2022,
Vol. 31
2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要的海水养殖对象，在人工养殖半滑舌鳎群体中，经常出现体色异常现象, 有眼侧部分皮肤缺乏色素细胞(白化)或无眼侧部分皮肤色素沉着过多(黑化)[1-3]。体色白化或黑化虽然对鱼体没有病理影响，但体色异常被认为是一种劣质产品，大大降低了半滑舌鳎的市场价值。已有众多报道，半滑舌鳎等鲆鲽鱼类体色异常与环境和营养因素有关，但关于导致体色异常产生的分子遗传的研究还很少，目前尚无法从遗传选育角度降低体色异常的比例。
鲆鲽鱼类的体色异常是由遗传以及环境因素引起的，目前对于鲆鲽鱼类体色异常的研究和预防主要体现在养殖环境、营养水平和内分泌因素[4-6]等方面。影响半滑舌鳎体色异常的因素主要有营养、水温、背景色、光照强度[7-10]等。体色异常的遗传因素尚不清楚，目前在牙鲆体色异常的遗传分析中，鉴定出adenylate cyclase type 6-like第2 677位点(AC-2677-C/A)、cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4-like第967和1 118位点(ATF4-967-G/A、ATF4-1118-C/T)、inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor type 2-like第7 032和554位点(Itpr2-7032-C/T、Itpr2-554-T/C)与牙鲆体色异常显著性相关[11-12]，牙鲆的体色形成，与来自水面的光线照射引起有眼侧和无眼侧的9-顺-视黄酸合成水平差异有关，9-顺-视黄酸通过视黄酸受体RXRs起作用，因此能与RXR形成异二聚体的核受体, 如甲状腺激素受体TRs、全反式视黄酸受体RARs、PPARγ等，以及这些受体的配体合成等相关通路都可能影响色素细胞的形成[13]。此外，黑色素合成相关通路的基因突变也可能导致体色异常[14-15]。牙鲆体色异常的基因突变位点与甲状腺合成通路和黑色素合成通路有关[11-12]。
本研究对体色相关通路基因的9个错义突变位点进行了测序调查，发现有3个错义突变位点与半滑舌鳎白化相关，可为减少体色异常的半滑舌鳎育种工作提供分子基础。
1 材料与方法 1.1 材料半滑舌鳎正常样本81尾、黑化样本80尾和白化样本68尾，其中小样本测序的正常、白化和黑化个体半滑舌鳎采自黄海水产有限公司(山东海阳)，大量样本测序的正常、白化和黑化个体半滑舌鳎采自乾海源水产有限公司(天津)。每尾剪取小部分尾鳍，用作DNA提取。其中，5尾半滑舌鳎白化样本的皮肤用作RNA提取，白化舌鳎采集有眼侧的白化皮肤和正常皮肤，无眼侧采集正常皮肤。
1.2 方法从天津乾海源水产养殖有限公司采集3尾无眼侧黑化的半滑舌鳎，选取黑化半滑舌鳎无眼侧黑化皮肤和无眼侧正常皮肤，Trizol法提取RNA，运用Illumina/Solexa转录组测序的方法对成年黑化半滑舌鳎的无眼侧正常和无眼侧黑化的皮肤进行转录组高通量测序分析。通过对皮肤的转录组数据的深度分析挖掘，在Arachidonic acid metabolism、Thyroid hormone synthesis、Phototransduction、Melanogenesi、Retinol metabolism和PPAR signaling pathway等6个体色相关通路中，筛选出与体色相关的位于编码区且错义突变率高的9个SNP位点(表 1)。
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表 1 SNP位点信息和引物序列 Tab.1 SNP information and primer sequence |
将采集的半滑舌鳎样本提取DNA，以DNA为模板，用作PCR扩增的引物见表 1，PCR反应体系为25 μL：12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix、1 μL Primer F(10 μmol/L)、1 μL Primer R(10 μmol/L)、1 μL DNA模板，无菌水9.5 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40个循环后，再72 ℃ 10 min。经琼脂糖凝胶检测、目的条带清晰无杂带的PCR产物送上海生工公司进行测序。
1.4 基因型分析纯合型半滑舌鳎SNP位点的测序峰图为单峰，杂合型半滑舌鳎SNP位点的测序峰图为双峰。分别统计测序结果中正常、黑化和白化半滑舌鳎的基因类型和每个基因型的数量，以及等位基因频率，最后用SPSS 18.0软件对正常和黑化半滑舌鳎、正常和白化半滑舌鳎、黑化和白化半滑舌鳎进行单因素方差分析, 并对基因型分布进行独立性检验。χ2>χ0.052=5.991, P < 0.05，表明样本间具有显著性差异；χ2>χ0.012= 9.21，P < 0.01，表明样本间具有极显著差异。
