2. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;
3. 河北农业大学 海洋学院, 河北 秦皇岛 066000
罗非鱼(tilapia)是世界各地集约化养殖的主要品种,现已在全球100多个国家和地区进行养殖,在水产养殖业具有重要的经济价值[1-2]。生物絮团养殖是水产养殖行业生态友好型可持续发展的养殖模式。
异养型生物絮团系统通过向水体中添加额外的有机碳源,调控养殖水环境的碳氮比(C/N),刺激水体中自然存在的异养菌的生长,该种类型的细菌可以将未食用的饲料和代谢废物中的有毒含氮化合物转化为可以食用的生物絮凝物[3]。硝化型生物絮团系统不需要添加额外的碳源,通过低C/N定向驯化生物絮团可以得到自养硝化型生物絮团[4]。RAY等[5]比较硝化型和异养型生物絮团对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖过程中的水质和生长状况的影响。朱亦晨等[6]研究了在硝化型生物絮团中养殖凡纳滨对虾的水质和生长状况。MOHAMMADI等[7]研究了异养型生物絮团添加益生菌对罗非鱼养殖的水质、生长性能和免疫的影响。以上学者的研究主要对比硝化型和异养型生物絮团在养殖过程中的水质波动和对养殖生物的生长性能的影响,而对于两种类型的生物絮团对养殖生物的生理生化、肠道和水体微生物的对比研究较少。鱼类肠道微生物具有提供营养、防御病菌感染、肠道黏膜免疫、体内平衡和新陈代谢等功能,在宿主健康中发挥着重要的作用[8],因此有必要进行重点研究。
本实验的目的是对比硝化型和异养型生物絮团养殖系统对吉富罗非鱼幼鱼生长、生化指标及两种类型的生物絮团对罗非鱼肠道微生物的影响,以期从两者中找到最适合罗非鱼幼鱼养殖的生物絮团的类型。
1 材料与方法 1.1 养殖系统及养鱼试验试验采用6个100 L的塑料桶,规格为直径46 cm,全高60 cm,养殖容积为70 L,分为两个实验组,N组和H组。其中N组为仅添加饲料来促进化学自养硝化细菌生长的硝化型生物絮团养殖系统,H组为定期添加葡萄糖促进异养细菌对氨同化的异养型生物絮团养殖系统,每组3个重复。初始的生物絮团接种自上海海洋大学循环水研发平台1号养殖跑道生物滤器中成熟的硝化型生物絮团,接种后总悬浮颗粒物(TSS)浓度为(75.2±1.3)mg/L。根据投入系统的饲料中的氮被鱼利用后约有75%排出体外的理论值,计算葡萄糖的添加量,维持水体C/N为15。
实验鱼来自广州市花鲳水产养殖场,为吉富品系罗非鱼,初始质量为(3.50±0.30) g,每桶放养25尾,初始放养密度为1.25 kg/m3。每天4次投喂,每5天随机捞取5尾鱼,称质量后根据体质量变化调整每日投喂量,鱼体质量的5%为日投饵量。实验所用饲料为广东省中山市统一企业有限公司罗非鱼饲料,其产品成分为:粗蛋白≥32.0%,粗脂肪≥2.0%,粗纤维≤8.0%,粗灰分≤12.0%,钙≥2.0%,0.6%≤总磷≤3.5%,水分≤12.0%,赖氨酸≥1.4%(数据由厂家提供)。整个养殖期间不换水仅补充因取样和蒸发损耗的水量以维持水位。
1.2 水质和生长性能测定方法每2天使用WTW多参数便携水质分析仪(Multi 3430,WTW,德国)测定pH、溶解氧和温度。使用次溴酸钠氧化法测定总氨氮(TAN),N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定NO2--N,紫外分光光度法测定NO3--N。
实验结束前一天停止喂食,取样时记录每个养殖桶中的罗非鱼数量及体质量,生长指标使用的计算公式:
式中:SR为成活率,%;WGR为增重率,%;FD为试验结束密度,kg/m3;SGR为特定生长率,%/d; FCR为饵料系数;N1为放养尾数;N2为收获尾数;t1和t2分别为实验第1天和最后1天;W1和W2为实验第1天和实验最后1天的平均体质量,g;F为整个实验期间食物总摄入量,g;V为养殖桶的养殖水体的体积,L。
1.3 样品的采集使用丁香酚(75 mg/mL)麻醉鱼,每个养殖桶取5尾鱼,从尾静脉中抽血1.5 mL放到有抗凝血剂的PE管中,在4 ℃的冰箱中静置4 h后,4 ℃下6 000 r/min离心5 min,取血清。用吸水纸将肝脏和肠道表面的水分吸干,分别剪碎后放入-80 ℃冰箱中保存。
