2. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306
在水产养殖过程中降低过剩氮素一直是环境保护研究的热点,生物絮凝技术通过提高水体的碳氮比,促进异养细菌的生长,形成了具有特定结构和功能的生物絮团,并通过菌群的同化和硝化作用有效降低水体氮素、提高了饵料利用率、促进养殖对象的生长。在生物絮凝养殖系统构建过程中,由于异养细菌生长远快于自养细菌,养殖水质常常伴随着氨氮和亚硝酸盐的积累,LUO等[1]认为在利用生物絮凝技术进行养殖以前有必要增加生物絮凝系统启动阶段,以此来稳定微生物群落和养殖水质。生物絮凝系统中氨氮和亚硝氮维持低浓度时再进行养殖,避免对养殖对象造成危害。
有关生物絮凝系统构建过程中的研究主要为碳源的添加方式和控制总悬浮颗粒物(total suspended solids, TSS)浓度两个方面。柳泽锋等[2]认为以溶解性有机碳浓度/总氮浓度为15的比例添加葡萄糖,以及在系统运行期间按溶解性总氮浓度/氨氮浓度为6的比例添加葡萄糖能够更好地形成生物絮凝系统;陈晓庆[3]认为碳氮比(Carbon/Nitrogen,C/N)为20能很好地构建生物絮凝系统,生物絮凝系统构建过程中不同的TSS对生物絮凝启动效率影响不明显。
目前以益生菌为添加剂,探究益生菌对生物絮凝系统构建过程以及絮团的菌群结构、营养成分的研究较少。研究[4]表明以植物乳杆菌为添加剂,在pH 8.5、温度35 ℃、好氧条件下生物絮凝系统达到稳定的时间最短,在污水处理系统中通过添加特定功能菌可以有效改善出水水质[5],提高系统抗负荷冲击能力和系统稳定性[6],以及工作效率[7]。生物絮凝养殖系统中高浓度固体悬浮物的水体环境适合枯草芽孢杆菌等异养细菌生长,研究[8]表明在生物絮凝养殖系统中添加复合芽孢杆菌能促进絮团上芽孢杆菌的生长。CRAB等[9]发现添加枯草芽孢杆菌影响了生物絮体粗灰分含量, 枯草芽孢杆菌在水产养殖中应用广泛,且具有很好的益生效果。本实验通过以枯草芽孢杆菌作为生物絮凝系统构建过程的添加剂,探究枯草芽孢杆菌添加剂在生物絮团上的富集效果,以及枯草芽孢杆菌添加剂量对絮团营养组成和菌群结构的影响,为生物絮凝系统功能优化与调节提供新的策略。
1 材料与方法 1.1 实验装置与材料实验在上海海洋大学循环水养殖工程与技术实验室进行。生物絮团反应器为12个有效容积为5 L的有机玻璃圆锥体反应器,12个反应器搭配曝气量为100 L/min的气泵(ACO-008),每个反应器中放入3个曝气石,均匀曝气,以12 W日光灯作为光源。
1.2 实验设计实验开始时按照系统DOC/TN为15添加葡萄糖,并在各个桶中加入凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)粉料,每个反应器的饲料投加量为700 mg/L,进行生物絮团培养。其主要成分:粗蛋白≥48%,粗纤维≤12%,粗脂肪≥4%,粗灰分≤17%,赖氨酸≥2.2%,水分≤12%,钙≤5%,总磷≥1.0%(数据由厂家提供)。实验周期为33 d,实验期间维持CaCO3碱度为150 mg/L。依据枯草芽孢杆菌的添加剂量将12个反应器分为4组,每组3个平行。A组的枯草芽孢杆菌添加剂量为106 CFU/mL,B组的枯草芽孢杆菌添加剂量为105 CFU/mL,C组枯草芽孢杆菌添加剂量为104 CFU/mL,添加频率为3 d/次,D组不添加枯草芽孢杆菌。
1.3 菌株来源与计数实验用枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种网。以2%的接种量将种子液接入100 mL的2216E培养液中,进行摇瓶发酵培养。培养时间为20 h。采用LB培养基平板计数法。按照稀释倍数10、102、103、104、105、106、107进行稀释,用涂布棒快速地均匀涂布稀释后的菌液,每个稀释度做2个重复,培养20 h,采用30~300 CFU/mL的平板计数,根据菌落数目和稀释倍数计算出待测样含菌数。
