2022,
Vol. 31
2. 厦门大学 海洋与地球学院, 福建 厦门 361005;
3. 中国水产科学研究院珠江水产研究所, 广东 广州 510380
质子转运载体15基因家族(Solute carrier15 family, Slc15)的主要作用是利用质子梯度和负膜电位进行二/三肽和拟肽分子的跨膜转运，因此也被称为寡肽转运载体基因家族(proton-coupled oligopeptide transporters, POTs)[1]。slc15基因家族在鱼类中共有5个成员，分别为slc15a1 (PEPT1)、slc15a2 (PEPT2)、slc15a3 (PHT2)、slc15a4 (PHT1)和slc15a5 [2]。其中对slc15a1和slc15a2的组织分布、底物特性和转运功能的研究较早。slc15a1广泛分布在肠上皮细胞的刷状缘膜以及肾近曲小管细胞等多种组织中，是一个高容量、低亲和力质子转运载体。在消化道中，slc15a1小肽转运系统与游离氨基酸的吸收效率相比，具有转运速度快、耗能低、不易饱和的特点[3]，会优先吸收含L型氨基酸的二肽和三肽[4]及各种类型的模拟肽，如β-内酰胺类抗生素[5]、血管紧张素转换酶抑制剂、肾素抑制剂、氨肽酶抑制剂及许多药物前体[6]。slc15a1 mRNA编码的蛋白质在胞外具有多个糖基化位点，亲水环和胞外环之间分别穿插着一个蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和一个蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的磷酸化位点，可产生可逆的磷酸化反应来调节转运功能的基因[7]。此外，slc15a1还可激活NOD受体依赖性信号通路，并通过介导Tri-DAP和MDP转运导致促炎因子的释放，使得促炎因子诱导多种炎性细胞因子基因的转录，引起机体免疫应答[8]。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)的研究中，slc15a1在抗病毒和抗菌免疫应答中起重要作用[9]，并通过与USP18的共表达显著提高GlyGly (Glycine-Glycine)转运速率，上调自身活性。
2003年VERRI等[10]在斑马鱼(Danio rerio)体内发现了slc15a1。随后，不少学者也在泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)[11]、欧洲黑鲈(Dicentrarchus labrax)[12]、大西洋鲑(Salmo salar)[13]、鲤[14]、鳜(Siniperca chuatsi)[15]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[16]等物种体内陆续发现了该基因。在大西洋鲑的研究中，slc15a1a与slc15a1b具有相同的表达模式，但在机体转运动力、底物特异性和运输效率以及基因的表达水平上均有所不同[13]。在斑马鱼中，slc15a1a与slc15a1b能够共同表达，在促进机体早期发育阶段对二/三肽的摄取中发挥功能[17]。在罗非鱼的研究中，当受到高盐度胁迫时slc15a1a与slc15a1b具有相似的组织表达趋势，表明该基因对机体的盐度耐受性具有一定影响[18]。
鲤是鲤科鱼类中最具代表性的鱼类之一，在全球淡水养殖产业中占有很高比重，具有非常重要的商业价值[19]。另外，鲤作为一种重要模式物种，被广泛应用于发育生物学、免疫学、环境毒理学、生理学及进化基因组学等领域的研究[20-21]。近年来，养殖范围和密度急剧增加，导致疾病大肆暴发，例如：嗜水气单胞菌在水中快速传播，并在没有早期预防和及时抢救的情况下导致高死亡率，严重阻碍了水产养殖业的快速发展。关于鲤slc15a1的研究较少，闫潇[22]发现鲤slc15a1基因在肠道中对小肽的吸收绝大部分在前肠和中肠完成，被肠道吸收后未水解的小肽主要经血液运输到其他组织进行代谢。但近年来研究[2]发现，slc15a1基因在鲤感染性疾病及炎症反应中具有一定的调控作用，可能作为疾病治疗的靶点。
目前，对于鲤slc15a1的大部分研究主要集中于mRNA水平上，而在蛋白表达水平上的研究较少，因此开展对slc15a1基因的蛋白表达以及功能方面的研究具有一定的理论和现实意义。笔者通过原核表达技术成功获得包含抗原决定簇的鲤slc15a1a和slc15a1b目的蛋白，对其进行纯化后免疫小鼠，获得相应的多克隆抗体，采用ELISA法检测抗体效价并检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中Slc15a1a和Slc15a1b蛋白的表达情况，为更深入研究slc15a1基因的鱼类免疫反应调控机制提供一定的基础。