1.5 蛋白质结构的生物信息学分析从NCBI网站下载半滑舌鳎ertB、tyr、alox5蛋白的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。用SWISS-MODEL预测蛋白的三维结构(https://www.swissmodel.expasy.org/)，使用包含SNPs的外显子区域进行建模, 然后，选择得分最高的模型作为最终模型。
1.6 定量RT-PCR用Trizol法提取皮肤组织的总RNA。用Nanodrop 2000测定OD260/OD280及浓度，再用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。然后把RNA逆转录成cDNA，以cDNA作为模板在ABI 7500定量PCR仪上进行定量PCR。PCR反应体系：qPCR Mix 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL、下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA < 100 ng，加DEPC水到20 μL。每个样品进行3组平行，β-actin作为内参，引物序列见表 1。PCR程序：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，共40个循环。内参基因和目的基因的相应扩增效率(E)均大于95%。采用7500 Software 2.3软件进行溶解曲线分析，计算Ct值。相对表达量计算采用2-ΔΔCt法，其数值用平均值±标准误(Mean±SE)表示，n=3。
2 结果与分析在各16尾正常、白化、黑化的半滑舌鳎样本中，对7个与体色形成相关通路基因的9个有义突变SNP位点进行基因型分析，发现arachidonate 5-lipoxygenase第1 178位的C/T位点(命名为alox5-1178-C/T)、endothelin receptor type B-like第160位的C/T位点(命名为ertB-160-C/T) 和tyr tyrosinase第473位的G/A位点(命名为tyr-473-G/A)在正常、黑化和白化半滑舌鳎群体中的基因型分布具有显著性差异(表 2)。
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表 2 SNP位点小样本间的基因型分布和卡方值统计结果 Tab.2 Statistical results of genotype distribution and Chi-square value among large samples of SNP loci |
ertB-160-C/T位点中正常、白化、黑化半滑舌鳎的优势基因型分别为CC(50.00%)、CT(73.33%)、CT(37.50%)，正常和白化半滑舌鳎的显著性检验结果为χ2=6.02，P < 0.05，大于χ0.052=5.991, 表明ertB-160-C/T位点与半滑舌鳎的白化性状显著相关。
tyr-473-G/A位点中正常、白化、黑化半滑舌鳎的优势基因型分别为GG(81.25%)、GA(60.00%)、GG(87.50%)，正常和白化半滑舌鳎的显著性检验结果为χ2=7.986，P < 0.05，表明tyr-473-G/A位点在正常和白化半滑舌鳎养殖群体间基因型分布具有显著性差异，此位点与半滑舌鳎的白化性状显著相关。
alox5-1178-C/T位点中正常、白化、黑化半滑舌鳎的优势基因型分别为CT(50.00%)、TT(68.75%)、TT(50.00%)，正常和白化半滑舌鳎的显著性检验结果为χ2 =6.5，P < 0.05，表明alox5-1178-C/T与半滑舌鳎的白化性状显著相关。
2.1 体色异常相关SNP位点的鉴定为了进一步明确ertB-160-C/T位点、tyr-473-G/A位点和alox5-1178-C/T位点与半滑舌鳎白化性状的相关性, 把正常、白化和黑化样本数扩大到50尾以上，分别对60尾正常的半滑舌鳎样本、54尾黑化样本和51尾白化样本进行SNP测序分型。ertB-160-C/T位点中正常、白化、黑化半滑舌鳎的优势基因型分别为CC(58.33%)、CT和CC(40.74%)、CT(62.75%)，正常和白化半滑舌鳎样本间，呈极显著性相关(表 3)，表明ertB-160-C/T位点与半滑舌鳎发生白化有关。tyr-473-G/A位点中正常、白化、黑化半滑舌鳎的优势基因型分别为GG(74.51%)、GA(47.06%)、GG(72.55%)，正常和白化半滑舌鳎样本间呈显著性相关(表 3)，表明tyr-473-G/A位点与半滑舌鳎发生白化有关。alox5-1178-C/T位点中正常、白化、黑化半滑舌鳎的优势基因型分别为CT(56.92%)、CT(51.92%)、CT(43.75%)，正常和白化半滑舌鳎样本间，呈显著性相关(表 3)，表明alox5-1178-C/T位点与半滑舌鳎发生白化相关。