1.4 水质指标的测定每天上午9点进行取样,检测水体的温度(T)、pH、溶解氧(DO),并测定总氮(TN)、氨氮(TAN)、亚硝酸氮(NO2--N)、硝酸氮(NO3--N),水样经0.45 μm滤膜抽滤后测定三态氮。TN采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法(上海尤尼柯UV 2 000分光光度计,中国)测定。其中NO2--N含量采用重氮-偶氮法测定,NO3--N含量采用锌镉还原法测定,TAN含量测定采用次溴酸钠氧化法,碱度采用酸碱滴定指示法测定,每6天测定1次。
1.5 絮团指标的测定实验至第33天时,取2 L生物絮团反应器水样,沉淀30 min后倒掉上清液,取下层生物絮团。絮团经65 ℃烘干后使用碳、氮元素分析仪(Elmenter ELMENTER VARIO MAX,德国)测定絮团中碳、氮元素质量[10], 粗蛋白含量为氮元素含量乘以6.25[11]。5 min内絮团沉降体积(floc volume,FV)使用英霍夫式锥形管取1 L水样静置5 min后读取。粗灰分根据GB/T 6438—2007[12-13]称重法进行测量。总脂肪采用氯仿-甲醇法[14]进行测定[15]。水解氨基酸参照GB/T 5009.124—2003[16],上机测定(日立,L-8800, 氨基酸分析仪)。
1.6 菌群多样性检测实验至第33天时,取50 mL水样经0.22 μm无菌微孔滤膜过滤用以收集浮游细菌, 将滤膜剪碎置于5 mL无菌离心管中,于-80 ℃冰箱保存,送至上海美吉生物有限公司进行检测。
细菌DNA的提取与检测:使用E. Z. N. A.Soil DNA Kit (Omega, 美国)试剂盒进行DNA提取;将提取的DNA样品利用1%的琼脂糖电泳检测是否有降解及杂质;Nano Photometer分光光度计检测样品纯度;Qubit 2.0 Flurometer检测DNA样品浓度。
16S rDNA文库制备:取10 ng的DNA模板,对目的区域进行扩增:根据测序区域的不同,选择对应区域的扩增引物:V3区引物为338F-533R,V3+V4区引物为341F-805R,V6区引物为967F-1046R。
库检与测序:文库构建完成后,先使用Qubit 2.0进行初步定量,稀释文库至1 ng/μL,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪,Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN进行qPCR,对文库的有效浓度进行准确定量,以保证文库质量。检测合格的文库后,采用Miseq进行测序,测序策略为PE250。
1.7 数据处理实验数据采用Excel软件进行结果统计,由Origin 8.5软件进行相关图表的绘制。实验数值用平均值±标准差(Mean±SD)表示,采用SPSS 19.0统计软件对数据进行ANOVA单因素方差分析,P<0.05为差异性显著。
2 结果 2.1 絮团培养期间三态氮以及溶解氧、pH的变化如表 1所示,实验期间,各处理组的pH为8.07~8.45,溶解氧为7.28~7.96 mg/L。D组的溶解氧低于其他各处理组。生物絮凝系统构建阶段,各组水温维持在21.2~26.5 ℃。枯草芽孢杆菌添加剂量对TSS浓度和FV-5min影响显著(P<0.05),A组TSS和FV-5min都显著低于对照组D组(P<0.05)。