每个养殖桶取50 mL水样,经过0.22 μm无菌微孔滤膜抽滤后,-80 ℃保存。每个养殖桶取5尾鱼,使用质量浓度为75%的乙醇擦拭试验鱼体表,使用无菌水冲洗出肠道内容物装入2 mL的无菌离心管中,-80 ℃保存。实验结束后将无菌离心管送至上海美吉生物科技有限公司进行DNA的抽提和测序。
1.4 酶活性的测定用南京建成生物工程研究所的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP),丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒测定血清和肝脏中的这两种酶活性。其他酶活性的测定由上海哈灵生物科技有限公司完成,蛋白酶(protease, PTS),淀粉酶(amylase, AMS),脂肪酶(lipase, LPS),溶菌酶(lysozyme, LZM),免疫球蛋白M(immunoglobulin M, lgM),皮质醇(cortisol)等采用相关的ELISA检测试剂盒检测。
1.5 DNA的抽提和高通量测序使用FastDNAⓇ Spin Kit for Soil(MP Biomedicals, USA)DNA抽提试剂盒按照使用说明提取样品中细菌的DNA。使用超微量分光光度计(NanoDrop2000, Thermo Fisher Scientific, USA)测定提取到的细菌总DNA的浓度和纯度。
PCR扩增16S rRNA(16S V3-V4高变区)使用的引物为338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。
1.6 生物信息学分析原始测序使用Trimmomatic软件进行质控,原始序列的拼接使用FLASH软件。使用UPARSE软件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类,使用UCHIME软件剔除嵌合体,得到OTU代表序列。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,在门(Phylum),纲(Class), 属(Genus)水平上统计各样本的群落物种组成。使用ACE,Chao,Sobs和Shannon,Simpson分别计算细菌群落的α多样性的丰富度和多样性。使用Bray-Curtis距离算法对样本群落距离矩阵进行聚类分析,构建样本层级聚类树。对一系列特征值和特征向量进行排序,选择最主要的特征值,使用Bray-Curtis距离算法进行主坐标分析(Principal co-ordinates analysis, PCoA分析)。使用Lefse物种差异判别分析找到丰度有差异的微生物类群,水体样本和肠道中LDA判别分析分值阈值为3.5,多组比较策略均为All-against-all。
1.7 数据处理采用Excel软件对数据汇总归纳整理,并使用GraphPad Prism 8软件进行图表的绘制。实验结果数值以平均值±标准差(Mean±SD)的形式表示,采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),差异性显著水平为P<0.05。
2 结果与分析 2.1 养殖水质的变化如图 1a所示,N组TAN的浓度在第3天达到峰值1.43 mg/L,在第7天降到0.019 mg/L,此后始终维持在最低水平。H组TAN在第5天降低到0.045 mg/L。N组NO2--N在第5天达到峰值,此后浓度一直维持在较低水平(图 1b)。NO3--N的浓度在整个养殖周期一直是积累的状态(图 1c)。两组的DO保持在7.82 mg/L以上,pH为7.64~8.32,温度为23.7~26.7 ℃(表 1)。
N组和H组的罗非鱼的成活率分别为86.67%±0.02%和88.00%±0.04%,无显著性差异。饵料系数(FCR)、末均质量(FW)、终末密度(FD)、增重率(WGR)和特定生长率(SGR)无显著差异(P>0.05)。见表 2。
