物颗粒释放的微生物具有较好活性。但不同曝气强度对固定化微生物颗粒缓释性能有一定影响,当气体流量为2 L/min[DO=(8.300±0.028) mg/L]时释放的微生物数量更多。据分析其原因为气体流量较小时,溶液中出现供氧不足,微生物的增殖能力减弱,微生物失去活性[20],适当提高曝气强度使得水中的溶解氧上升,菌体增殖速率加快。但是气体流量过高时会对微生物扰动加大,会加速微生物死亡。所以实际应用时需注意控制曝气强度,以免造成有益菌死亡。综上,凹凸棒土固定化微生物颗粒能较好地适应多变的环境条件,缓释性能稳定,适用于实际养殖。
3.1.3 固定化微生物颗粒的污染物降解动力学研究发现,Monod方程常用于生物处理中描述污染物浓度与降解速率的关系[21],即微生物以单一污染物质(有机物或者氨氮)作为基质、微生物处于平衡生长状态以及处理过程中没有毒性存在[22]。因此本研究采用Monod方程模拟了固定化复合菌种对水体中CODMn和氨氮降解效果。研究可得,固定化微生物颗粒降解动力学模型Monod方程结果良好,这与已有的研究结论一致[23-24]。由表 2比较可得,本文所使用的固定化复合菌种的颗粒降解CODMn、氨氮性能良好,能快速降解废水中的耗氧有机物,同时对氨氮也有较好的降解效果。
3.2 环境条件对固定化微生物颗粒降解污染物的影响研究 3.2.1 pH的影响水体的pH是反应养殖水体最重要理化参数之一。据以往研究发现,pH<5或pH>9时会严重影响微生物的降解效率[31]。本研究中对于CODMn,pH=7时,一级速率常数k最高,说明酸碱条件不利于固定化微生物降解CODMn;对于氨氮,中性和碱性条件下的降解效率均好于酸性条件。首先是因为硝化细菌更容易生长在中性和弱碱性的环境[32-33],其次是因为NH3和NH4+之间的平衡,碱性条件下是NH3占据主导[34],有利于曝气过程中氨氮的吹脱;酸性条件时,除了pH本身大幅削弱硝化细菌的活性外,NH4+也不是硝化细菌的主要利用对象。因此,在实际养殖时,要注意调节池塘水体pH,以免对水质以及水生动物造成不利影响。
3.2.2 曝气强度的影响在养殖池塘中,使用增氧机以保持水中的溶解氧浓度十分常见。聂春芬等[35]研究发现,DO浓度在1~6 mg/L内变化不会对固定化微生物降解COD产生太大影响,但当DO浓度<3 mg/L时,硝化反应会受到抑制。本实验结果表明,水中溶解氧变化不会对固定化微生物降解CODMn造成显著性差异,但是当水中溶解氧含量最低[DO=(7.500±0.028) mg/L]时,固定化微生物降解氨氮一级反应速率最低,说明气体流量太低会导致水体中溶解氧不足,导致微生物失去活性、死亡,降解能力下降。当水中溶解氧最高[DO=(8.600±0.028) mg/L]时,对氨氮的降解最优,其原因可能是硝化细菌本身对溶解氧的需求更大[36]。因此提高溶解氧水平有助于硝化细菌的增殖[37],从而表现出氨氮速率常数的增加。由于南美白对虾养殖一般要求水中的溶解氧在4 mg/L以上[38],总体来说,为考虑经济成本,在实际养殖中保持合适的曝气强度(以保证微生物以及水生生物所需要的量)。但若池塘中氨氮浓度较高,则需保持适当较高的曝气强度,提高水中溶解氧水平。
3.2.3 污染物初始浓度的影响固定化微生物降解CODMn一级反应速率常数随着污染物初始浓度的增加而增大。其原因可能是由于污染物浓度相对较低,可供微生物利用的基质减少,微生物种群间及其内部产生竞争致使生物的生长增殖速率受限[39]。氨氮一级反应速率常数在初始污染物浓度最高时低于中等浓度,其原因是水体中,NH4+和游离NH3存在平衡,据研究发现当pH、温度条件不变时模拟废水中NH4+浓度的越高,游离NH3的浓度越高[40],而NH3是对硝化细菌有毒的,因此在模拟养殖水体初始污染物浓度最高时一级反应速率常数产生下降。所以在实际养殖条件中可以通过适当提高曝气强度,增加水中溶解氧,协同降解氨氮。
3.2.4 温度的影响固定化微生物颗粒降解CODMn、氨氮的一级反应速率常数随温度的升高而增大,说明温度过低时对微生物活性有着一定影响,不利于固定化微生物降解CODMn、氨氮。肖志坚等[41]也证实了温度变化对微生物氨氮降解性能有显著影响。固定化微生物降解CODMn、氨氮不同温度下的温度系数θ值随着温度的波动,温度系数也有小幅波动,其原因是温度变化可能会导致微生物种属更替导致影响θ值[42]。由于现场池塘养殖的南美白对虾是热带性虾类,人工养殖适宜的摄食、生长的水温为18~35 ℃[43],在此范围内固定化微生物颗粒缓释微生物、降解污染物的效果并没有受到很大的影响,适宜原位投加使用。
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