如图 1所示,实验前期,碳源逐渐被消耗,生物絮团中同化作用较弱,反应器中氨氮和亚硝氮出现积累。随着硝化细菌的富集,氮素转化以硝化作用为主导,氨氮和亚硝氮稳定维持在低水平,硝态氮逐渐积累。枯草芽孢杆菌添加剂量对三态氮最高浓度无显著影响(P<0.05)。絮团培养过程中,枯草芽孢杆菌添加剂量对各实验组三态氮浓度变化趋势有影响,枯草芽孢杆菌添加剂量对各组氨氮浓度和亚硝酸态氮升高至最高浓度的时间有影响。A组在第8天氨氮浓度最高,对照组在第11天氨氮浓度最高。氨氮浓度升高至最高浓度的时间受枯草芽孢杆菌添加剂量影响:枯草芽孢杆菌添加剂量越高,氨氮最高浓度出现时间越早。亚硝酸态氮浓度的动态变化特征与氨氮浓度变化特征一致:A组在第17天亚硝酸态氮浓度最高为17.98 mg/L,B组在第22天亚硝酸态氮浓度最高为18.75 mg/L,C组在第23天亚硝酸态氮浓度最高为17.13 mg/L,D组在第24天亚硝酸态氮浓度最高为17.78 mg/L。各实验组亚硝酸态氮降至低水平时间有区别:A组第24天,B组第31天,C组第31天,D组第30天。结果表明,枯草芽孢杆菌添加剂能缩短生物絮凝系统构建时间。
生物絮凝系统构建完成后,对各组生物絮团进行营养成分检测,结果如表 2所示,不添加枯草芽孢杆菌组的粗灰分含量高于其他3个实验组,粗灰分含量为30.40%±1.87 %。枯草芽孢杆菌添加组的粗蛋白含量显著高于不添加枯草芽孢杆菌组(P<0.05),且粗蛋白含量随着枯草芽孢杆菌添加浓度的升高而升高,A组粗蛋白含量最高为34.45%±1.81%。添加剂量为106 CFU/mL实验组与添加剂量为105 CFU/mL组的絮团粗蛋白含量差异不显著(P>0.05)。
生物絮凝系统构建完成后,对絮团17种氨基酸含量进行检测,结果如表 3所示。枯草芽孢杆菌添加剂量对絮团中组氨酸的含量无显著影响(P>0.05),对其余16种氨基酸含量影响显著(P<0.05)。
枯草芽孢杆菌添加组生物絮团中天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸含量高于不添加枯草芽孢杆菌实验组。B组絮团中丝氨酸、谷氨酸、胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸8种氨基酸含量高于A组。A组絮团中天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸含量高于B组。A组生物絮团中总必需氨基酸和总非必需氨基酸含量均显著高于C、D组(P<0.05),实验结果表明絮团培养过程中添加枯草芽孢杆菌有利于提高生物絮团中各氨基酸含量。
2.3 絮团微生物多样性与丰度生物絮凝系统构建完成后,利用高通量测序技术对生物絮团的微生物菌群结构与多样性进行检测,结果见表 4。各组OUT数随着枯草芽孢杆菌添加剂量的增加而减少,最高浓度枯草芽孢杆菌添加组A组具有最低OUT数(615)。通过比较群落丰度指数和Shannon指数可知,均为A>B>C。
对生物絮团门水平优势菌群进行分析,结果如表 5所示,絮团优势菌为厚壁菌门(Firmicutes)、绿湾菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、黏球菌门(Myxococcota)。5种优势菌占絮团总菌相对丰度的85.82%~91.44%。B, C,D组中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度占比最高。
对生物絮团属水平优势菌群进行分析,结果如表 6所示:芽孢杆菌属为絮团主要优势群属,相对丰度占比最高(31.98%)。A组相对丰度前5优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)31.98%、囊菌属(Nannocystis)10.56%、微杆菌属(Microbacterium)8.46%、固氮螺菌属(Azospirillum)1.59%、马赛菌属(Massilia)1.41%。