由表 3可知,H组罗非鱼的血清中皮质醇(cortisol),溶菌酶(lysozyme, LZM),免疫球蛋白M(immunoglobulin M, lgM),丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)均显著高于N组(P<0.05)。两组的血清中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)存在显著性差异(P<0.05),H组罗非鱼血清中AKP活性高于N组29.60%。生活在异养型组中的罗非鱼具有更高的非特异性免疫能力。
由表 4可知,H组罗非鱼肠道的蛋白酶(protease, PTS)活性高于A组14.02%,存在显著性差异(P<0.05)。但是N组罗非鱼肠道的淀粉酶(amylase, AMS)和脂肪酶(lipase, LPS)的活性均显著高于H组(P<0.05)。
由表 5所示,各指标反映肝脏的抗氧化能力,H组的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH),苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH),果糖1, 6二磷酸酶(fructose-1, 6-diphosphatase, FDPase),还原性谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)活性高于A组(P<0.05),其中FDPase,H组活性高于N组50.39%,只有丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量N组高于H组(P<0.05)。总体上来说H组的罗非鱼肝脏的抗氧化能力高于N组中的罗非鱼。
12个样品所测的原始序列经过去杂、拼接质控然后去除嵌合体后一共获得有效序列293 928条。使用Uparse(vsesion 7.1)软件,对有效序列按照97%的相似度共聚类为1 672个OTUs。Shannon指数反映的细菌群落多样性在水中为4.28~5.20,在肠道中为3.53~3.61;反映群落多样性的指数Chao在水中的范围为950.5~1 048.93,在肠道中的范围为432.71~517.89(表 6)。这些结果表明肠道微生物的丰富度和多样性都要低于生物絮团养殖水。N组罗非鱼肠道微生物的丰富度指数均大于H组,在水体中,N组的丰富度指数也均大于H组。由此可以推测,养殖水环境的微生物对养殖生物的肠道微生物产生了一定程度的影响。
鱼类肠道中N组和H组获得的OTU数分别为1 197和1 070个,养殖水体中N组和H组获得的OTU数分别为713和579个。N组肠道独有的OTU数为115个,占N组肠道OTU数的21.8%,H组肠道独有的OTU数为59个,占H组肠道OTU数的10.2%。N组中肠道与水体共有的OTU数为67个,占N组肠道OTU数的9.4%,H组中肠道与水体共有的OTU数为54个,占H组肠道OTU数的9.3%,N组中肠道和水体共有的OTU数大于H组中肠道和水体共有的OTU数。
进行多变量统计分析来比较肠道和养殖水细菌群落的整体结构。通过基于Bray-Curtis距离算法进行主坐标分析(PCoA),如图 3,可以看出养殖水环境和肠道细菌群落分别聚集到主坐标的不同位置,表明硝化型生物絮团水中和异养型生物絮团水中的细菌群落划分明确,在不同的养殖环境中,罗非鱼肠道微生物群落也出现了明确的划分。
N组水体中占比前4的优势门为变形菌门,绿弯菌门,拟杆菌门,浮霉菌门;H组水体中占比前4的优势门为变形菌门,绿弯菌门,拟杆菌门,放线菌门。罗非鱼肠道占比前5的优势门均为变形菌门,放线菌门,绿弯菌门,厚壁菌门,衣原体门。变形菌门是各组中最主要的菌群(图 4)。
在纲水平上,N组水体中丰度占比前5的纲是拟杆菌纲(Bacteroidia),α-变形菌纲(Alphaproteobacteria),厌氧绳菌纲(Anaerolineae),γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)。H组水体中丰度占比前5的纲是α-变形菌纲,拟杆菌纲,放线菌纲,厌氧绳菌纲,γ-变形菌纲(图 4)。