1 材料与方法 1.1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成体质量为(35.0±1.5)g的实验用鲤取自河南师范大学水产基地，驯养2周后随机挑取3尾，在无菌条件下取其12个组织(心脏、肝脏、脾脏、头肾、肾脏、肌肉、皮肤、血液、性腺、大脑、鳃、肠)均等混样后，提取总RNA并检测质量。按照cDNA反转录试剂盒(TaKaRa)说明书获得第一链cDNA，用于后续PCR扩增模板。
1.2 重组表达质粒的构建及鉴定根据NCBI上slc15a1a和slc15a1b的氨基酸序列，在DNASTAR软件中进行Protein分析及抗原决定簇区域的预测，用Primer 5.0设计相应的特异性引物(表 1)，并添加BamH Ⅰ和Hind Ⅲ特定的酶切位点和保护碱基。对目的片段进行PCR扩增(扩增条件：95 ℃ 5 min；32个循环包括95 ℃ 30 s，57/60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s；72 ℃ 10 min和4 ℃保存)。
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表 1 引物序列及相关信息 Tab.1 Primer sequence and related information |
将目的片段和表达载体pET-32a(+)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切(酶切体系：底物10 μL、BamH Ⅰ 1 μL、Hind Ⅲ 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 10.5 μL；酶切条件：37 ℃酶切3 h)，对酶切片段胶回收后连接[反应体系：目的基因酶切产物6 μL，pET-32a(+)酶切产物2 μL，10×T4 ligase buffer 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，16 ℃连接8 h]。重组表达质粒构建后进行DH5α转化，按照质粒抽提试剂盒(上海生工)说明书对扩大培养菌体进行质粒提取，并对质粒进行测序(上海生工)验证。
1.3 融合蛋白的原核表达及纯化将测序正确的重组表达质粒pET32a-Slc15a1a和pET32a-Slc15a1b转化至感受态BL21(DE3)，筛选阳性表达菌株，并接种于含氨苄青霉素(ampicillin，Amp，100 μg/mL)的300 mL液体LB培养基中，在37 ℃、200 r/min的培养条件下，至菌液OD600达到0.5~0.6时，加入IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导剂，振荡诱导5 h。采用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况，以未经IPTG诱导的菌体样品为对照。分析目的蛋白表达无误后，离心(4 ℃，8 000g，10 min)收集菌体，加入适量变性结合缓冲液(20 mmol/L Na3PO4、15 mmol/L C3H4N2、500 mmol/L NaCl、6 mol/L CH4N2O，pH 7.4)重悬后超声波破碎(超声3 s，间隔3 s；功率50%；破碎时间30 min)，离心(4 ℃，8 000g，30 min)后收集上清液。再将上清液加入His Trap HP柱中，参照His Trap HP镍柱蛋白纯化操作步骤。在变性条件下纯化表达的融合蛋白，SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白的浓度及纯度。
1.4 多克隆抗体的制备经BCA蛋白浓度测定试剂盒(博迈德生物公司)检测纯化后的蛋白质浓度，每个基因用6只体质量为(17±2)g的4周龄小鼠作为免疫动物，其中3只小鼠每次注射等量的1×PBS作为对照组。抗原涡旋乳化后，对小鼠腹腔进行注射。初次免疫使用弗氏完全佐剂(Sigma)，后续加强免疫使用弗氏不完全佐剂进行配合注射，单次每只小鼠腹腔注射量为100 μL蛋白溶液+100 μL弗氏完全/不完全佐剂。间隔1周加强免疫1次，共免疫4次后收集小鼠血清，-80 ℃保存备用。
采用ELISA方法进行抗体效价检测。使用碳酸盐缓冲液(pH 9.6，0.05 mol/L)将纯化透析后的目的蛋白溶液稀释至10 μg/mL，包被液作空白对照组，加入酶标板4 ℃过夜；次日PBST洗涤3次；封闭液封闭(37 ℃，2 h)后等量加入等梯度稀释[1∶ 102、1∶ 103、1∶ 104、1∶ (3×104)、1∶ (9×104)、1∶ (2.7×105)、1∶ (8.1×105)、1∶ (2.4×106)]血清、阴性对照(未免疫小鼠)血清及空白对照鼠血清稀释液，每个梯度3个重复。孵育2 h(37 ℃)，PBST洗涤3次；加入稀释后的HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶ 1 000)37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次；TMB溶液37 ℃避光显色30 min后，加入50 μL硫酸溶液终止反应后测定A450。以处理组/阴性对照的光吸收比值≥2作为抗体效价判定标准。血清效价检测达标后，分装放于-80 ℃保存备用。