B组优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)20.01%、囊菌属(Nannocystis)2.62%、微杆菌属(Microbacterium)5.25%、固氮螺菌属(Azospirillum)6.95%、暖绳菌属(Caldilineaceae)13.65%。C组优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)19.64%、囊菌属(Nannocystis)9.09%、微杆菌属(Microbacterium)3.11%、固氮螺菌属(Azospirillum)13.64%、暖绳菌属(Caldilineaceae)3.17%。D组优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)12.03%、囊菌属(Nannocystis)13.92%、微杆菌属(Microbacterium)18.99%、固氮螺菌属(Azospirillum)0.97%、暖绳菌属(Caldilineaceae)3.02%。絮团芽孢杆菌属含量与枯草芽孢杆菌添加剂含量呈正相关。絮团芽孢杆菌相对丰度分别为:A组31.98%、B组20.01%、C组19.64%、D组12.03%。
生物絮凝系统构建过程中,枯草芽孢杆菌添加剂量对生物絮团门水平菌群相对丰度的影响差异显著(P<0.05),B组变形菌门(Proteobacteria)相对丰度显著高于其他处理组(P<0.05)。见图 2。
枯草芽孢杆菌添加剂浓度对生物絮团属水平菌群相对丰度影响显著(P<0.05)。固氮螺菌属(Azospirillum)、马赛菌属(Massilia)、剑菌属(Ensifer)、副球菌属(Paracoccus)在各处理组中差异显著。C组固氮螺菌属(Azospirillum)相对丰度显著高于其他组(P<0.05),B组马赛菌属(Massilia)相对丰度显著高于其他组(P<0.05),C组剑菌属(Ensifer)相对丰度显著高于其他组(P<0.05),B组副球菌属(Paracoccus)相对丰度显著高于其他组(P<0.05)。
3 讨论 3.1 枯草芽孢杆菌添加剂量对生物絮凝系统启动过程中水质的影响实验中,pH的平均值随着枯草芽孢杆菌添加剂量的升高而降低(A组>B组>C组>D组)。研究[5]表明, 生物絮凝系统中pH降低与细菌同化作用消耗碱度有关。可能原因是在生物絮凝系统启动过程中,絮团枯草芽孢杆菌附着浓度高的实验组絮团生物活性更强,导致消耗水体总碱度更多。在生物絮凝系统启动过程中,溶解氧和水温均能维持在安全范围以内,溶解氧为7.28~7.98 mg/L,水温为21.2~26.3 ℃。
氨氮和亚硝酸氮是水产养殖过程中重要的指标,在利用生物絮凝系统养殖过程中为了避免高浓度亚硝酸氮和氨氮峰对养殖品种的毒害作用,有必要进行生物絮凝的启动过程,等生物絮凝系统亚硝态氮、氨氮降至低水平时,再进行养殖[2]。实验结果表明,通过对生物絮凝系统启动过程添加枯草芽孢杆菌,缩短了系统稳定时间。可能原因是高浓度枯草芽孢杆菌添加剂缩短了前期生物絮团形成时间。为缩短生物絮凝系统稳定时间,建议枯草芽孢杆菌添加剂量为106 CFU/mL。枯草芽孢杆菌添加剂量对生物絮凝系统构建过程中氨氮和亚硝酸盐的均值有影响,各组氨氮浓度均值:A组(2.13±4.56) mg/L、B组(3.02±5.15) mg/L、C组(2.92±4.85) mg/L、D组(2.27±4.44) mg/L。亚硝酸氮浓度的均值:A组(6.24±7.32) mg/L、B组(8.25±7.90) mg/L、C组(7.33±6.86) mg/L、D组(7.51±7.31) mg/L。这与鲁璐等[17]的研究结果一致,向生物絮团反应器中添加一定浓度的复合芽孢杆菌能有效地降低水体中的氨氮浓度。孙运忠等[18]在日本囊对虾(Penaeus japonicus)养殖过程中添加枯草芽孢杆菌,实验结果显示,养殖过程中添加枯草芽孢杆菌的实验组水体中无机氮浓度和化学需氧量(COD)远低于对照组。这表明在养殖水体中枯草芽孢杆菌可有效降低水体中氨氮浓度。