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表 3 SNP位点大样本间的基因型分布和卡方值统计结果 Tab.3 Statistical results of genotype distribution and Chi-square value among large samples of SNP loci |
ertB基因编码区(CDS)为1 239 bp，编码412个氨基酸，脯氨酸(Pro)在第160位突变为丝氨酸(Ser)。tyr基因CDS为1 584 bp，编码527个氨基酸，在第473个氨基酸由甘氨酸(Gly)突变为谷氨酸(Glu)。alox5基因全长cDNA为1 324 bp，编码440个氨基酸；在1 178个氨基酸处，丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)。
ertB基因特定匹配在7tmA_ET-CR，属于7tm_GPCRs超级家族，ertB-160-C/T这个突变位点位于蛋白的Periplasmic_Binding_Protein_type1结构域，是许多糖基溶质趋化和转运的主要受体，ertB第160个氨基酸由Pro突变为Ser，可能会影响周质结合蛋白对糖基溶质趋化和转运。tyr基因特定匹配在Tyrosinase，属于Tyrosinase超级家族。tyr-473-G/A突变位点位于蛋白的Tyosinase C-terminal结构域，tyr第473个氨基酸由Gly突变为Glu，可能会影响酪氨酸酶的C端结构域对酶活性的调节。alox5基因特定匹配在PLAT_LOX，属于PLAT超级家族，非特定匹配在Lipoxygenase，属于Lipoxygenase超级家族，alox5-1178-C/T突变位点位于蛋白的Lipoxygenase结构域，alox5第1 178个氨基酸由Ala突变为Val时，可能会影响脂氧合酶的酶活性。
图 1中ertB-160-C和ertB-160-T显示第160个氨基酸分别为Pro和Ser时，突变前后ertB蛋白质的三级结构整体折叠水平相似，但略有不同。ertB蛋白质第160个氨基酸的突变使第160个氨基酸的丝氨酸和蛋白质之间形成不规则连接，ertB-160-T尾部部分与蛋白质大分子相连(图 1红色箭头)。tyr-473-G和tyr-473-A显示第473个氨基酸由亲水性的Gly转变为疏水性的Glu时, tyr蛋白质的三级结构的整体折叠水平相似，但有细微差别。tyr-473-G的蛋白质一处由不规则卷曲变成β折叠，还有一处由β折叠变成不规则卷曲，而tyr-473-A的蛋白质结构变化与其相似(图 1红色箭头)。alox5-1178-C和alox5-1178-T显示第1 178个氨基酸分别为Ala和Val时，alox5蛋白质的三级结构折叠水平相似，与突变前蛋白相比，突变后蛋白的空间结构发生了一定程度的变化alox5-1178-T从不规则卷曲变为α螺旋(图 1中红色箭头)。
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图 1 Swiss model预测ertB、tyr和alox5蛋白以及含有SNPs的蛋白质的结构 Fig. 1 prediction of tertiary structure of ertB、tyr and alox5 proteins and proteins containing SNPs by Swiss model |
qRT-PCR检测表明：ertB在白化半滑舌鳎中有眼侧正常与白化皮肤表达没有显著差异(P>0.05)，而在无眼侧皮肤中的表达显著高于有眼侧皮肤(P < 0.01)；tyr在有眼侧正常和白化皮肤的表达水平均显著高于无眼侧(P < 0.01)；白化半滑舌鳎中无眼侧alox5的表达水平均显著高于有眼侧(P < 0.05)，有眼侧白化区alox5的表达水平明显高于有眼侧正常皮肤(P < 0.01)。如图 2。
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b.有眼侧正常皮肤；W. 有眼侧白化皮肤；L. 无眼侧正常白皮肤。柱状图上方含*代表显著差异(P＜0.05)，**代表极显著差异(P＜0.01)。 b. there was normal skin on the ocular side; W. there was albino skin on the eye side; L. normal white skin without eyes.The * above the histogram shows significant difference (P < 0.05), The ** shows extremely significant difference (P < 0.01). 图 2 ertB、tyr和alox5在白化半滑舌鳎中的定量检测结果 Fig. 2 Quantitative detection of ertB、tyr and alox5 in pseudo-albino Cynoglossus semilaevis |