1.5 攻毒试验实验鲤被随机分配到100 L的鱼缸中，分为2组(正常组和攻毒组)，每组设3个重复，每个重复放养50尾鲤。每组每天投喂3次，投饲率为体质量的3%。水温(26±1)℃，pH 7.0±0.5，氨氮浓度 < 0.01 mg/L，DO浓度>5 mg/L。经过1周喂养后，试验组鱼体腹腔注射150 μL嗜水气单胞菌(LD50=1.47×106 cfu/mL)，对照组注射等量的灭菌PBS(0.8% NaCl、0.02% KCl、0.027% KH2PO4、0.358% Na2HPO4·12H2O，pH 7.4)。选取注射后的3、6、9、12、24和48 h进行尾静脉取血，4 ℃静置过夜后离心收集血清，放入1.5 mL无RNA酶管中，-80 ℃保存，用于相应指标的测定。
1.6 鲤血清中Slc15a1a和Slc15a1b的表达量测定将收集的正常组和攻毒组血清用2×包被液等比稀释加入酶标板，4 ℃包被过夜后，采用ELISA法检测血清中Slc15a1a和Slc15a1b的表达量。除一抗孵育时，将血清按1∶ 10 000稀释混匀后加入酶标板，其他处理均与1.4节中的检测方法一致。
1.7 数据分析使用Excel 2019分析处理酶标仪实验数据；所有数据均用平均值±标准误(Mean±SE)表示。采用SPSS 19.0统计软件包进行单因素方差分析及Duncan氏法进行多重比较，以判断各实验组之间差异是否显著。
2 结果 2.1 重组载体的构建与鉴定将含有酶切位点的特异引物进行RT-PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，显示在约300 bp处分别可见两条特异性目的条带(实际大小分别为258 bp和306 bp), 见图 1。使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对目的片段和质粒pET-32a(+)进行双酶切，之后分别将slc15a1a和slc15a1b基因连接到pET-32a(+)载体上(图 2)，并转化至DH5α，选取阳性菌落进行测序，并与NCBI原始序列进行比对，结果显示重组质粒pET32a-Slc15a1a和pET32a-Slc15a1b读码框正确，未出现无碱基突变和移码等问题，证明pET32a-Slc15a1a和pET32a-Slc15a1b重组表达载体构建成功。
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M.标准物质2 000；1.slc15a1a基因PCR扩增产物；2.slc15a1b基因PCR扩增产物。 M. Marker 2 000; 1. slc15a1a gene PCR amplification product; 2. slc15a1b gene PCR amplification product. 图 1 PCR产物凝胶电泳分析 Fig. 1 Gel electrophoresis analysis of PCR product |
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M.标准物质2 000；1.slc15a1a基因双酶切验证；2.slc15a1b基因双酶切验证。 M. Marker 2 000; 1. slc15a1a gene double enzyme digestion validation; 2. slc15a1b gene double enzyme digestion validation. 图 2 重组表达质粒的双酶切验证 Fig. 2 Double enzyme digestion of recombinant expression plasmid |
将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，经37 ℃振荡培养至OD为0.55时，加入IPTG诱导5 h，取菌液进行10%的SDS-PAGE验证。在相对分子质量约为30 ku处分别可见2条明显的特异性目的条带，与理论值30.36 ku和32.12 ku相符(图 3和图 4)，表明slc15a1a和slc15a1b在原核表达载体pET-32a(+)中得到了表达。离心收集菌体，加入适量变性结合缓冲液重悬后进行超声破碎。再收集上清液，参照His Trap HP镍柱蛋白纯化操作步骤进行纯化，并通过透析袋法去除溶液中的有害元素。经SDS-PAGE检测结果显示，与无IPTG诱导的阴性对照组和加入IPTG诱导的阳性对照组相比，经过多次不同梯度的变性结合缓冲液纯化后的融合蛋白溶液中杂蛋白的含量显著减少(图 5和图 6)。