2.4.5 物种差异分析LEfSe采用线性判别分析可以找到丰度显著性差异的类群。LDA判别分析分值阈值为3.5,在N组罗非鱼肠道存在差异的细菌有3种如:脱硫弧菌属(Desulfovibrio),甲壳菌科(Chitinophagaceae),类诺卡氏属(Nocardioides);在H组罗非鱼肠道存在差异的细菌有26种如:Micropruina(属水平),丙酸杆菌目(Propionibacteriales),丙酸杆菌科Propionibacteriaceae,潮湿球菌科(Nakamurellaceae),Nakamurella(属水平),Frankiales(目水平)等。LDA判别分析分值阈值为3.5,在N组养殖水中存在差异的细菌有43种,例如厌氧绳菌纲(Anaerolineae),γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),暖绳菌科(Caldilineaceae),暖绳菌目(Caldilineales),δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)等;H组养殖水中存在差异的细菌有17种Geminicoccaceae(科水平),Candidatus_Alysiosphaera(属水平),立克次体目(Tistrellales),α-变形菌纲(Alphaproteobacteria),放线菌门(Actinobacteria),放线菌纲(Actinobacteria)等(图 5)。
表 7显示了水体和肠道中潜在病原菌的差异。分枝杆菌属(Mycobacterium)是水体和肠道中最主要的潜在致病菌。Diplorickettsiaceae和邻单胞菌属(Plesiomonas)在水体和肠道中均保持在较低水平。潜在致病菌除梭菌属(Clostridium)外其余如气单胞菌属(Aeromonas),黄杆菌属(Flavobacterium)等7种潜在病原菌在鱼类肠道中含量水平N组均高于H组,在水体样本中也是同样的情况。注释结果发现,H组幼鱼肠道含有的γ-变形菌纲的细菌较为单一,大部分属于肠杆菌目肠杆菌科,N组幼鱼肠道γ-变形菌纲主要有肠杆菌目、交替单胞菌目、着色菌目、海洋螺菌目、假单胞菌目、硫发菌目和弧菌目等。
水体中有毒含氮化合物维持在较低的浓度水平。实验过程TAN的浓度水平与EMERENCIANO等[9]报道的0.01~1.13 mg/L具有相似性。图 1显示,在实验初期N组出现了TAN和NO2--N的积累,说明水中自养硝化细菌可能在功能的建立期,无法快速处理有毒含氮化合物。在7 d内,H组TAN和NO2--N都可以快速降到较低的水平,这可能是因为碳源的加入提高了水体的碳氮比,使得异养细菌大量增殖,从而将溶解的氮化合物转化为絮凝物[10]。
AVNIMELECH[11]研究发现,生物絮团中的养殖生物可以直接摄食生物絮团作为额外的食物,其中的占比更是达到了日摄食量的50%。表 2可以看出H组的成活率,饵料系数、末均质量、终末密度、增重率和特定生长率都优于N组。这是由于碳源的添加促进了异养菌的大量繁殖,通过吸收有机碳源合成自身的菌体蛋白,提供蛋白源[12]。张亚卓等[13]测定低盐度条件下以糖蜜为碳源的生物絮团的营养成分粗蛋白含量达34.38%。BAKHSHI等[14]在生物絮团养殖鲤的过程中添加玉米淀粉,显著提高了鲤增重率以及特定生长率。李朝兵等[15]使用生物絮团养殖小规格罗非鱼,发现絮团组终末质量和增重率都要优于清水组。由于罗非鱼是杂食性鱼类,可以有效地利用生物絮团作为食物,使得生物絮团养殖罗非鱼取得了广泛的应用[16],但是在草鱼[17](草食性鱼类)和杂交醴[18](肉食性鱼类)的养殖中提高C/N并不能显著影响鱼类的生长。本研究中异养型组的养殖效果要优于硝化型组,其中异养型组的总悬浮颗粒物浓度高于硝化型组,可以说明罗非鱼可以较好地摄食和利用生物絮团。
3.2 两种类型生物絮团系统对罗非鱼生理功能的影响本实验中异养型组罗非鱼各项生理指标普遍优于硝化型组罗非鱼,这可能是异养型生物絮团中的菌体蛋白和附着的微生物更有利于生物的健康。WILÉN等[19]研究表明,碳源的添加使得异养细菌大量繁殖,并且含有较高的菌体蛋白。