通过直接测序法在正常、黑化和白化半滑舌鳎大样本群体中验证了ertB-160-C/T、tyr-473-G/A、alox5-1178-C/T基因型分布具有显著性差异；通过CD-search工具预测基因的蛋白结构域发现这3个突变位点分别位于蛋白的Periplasmic_Binding_Protein_type1、Tyosinase C-terminal和Lipoxygenase结构域，同时利用生物信息学预测蛋白质三维结构变化，发现突变后蛋白质结构与突变前存在差异，导致其功能可能发生变化；通过RT-PCR发现B型内皮素受体第160位的C/T位点(ertB-160-C/T)在正常与白化半滑舌鳎样本之间呈极显著性相关(P < 0.01)，酪氨酸酶第473的G/A位点(tyr-473-G/A)和花生四烯酸5-脂氧合酶的第1 178位的C/T位点(alox5-1178-C/T)在正常与白化半滑舌鳎样本之间呈显著性相关(P < 0.05)。表明这3个SNP位点与半滑舌鳎白化相关。
ertB是皮肤细胞黑色素不均匀沉积的重要靶点之一[16]。内皮素B型受体(ertB)是Edn1的受体，ertB与Edn1结合导致肌醇多磷酸酯水解产生肌醇三磷酸酯(Ip3)。Ip3可以激活体细胞中的Ca2+，而二酰甘油可以通过活化磷脂酶Cγ来激活PKC，使苏氨酸蛋白激酶(Raf-1)磷酸化。磷酸化的Raf-1会将信号传递给丝裂原活化蛋白激酶(Mapk)，使MEK，ERK和RSK均按顺序被激活并发生磷酸化。最终磷酸化的RSK将信号传导至cAMP应答元结合蛋白(CREB)，使其激活并发生磷酸化。磷酸化的CREB与mitf基因启动子结合，调控mitf基因的转录，并最终激活tyr基因，合成黑色素。与此同时，活化的PKC还可以基于a-Msh和黑皮质素受体1(Mc1r)来提高cAMP水平。cAMP通过信号转导激活PKA，而活化PKA也能引起CREB磷酸化，磷酸化的CREB同样作用于MITF基因上，导致黑色素的产生[17]。
tyr位于黑色素相关信号通路的下游，在黑色素合成中起关键作用。鱼类背部体色的深浅主要与皮肤中黑色素细胞的数量有关[18]。tyr的表达水平直接影响真黑素和褪黑素的表达，进而影响动物的体色[19]。在模式生物斑马鱼中，编辑破坏tyr基因的CDS区域对表型有显著影响，而编辑3′-UTR中的非poly-a尾信号区域对表型没有显著影响[20]。LIU等[21]通过半滑舌鳎白化病相关连锁图谱，鉴定并定位了10个具有简单序列重复序列(SSRs)的白化相关基因，tyr2基因就是其中之一。本研究发现与体色异常相关的tyr基因在深色皮肤和白色皮肤中有差异表达，表达水平与色素沉着呈正相关，与以前的研究结果一致。此外，该SNP还位于tyr基因CDS区，这与斑马鱼tyr基因编辑研究的结果一致[20]。
alox5是花生四烯酸脂氧合酶家族的成员, 也是炎症介质白三烯(Lts)和脂蛋白(Lxs)形成的初始催化酶。二十烷化合物如白三烯、前列腺素和血栓素是调节一系列重要的生理代谢途径[22]。ALICIA等报道，用花生四烯酸(ARA)强化饲料喂养牙鲆，由于MSH和ACTH的产生和释放速率不同，可能导致白化的出现[23]。KOVEN等[24]发现，在环境变化前喂食ARA的鲷鱼比在环境变化后喂食能更有效地抵抗环境变化的不利影响。这可能是因为幼鱼利用ARA合成细胞膜磷脂，环境变化激活磷脂酶，磷脂酶启动一系列生化反应，产生具有高生物活性的ARA，调节鱼类对新环境的适应。其他研究表明，ARA可提高鱼类对急性刺激的应激耐受性，但不影响对慢性刺激的应激抵抗力[24]。二十碳五烯酸(EPA)与花生四烯酸(ARA)比率小于4时对比目鱼大菱鲆的背部体色有不利影响[23, 25-26]。然而，LUND等[27]发现，在欧洲比目鱼中，饲料中ARA的含量与体色异常有关，而与饲料中ARA和其他多不饱和脂肪酸的比例无关。
筛选到的ertB、tyr位于黑色素合成相关信号通路中，这两个基因如果发生错义突变的话，可能会导致体色形成异常。alox5是花生四烯酸合成通路中的关键酶，研究表明用花生四烯酸强化过的饲料喂养牙鲆会导致白化现象[23]，这与本实验中白化半滑舌鳎有眼侧白化皮肤高表达量的alox5结果一致。
综上所述，本研究首次对半滑舌鳎体色异常相关基因编码区的突变SNPs位点进行筛选与验证，最终得出位于3个基因上的3个SNP位点与半滑舌鳎假性白化病相关，为今后半滑舌鳎的体色选育提供了分子基础。
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