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1.蛋白质相对分子质量标准；2.未经IPTG诱导的合成组；3.经IPTG诱导的合成组。 1. Protein marker; 2. Inducement group without IPTG; 3. Inducement group induced by IPTG group. 图 3 Slc15a1a融合蛋白的原核表达 Fig. 3 Prokaryotic expression of Slc15a1a fusion proteins |
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1.蛋白质相对分子质量标准；2.未经IPTG诱导的合成组；3.经IPTG诱导的合成组。 1. Protein marker; 2. Inducement group without IPTG; 3. Inducement group induced induced by IPTG group. 图 4 Slc15a1b融合蛋白的原核表达 Fig. 4 Prokaryotic expression of Slc15a1b fusion proteins |
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1.蛋白质相对分子质量标准；2.纯化后蛋白；3.透析后蛋白。 1. Protein marker; 2. Purified protein; 3. Postdialysis protein. 图 5 Slc15a1a融合蛋白的纯化 Fig. 5 Purification of Slc15a1a fusion protein |
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1.蛋白质相对分子质量标准；2.纯化后蛋白；3.透析后蛋白。 1. Protein marker; 2. Purified protein; 3. Postdialysis protein. 图 6 Slc15a1b融合蛋白的纯化 Fig. 6 Purification of Slc15a1b fusion protein |
利用纯化透析后的Slc15a1a和Slc15a1b融合蛋白，对4周龄小鼠进行免疫，采用ELISA法检测收集的血清中多克隆抗体的效价。由表 2和表 3可以得出，小鼠的抗血清分别稀释至8.1×105(表 2)和2.7×105(表 3)时，阳性血清效价与阴性血清效价检测值相比仍大于2。因此，判定Slc15a1a和Slc15a1b多克隆抗体效价分别约为8.1×105和2.7×105，可用于后续实验中的指标检测。
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表 2 ELISA方法测定多克隆抗体Slc15a1a效价 Tab.2 Detection of Slc15a1a polyclonal antibody titer by ELISA method |
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表 3 ELISA方法测定多克隆抗体Slc15a1b效价 Tab.3 Detection of Slc15a1b polyclonal antibody titer by ELISA method |
为深入了解鲤Slc15a1a和Slc15a1b的蛋白表达水平，用1×PBS或嗜水气单胞菌对鲤腹腔注射后，在3、6、9、12、24和48 h通过尾静脉取血，以检测血液中指标表达量(图 7)。结果显示与正常组相比，在感染嗜水气单胞菌后，Slc15a1a和Slc15a1b的表达水平均显著增加。Slc15a1a在3 h和6 h维持一段时间的同一高表达水平后开始出现显著性下降直至24 h恢复到正常水平。与Slc15a1a相比，在感染后Slc15a1b从3h至24 h就一直维持着较高的相同表达水平，直至48 h出现显著性下降, 并且在大部分感染时期Slc15a1a的表达量高于Slc15a1b。在嗜水气单胞菌感染后，Slc15a1a和Slc15a1b的最高蛋白表达水平与正常对照组相比，其表达量分别增加了3.39和2.85倍，说明本实验制备的抗体具有较高的亲和力和特异性。
