2022,
Vol. 31
2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306
海马(Hippocampus)属于海龙目(Syngnathiformes)海龙科(Syngnathidae)，主要分布于50°N到50°S的温带和热带沿海区域，常栖息于藻体，世界范围内已发现隶属于海马属的动物48种[1]。目前海马除用作观赏鱼类及部分应用于传统医药外，对其精深加工报道较少。研究表明，海马具有一系列功能性作用，如抗氧化[2-5]、抗炎[6-9]、抗肿瘤[10-11]、激素样作用[12-13]等，且对高血压、血栓、阳痿及某些神经退行性疾病具有良好缓解作用[12, 14]。目前对海马的研究多集中在甾体[15-16]、脂肪酸[17-18]、多肽[19]等组分，对海马多糖研究尚不深入，相关报道较少。多糖是天然大分子物质，生物活性多样[20-22]，在医药、保健品、食品及化妆品等领域的产品开发具有广泛应用前景。本文以日本海马(Hippocampus mohnikei)为原料，通过响应面优化超声辅助提取海马多糖工艺，并经分级纯化得到均一多糖，初步研究其单糖组成及抗氧化活性，可为海马多糖的产业化应用提供科学依据和技术支撑，有助于提升海马加工的技术水平与附加值。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂日本海马(体长3~5 cm，体质量10~20 mg，月龄3~10个月)取自山东省日照市；氯化钠、纯化填料，上海兰拓生物科技有限公司；硫酸、三氯甲烷、二氯甲烷，上海柯灵斯有限公司；95%乙醇、乙酸酐、三氯乙酸、抗坏血酸、DPPH，国药集团化学试剂有限公司；盐酸羟胺，北京化工厂；苯酚、三氟乙酸，阿达玛斯试剂有限公司。
1.2 仪器与设备主要仪器：恒流泵，上海沪西分析仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱(DH6-907385-Ⅲ)，上海讯博实业有限公司医疗设备厂；80-2离心机，金坛荣华仪器厂；旋转蒸发仪(RE3000-D)，上海亚荣生化仪器厂；气质联用仪，美国Agilent公司；紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 海马粗多糖的提取恒温鼓风干燥箱60 ℃海马干燥至恒重，粉碎成粉末。乙醇回流法脱脂：液料比10 mL/g、温度80 ℃、水浴3 h、重复3次，过滤得到脱脂海马粉，烘干。按30 mL/g液料比向脱脂海马粉内加入蒸馏水超声辅助提取、过滤、浓缩、乙醇沉淀、离心(4 000 r/min，4 ℃，20 min)去除上清液，冷冻干燥，即得海马粗多糖HP[23]。
1.3.2 单因素实验按照1.3.1节所述方法，以液料比20 mL/g、超声30 min、80 ℃浸提3 h设定为基本实验条件，测定超声时间(20、30、40、50、60 min)、浸提温度(50、60、70、80、90 ℃)、液料比(10、20、30、40、50 mL/g)对多糖得率的影响[24]。海马粗多糖得率按下式计算：
(1)
式中: W为多糖得率，%；m为粗多糖质量，mg；M为称取的海马质量，mg。
1.3.3 响应面试验以单因素试验结果为依据，选择三因素三水平进行响应面试验(表 1)，测定各试验条件对多糖得率的影响，利用Design-Expert 11软件进行回归分析，确定海马多糖最佳提取工艺条件[25-26]。
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表 1 响应面试验的因素及水平 Tab.1 Factors and levels of response surface text |
(1) 脱蛋白
取适量海马粗多糖溶于蒸馏水中，离心(4 000 r/min，4 ℃，20 min)，取上清液加入适量三氯乙酸，使其终浓度为3%，搅拌均匀放置过夜，离心(4 000 r/min，4 ℃，20 min)，取上清液旋蒸浓缩后，透析(截留分子量3 500 u)，收集透析液，备用[23]。
(2) DEAE-52离子纤维素交换柱纯化
充分溶胀DEAE-52填料1 h，去除杂质，玻棒引流缓慢装柱，防止产生气泡，待填料不再下降，超纯水平衡过夜。取适量透析液上样，0、0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液作为洗脱液，苯酚-硫酸检测吸光值，绘制曲线，收集出峰管，浓缩、透析进行下一步纯化。
(3) Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱纯化
充分溶胀葡聚糖凝胶填料24 h，去除上层凝胶碎片颗粒，进行装柱，超纯水平衡3~5个柱体积，备用。取适量经DEAE-52纤维素离子交换柱纯化后的多糖溶液进行上样，分别用0.1和0.3 mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集，苯酚-硫酸检测吸光度值，绘制洗脱曲线，收集出峰管，透析浓缩，冻干即得海马纯化多糖。
1.3.5 HP-1和HP-2单糖组成测定参考文献[25]的方法对标准品、海马多糖进行水解及乙酰化，随后上机分析，氦气作为载气，流速为1 mL/min。温度程序：发射能量为70 eV; 离子源温度为150 ℃；柱温在165 ℃下保持7 min，以5 ℃/min上升至185 ℃；5 min后，以4 ℃/min速度上升至200 ℃；设定升温速度为20 ℃/min，上升至280 ℃，保持2 min，进行GC-MS分析。