3.2 枯草芽孢杆菌添加剂量对絮团营养组成的影响研究[19]表明絮团的粗蛋白含量为38.5%~57.4%,粗灰分<20%,粗脂肪为20%~35%, 能量在20~25 kJ/g,本研究表明枯草芽孢杆菌添加剂对生物絮团的粗蛋白含量、氨基酸含量和絮团C/N比影响显著(P<0.05)。A组为枯草芽孢杆菌添加剂量最高组,粗蛋白含量最高。此结果与SCHNEIDER等[20]和李莉等[21]得出的水体中提高异养细菌的含量,可以起到提高水体蛋白质和减少水体中营养物质浪费的效果一致, C组具有最高粗灰分含量,此结果与CRAB等[9]研究结果不一致,CRAB等通过对絮团接种不同浓度的枯草芽孢杆菌,发现接种枯草芽孢杆菌的絮团粗灰分含量显著高于其他实验组,可能原因是本研究中培养絮团的底物粗灰分含量不一样所致。对比各组絮团氨基酸含量发现,枯草芽孢杆菌添加剂量为106 CFU/mL实验组与枯草芽孢杆菌添加剂量为105 CFU/mL实验组各氨基酸含量均高于其他实验组。D组絮团中异亮氨酸显著高于其他各实验组,可能与絮团中优势微生物的氮代谢途径有关,具体作用机理有待探究。相关研究[22-23]也表明絮团菌群结构中的优势微生物会影响絮团的营养成分的组成,其原因是不同的优势微生物具有不同的胞外聚合物[24-25],从而影响了絮团的营养成分组成。结果表明利用生物絮凝技术进行水产养殖时,添加枯草芽孢杆菌有利于为养殖对象提供蛋白源。
3.3 枯草芽孢杆菌添加剂量对絮团微生物的影响芽孢杆菌在修复水体方面具有很高的应用价值[26],此外芽孢杆菌常用于水体中氨氮的去除研究[27],有学者[28]通过投加功能菌,优化污泥菌群体系,起到很好的效果。通过添加益生菌形成的生物絮团能降低养殖水体中的致病菌,促进有益微生物的生长,提高絮体中有益菌的比例[29-31]。对絮团微生物菌群进行高通量测序分析,结果表明枯草芽孢杆菌添加剂量最高组A组菌群丰度指数高于其他实验组。通过对各实验组差异微生物进行比较分析,结果表明变形菌门在各组间相对丰度差异显著(P<0.05),属水平上固氮螺菌属(Azospirillum)、马赛菌属(Massilia)、剑菌属(Ensifer)、副球菌属(Paracoccus)在各处理组中相对丰度差异显著(P<0.05)。而门水平的优势物种为厚壁菌门(Firmicutes)、绿湾菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、黏球菌门(Myxococcota)。絮团门水平微生物组成情况与陈晓庆[3]研究结果一致。由此可知,对生物絮凝系统启动阶段枯草芽孢杆菌添加剂没有影响絮团微生物群落结构,原因可能是在生物絮凝系统启动阶段,各组水质环境因子差异不显著有关。枯草芽孢杆菌对各组间优势物种相对丰度有显著影响(P<0.05)。属水平下,絮团芽孢杆菌相对丰度与枯草芽孢添加剂量呈正相关。芽孢杆菌相对丰度:A组31.98%, B组20.01%, C组19.64%, D组12.03%。可知在生物絮凝系统构建阶段,枯草芽孢杆菌添加剂能在絮团上富集生长,且生长富集效果与枯草芽孢杆菌添加剂量呈正相关。添加更高剂量的枯草芽孢杆菌对絮团菌群微生物的影响还有待探讨。
4 结论当枯草芽孢杆菌添加剂量为104 CFU/mL~106 CFU/mL时,枯草芽孢杆菌能在絮团上有效富集,生物絮团上的芽孢杆菌相对丰度随着枯草芽孢杆菌添加剂量的增加而增加,固氮螺菌属(Azospirillum)、马赛菌属(Massilia)、剑菌属(Ensifer)、副球菌属(Paracoccus)在各处理组中差异显著。枯草芽孢杆菌添加剂能降低生物絮凝系统构建过程中氨氮浓度、缩短生物絮凝系统启动时间、提高絮团粗蛋白含量更加有利于为养殖对象提供蛋白源。
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