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图中不同小写字母(a, b, c, d, e) 表示不同处理组间的差异显著性(P<0.05)。 Different lowercase letters (a, b, c, d, e) indicate significant differences among different groups treatment (P<0.05). 图 7 血清中Slc15a1a和Slc15a1b蛋白质表达水平的检测 Fig. 7 Detection of Slc15a1a和Slc15a1b protein expression level in serum |
slc15a1基因是一种主要存在于小肠上皮细胞的质子依赖型转运蛋白，作用底物对动物体内的蛋白质吸收具有重要作用。在斑马鱼的研究中，slc15a1会对Met-Lys和Lys-Met表现出较高的亲和力和出色的转运效率，转运速度加快[23]。大黄鱼(Pseudosciaena crocea)体内的小肽转运载体表达也会受肠腔内不同蛋白源的影响，当肠腔内存在大量富含低分子量肽段时会上调slc15a1 mRNA的表达量[24]。在草鱼的研究中，饲料的蛋白水平对slc15a1基因表达有重大影响，且slc15a1 mRNA的表达会受时间和空间的调控[25]。但随着研究的不断深入，不少学者发现slc15a1可以激活机体固有免疫信号转导，引起机体免疫应答[26]。在鱼类感染性炎症及相关疾病中slc15a1基因也起重要作用[2]，当鲤受到嗜水气单胞菌侵染时，slc15a1的表达量升高，并在12 h达到最高表达值。目前水产动物疾病的免疫防治一直备受关注，高效的多克隆抗体已成为鱼类免疫学的研究热点之一。本试验通过制备Slc15a1a和Slc15a1b多克隆抗体，对其蛋白水平的免疫调控功能进行了研究。
3.1 slc15a1a和slc15a1b基因多克隆抗体制备为了更好地探寻Slc15a1a和Slc15a1b在免疫上发挥的作用，本试验采用PCR技术克隆slc15a1a和slc15a1b基因含有部分抗原决定簇的片段，引入双酶切位点BamH Ⅰ和Hind Ⅲ后连接至pET-32a(+)。表达载体的选择对克隆目的基因及介导目的基因转录和翻译上发挥着重要作用。例如：表达载体的启动子强度、载体活性和融合标签等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率[27]。蛋白纯化方法的选择在多克隆抗体制备的过程中至关重要，本研究在包涵体的纯化过程中，采用His柱单独纯化法，并选用尿素变性结合缓冲液作为变性剂，其优点是具有非离子化、呈中性、低成本等，而且复性后的蛋白不会出现大量物质沉淀。因此，当蛋白质加入His柱中开始纯化时，以低浓度到高浓度的尿素变性结合缓冲液进行梯度洗脱，从而实现了对杂蛋白的线性逐步脱除。而在复性的过程中采用透析复性法，可以为重折叠蛋白提供优质的环境，使蛋白的产量得以增加并过滤有害元素[28]。与阳性对照组相比，纯化透析后的融合蛋白溶液中且杂蛋白含量显著减少。
3.2 嗜水气单胞菌感染对鲤slc15a1基因表达量的影响slc15a1可与NOD受体结合，激活NF-KB和MAPK信号通路，从而导致下游促炎因子和趋化因子的生成，以及嗜中性粒细胞向炎症区域的浸润[29]。细菌也可以通过相关途径到达含有slc15a1表达的固有层巨噬细胞中，从而引起机体炎症反应[30]。嗜水气单胞菌常被用于检测机体免疫功能试验。在感染嗜水气单胞菌后，团头鲂(Megalobrama amblycephala)体内的非特异性免疫反应及铁代谢调节机制被激活，各时间点肝脏中IL-6的表达量均有所上升[31]；齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)在感染嗜水气单胞菌后，机体的免疫调节机制迅速做出响应，血液中的sqhmgbi基因在0.5~72 h快速上调[32]。而本实验鲤在感染嗜水气单胞菌后，Slc15a1a和Slc15a1b的表达水平均快速上升，Slc15a1a在3 h和6 h具有相同的高表达水平。与Slc15a1a相比，在感染后Slc15a1b从3至24 h一直维持着较高的相同表达水平，直至48 h出现显著性下降。与空白对照相比，感染后Slc15a1a和Slc15a1b的蛋白表达最高水平表达量分别增加了3.39和2.85倍。这可能说明Slc15a1a和Slc15a1b具有较强的免疫原性，能够及时地诱导机体产生免疫应答。
3.3 鲤slc15a1a和slc15a1b基因的表达差异全基因组复制事件后进化的主要驱动力是基因丢失、表达差异以及功能分化[33]，但基因功能分化缓慢，而表达差异较为强烈。例如：斑点叉尾
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2. College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian, China;
3. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, Guangdong, China