在消化酶方面H组的蛋白酶活性高于N组,淀粉酶和脂肪酶则相反,推测其原因可能是不同类型的生物絮团营养成分含量不同导致,自养型生物絮团具有较低的蛋白质含量和较高的脂质和碳水化合物的含量[20-21],而异养型生物絮团则具有较高的蛋白质和较低的脂质含量[3]。XU等[21]的研究证明生物絮凝剂具有胞外蛋白酶和淀粉酶的活性。有其他研究发现生活在BFT中的养殖生物其消化酶得到改善,在C/N为15和20的BFT系统中发现饲养的南美白对虾幼体消化腺中蛋白酶活性有所提高。
鱼体中的血清皮质醇能够促进脂肪的分解和糖类的合成,能够使机体在应激条件下获得足够的能量,来抵御外界环境的变化。水产动物自身免疫系统发育不健全,主要依靠非特异性免疫来抵抗外界的病原体[22]。溶菌酶在鱼类免疫活动中发挥着重要的作用,可以增强其他免疫因子对于细菌的敏感性,与其他免疫因子合作抵抗细菌的入侵,还可以清除残留的细菌残渣[23],本实验中H组罗非鱼的溶菌酶含量显著高于N组,说明异养型生物絮团的成分被鱼体摄入后可以增强抵御外部细菌的入侵。这与李朝兵等[15]在生物絮团中养殖鳙鱼的研究结果相似,鳙鱼的血清溶菌酶(LYS)显著提高,机体免疫力得到增强。
3.3 水体微生物群落结构对肠道微生物群落结构的影响生物絮团养殖环境中微生物群落结构复杂,水生生物由于其消化道短,肠道中的菌群结构更容易受到外界环境的影响。从表 6可以看出N组罗非鱼肠道和水体比H组拥有更高的物种丰富度,可以推测水环境中的微生物在一定程度上影响了罗非鱼肠道菌群的结构。WEBSTER等[24]将野生和人工繁殖的大西洋鲑转移到3种常见的养殖环境中,通过易位养殖实验发现鱼类肠道微生物群落的丰富度和多样性与养殖水环境有关。环境对于肠道微生物群落结构的影响巨大,在相同的环境下微生物进入的顺序也会影响微生物群落的结构[25]。早先定植或原生的微生物群落会抑制或限制后进入环境的微生物的生态位。在微生物定植和建立的阶段,微生物组成是动态变化的,十分容易受到周围环境条件和微生物群落的影响[26]。ABDULR等[27]研究发现无论育苗阶段是在不同的环境中还是遗传因素的影响,在转移到相同的养殖环境后,随着鱼类的生长,肠道菌群都会变得极为相似。生命早期环境的变化对微生物结构产生重要影响[28],因此,在鱼类生命早期调节微生物群落结构来改善其健康状况和抗病能力会有利于幼鱼的生长。
在肠道和养殖水中发现的主要门类是拟杆菌门,厚壁菌门,放线菌门,变形菌门,这与SUN等[29]的研究相似,在不同鱼类中这些优势菌群在肠道菌群中占90%以上,并影响着鱼类肠道的功能[30]。从Shannon和Simpson指数可以看出与生物絮团养殖水中的微生物多样性相比,罗非鱼肠道微生物多样性要低。SUN等[29]在研究中华绒螯蟹肠道微生物与养殖水和池塘沉积物微生物的关系时发现蟹肠OTU的多样性显著低于环境微生物的多样性。可以假设由于肠道氧气含量,pH等环境因素和自身免疫的影响会对来自环境的微生物进行选择,说明水中的微生物并不会全部在罗非鱼肠道中被吸收和定植。
3.4 水体中潜在病原菌对肠道病原菌的影响LYONS等[31]和YE等[32]研究发现,宿主体内的优势菌群的失衡可能会导致宿主疾病的发生。从两个组的肠道中可以看出在门水平上变形菌门所占丰度相对较高(N组30.12%;H组26.71%),变形菌门包括一些病原菌,例如大肠杆菌,假单胞菌和弧菌等,因此变形菌门在肠道所占丰度的提高可能反映了肠道菌群的失衡[33]。注释结果发现,N组幼鱼肠道γ-变形菌纲主要有肠杆菌目、交替单胞菌目、着色菌目、海洋螺菌目、假单胞菌目、硫发菌目、弧菌目等。有研究发现,在肠杆菌科、假交替单胞菌目和弧菌目含有许多致病菌,值得我们注意。枯草芽孢杆菌可以调节宿主肠道健康和宿主的免疫系统。H组枯草芽孢杆菌丰度高于N组。在肠道样本中发现了潜在致病菌分枝杆菌属(Mycobacterium),是一种典型的抗酸细菌,可以引起鱼类全身的慢性感染[34],黄杆菌属为条件致病菌,这两种细菌的数量在硝化型组鱼体肠道中要高于异养型组。硝化型组水体和肠道中的病原菌数量普遍高于异养型组,推测可能是水体中的病原菌进入肠道,从而增加了肠道致病菌的数量。
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