1.3.6 抗氧化活性评价(1) DPPH自由基清除能力[27]
Vc为对照组，测定HP、HP-1、HP-2对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)的清除能力。配置不同质量浓度HP、HP-1、HP-2(1、2、3、4、5 mg/mL)溶液，取同体积多糖和DPPH溶液于96孔板，反应30 min(避光)，测定517 nm吸光度值，根据公式(2)计算HP、HP-1、HP-2对DPPH·的清除率。
(2)
式中：C为DPPH·清除率，%；A0为空白对照吸光度；A1为样品吸光度；A2为样品本底吸光度。
(2) 总还原力测定
配置0.2 mol/L PBS(pH 6.6)、1%六氰铁酸钾溶液、10%三氯乙酸和0.1%三氯化铁，按文献[28]方法测定不同浓度HP、HP-1、HP-2溶液的还原力。
1.4 数据处理分别采用Origin 9.0、SPSS 17.0、Design expert 11.0软件分析实验相关图表、单因素实验数据与响应面试验及其显著性。
2 结果与分析 2.1 超声时间、浸提温度及液料比对海马粗多糖得率的影响如图 1a所示，随着超声时间延长，多糖得率逐渐提高，当达到50 min时，达到最大值11.30%，随后多糖得率降低，这是由于超声时间增加有利于海马的细胞组织破碎，加速多糖溶出，但随着时间继续增加，杂质溶出增多，且超声时间延长可能会引发多糖降解，导致乙醇沉淀时多糖得率有所降低[29]，因此确定超声时间为50 min。如图 1b所示，随着浸提温度升高，多糖得率逐渐增大，当达到80 ℃时，达到最大值11.07%，温度进一步升高，多糖得率下降，表明在一定范围内温度升高可加快多糖溶出，但超过一定温度，则不利于多糖溶出。如图 1c所示，随着溶剂量增大，多糖得率逐渐上升，当液料比为30 mL/g时，达到最大值9.47%，表明在一定范围内，增加液料比可提高海马多糖产率，这源于溶剂量的增加会提高多糖在水边界层的浓度差，从而促进其扩散[30]。
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图 1 超声时间、浸提温度、液料比对海马多糖得率的影响 Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment time, extraction temperature, solvent-to-solid ratio on the yield of Hippocampus mohnikei polysaccharide |
在单因素实验的基础上，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计进行了17组试验，如表 2所示，多糖得率波动范围较大，最小为4.93%，最大为11.32%，表明相同试验因素的不同水平对多糖得率有较大影响，因此进一步对其进行回归方程的方差分析。
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表 2 响应面试验设计及结果 Tab.2 Design and results for response surface analysis |
采用Design-Expert 11.0软件对试验结果进行拟合分析得到二次多项式回归模型：Y=8.78-0.7480 A+1.14 B-0.6420 C-0.0170 AB+0.9460 AC-1.30 BC+0.6838 A2-1.31 B2-0.6032 C2。
如表 3所示，对该回归方程进行方差分析，得到模型P < 0.01，具有显著性，表明模型具有较高可信度；失拟项不显著P>0.05、相关系数R2=0.987 9，表明模型拟合良好；且信躁比Adeq precision=30.501 4>4，综合以上结果表明该回归二次模型成立，可用于分析和预测海马多糖的提取工艺[26]。根据F值大小可以得到3个因素对于海马多糖得率影响的主次顺序依次为浸提温度(B)、超声时间(A)、液料比(C)。其中除了交互项AB对多糖得率的影响不显著外，其余项对多糖得率均具有极显著影响(P < 0.01)。
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表 3 回归模型的方差分析 Tab.3 Analysis of variance in regression model |
图 2为液料比、浸提温度、超声时间之间交互作用对多糖得率的影响，其中浸提温度与液料比、超声时间与液料比的交互作用对海马多糖得率影响极显著，而浸提温度与超声时间的交互作用不明显。通过对实验模型的分析，得到最优工艺条件为超声时间47.37 min、浸提温度86.73 ℃、液料比22.86 mL/g，多糖得率为10.16%。考虑到实验可操作性，将最佳提取工艺更正为超声时间47 min、浸提温度87 ℃、液料比23 mL/g，测得其得率为9.91%，与响应面试验结果相近，表明该最佳提取工艺可行。
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图 2 各因素相互作用对海马多糖得率影响 Fig. 2 Interactive effects of various factors on polysaccharide yield |
HP首先通过DEAE-52离子交换柱纯化，如图 3a所示，洗脱液为不同浓度NaCl溶液(0、0.1、0.3、0.5 mol/L)，收集0.1 mol/L(27~29)和0.3 mol/L(52~54)NaCl溶液洗脱下的多糖溶液，经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱进一步纯化，得到单一对称的曲线图，表明其为均一多糖，如图 3b所示，收集出峰管，浓缩、透析、冷冻干燥得到纯化多糖，命名为HP-1和HP-2。
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图 3 海马多糖洗脱曲线 Fig. 3 Elution curve of Hippocampus mohnikei polysaccharides |
经GC-MS分析，HP-1和HP-2均是杂多糖，其中HP-1中含有葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖，且葡萄糖含量最多，而HP-2中含有较多的氨基葡萄糖及糖醛酸。见表 4。
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表 4 HP-1和HP-2单糖组成 Tab.4 Monosaccharide composition of HP-1 and HP-2 |
如图 4所示，质量浓度为0~5 mg/mL时，HP对DPPH自由基无清除作用，纯化后的海马多糖HP-1和HP-2其清除效果明显增强，尤其是HP-2，在浓度为5 mg/mL时，其DPPH自由基清除率为72.48%，虽与Vc有差距，但依然展示了较强的抗氧化能力。黄素华等[31]对枇杷叶多糖的研究表明，纯化后的多糖对DPPH自由基的清除效果更好，也说明纯化的多糖抗氧化活性得到提升。
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图 4 HP、HP-1、HP-2对DPPH自由基清除能力 Fig. 4 Scavenging effect of HP, HP-1, HP-2 on DPPH free radical |
铁氰化钾中的三价铁可被具有抗氧化功能的多糖还原成二价亚铁，与三氯化铁反应生成在700 nm处有最大紫外吸收值的普鲁士蓝。如图 5所示，随着多糖浓度增加，吸光度值逐渐增大，表明HP、HP-1、HP-2的还原力随着浓度增加而逐渐增强，且在相同浓度下，HP-2的还原力最强，而由于粗多糖成分复杂，因素影响众多[32-34]，使HP还原力高于HP-1。在0~5 mg/mL浓度范围内，HP、HP-1、HP-2的线性拟合方程分别为yHP=0.026+0.030x，R2=0.967；yHP-1=0.021+0.024 x，R2=0.983；yHP-2=0.047+0.030 x，R2=0.973。如图 6所示，HP-1、HP-2清除DPPH自由基能力和还原力间具有相关性，其相关系数R2均大于0.9，由于HP只有还原力，但对DPPH没有清除力，所以不存在HP的还原力与DPPH·清除率的相关性。
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图 5 HP、HP-1、HP-2还原力 Fig. 5 Reducing power of HP, HP-1, HP-2 |
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图 6 HP-1、HP-2的还原力与DPPH·清除率的相关性 Fig. 6 Correlation between the reducing power and DPPH· clearance of HP-1 and HP-2 |
多糖提取主要有水提法、酸提法、碱提法和酶提法等[35]，其中水提法因其工艺简单、无污染而最常用，在传统水提法基础上，引入超声辅助提取可缩短提取时间，提高提取效率，降低多糖损失[36]，本研究采用响应面法优化了超声辅助提取海马粗多糖工艺，得到最佳提取条件，多糖得率达到9.91%。粗多糖组分及结构复杂多样，限制了其进一步应用，因此将其制备为均一多糖，是当前国内外多糖研究的重点，也是提高其附加值的关键，目前多糖纯化方法有沉淀法、柱层析法和超滤法等[37]，其中柱层析法较常用，本文采用柱层析分级纯化得到2种均一多糖HP-1及HP-2，整体而言，HP-2相比粗多糖具有更好的抗氧化活性，表明多糖纯化与否对其生物活性有较大影响，这与文献[32]报道一致。
单糖组成是多糖最基本的结构特征，是影响其生物活性的重要因素[38-39]，HP-1及HP-2单糖组成较为复杂，经GC-MS分析，HP-1主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成，HP-2主要由氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成，这为其进一步结构表征和活性分析奠定了基础。多糖生物活性多样，研究[40]发现，多糖的抗氧化性是其抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功效的作用机制之一，国内外非常关注多糖的抗氧化活性，已成为食品、生物等领域的研究热点。自由基具有高度化学活性，是人体代谢产物，产生过多会引起脂质过氧化作用、DNA氧化破坏或交联，进一步损伤机体细胞和器官组织，诱发多种疾病[22]。多糖的抗氧化作用可通过转移电子给DPPH·，中和自身自由基而实现，另外还原力是多糖抗氧化性的直接体现[41]，因此本文以DPPH自由基清除力和还原力为指标，评价了海马多糖的抗氧化活性，以期为海马多糖的功能研究打下基础，也为开发海洋动物来源的抗氧化剂提供实验依据。
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