2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 食品科学与工程国家级实验教学示范中心, 上海 201306
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾,原产于南美洲太平洋沿岸热带水域,为广温广盐性热带虾类,于1988年首次引入我国[1]。其因营养价值高、肉质鲜美且对环境适应性强等优点,深受消费者喜爱,在中国的市场潜力不断提升[2]。凡纳滨对虾在我国2019年海水养殖虾类中的养殖产量占比达3/4以上,且呈递增趋势[3]。然而,其组织蛋白酶活性强,虾肉易在微生物和内源酶的作用下发生蛋白质变性与脂肪氧化分解,导致营养价值与食用品质下降,甚至腐败变质[4-5]。
虾类的传统保鲜方法主要有化学保鲜与低温保鲜。考虑到化学保鲜剂残留带来的食品安全问题,其应用推广相应受限[6]。冻藏保鲜效果明显,但长期冻藏会使虾体干耗增大,膨大冰晶也会引起虾肉细胞受损与汁液流失,使其品质劣变[4, 7]。其次,在实际流通与生产加工过程中,温度波动还会加剧虾体肌肉蛋白的氧化降解,使组织软化,对冻藏品质影响极大[8]。
目前,在水产品冻藏期间常用的抗冻保水剂主要有糖类和多聚磷酸盐两种。糖类抗冻保水剂除传统的蔗糖和山梨醇混合物、壳聚糖外,一些更健康的新型抗冻保水剂逐渐受到人们关注[9]。卡拉胶寡糖是一种高分子多糖,作为卡拉胶的降解产物,其甜度更低、热量更小,溶解性、安全性与稳定性均有所改善[10]。MA等[8]和XIE等[11]研究发现,与多聚磷酸盐、褐藻寡糖及海藻糖相比,卡拉胶寡糖能与虾肉蛋白分子相互作用,更好保护肌肉蛋白质,减少水分流失;齐贺等[12]研究得出,与海藻糖、低聚木糖及海藻胶寡糖相比,卡拉胶寡糖处理能更好维持虾仁肌肉组织完整性与肌纤维束的致密排列,对其品质特性保护较好;ZHANG等[13]研究了卡拉胶寡糖对凡纳滨对虾的冷冻保护作用,以焦磷酸钠为对照,发现寡糖处理可延缓持水力的下降、肌肉组织结构的损伤,提高其冷冻贮藏过程中蛋白质的稳定性;蓝蔚青等[14]采用傅里叶变换中红外结合激光显微拉曼光谱技术,分析得出卡拉胶寡糖可保护凡纳滨对虾虾肉蛋白二级结构和氢键,延缓脂肪族疏水基和侧链酪氨酸残基暴露,减缓虾肉品质下降。然而,前期关于卡拉胶寡糖对凡纳滨对虾冻融期间品质变化影响的研究较少,将傅里叶变换红外显微成像与核磁成像技术进行快速无损检测更鲜有涉及。
因此,本实验将新鲜凡纳滨对虾在-20 ℃下冷冻12 h后,于4 ℃下解冻12 h,模拟水产品运输加工过程中的冻融循环。拟由持水力、Ca2+-ATPase活性指标,结合MRI与FT-IRI技术,分析蔗糖山梨醇、三聚磷酸钠与卡拉胶寡糖等3种抗冻剂处理对凡纳滨对虾反复冻融期间水分与蛋白质变化影响。同时,通过其基本营养成分与氨基酸分析,综合评估3种抗冻剂处理后,凡纳滨对虾冻融期间的营养变化,旨在为深入分析卡拉胶寡糖的作用机制,将其作为健康高效抗冻剂投入水产品加工产业提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂鲜活凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)购于上海市临港农工商超市,选取体表无损体质量(15±1) g、体长(13±1) cm的活虾。将其置于低温泡沫箱,30 min内运至实验室,碎冰猝死。
主要试剂:山梨醇(食品级)、蔗糖(食品级)、三聚磷酸钠(食品级)、卡拉胶寡糖(500~1 000 u,食品级)购于青岛博智汇力生物科技有限公司;CuSO4·5H2O、K2SO4、三氯乙酸购于上海生工生物工程股份有限公司,均为国产分析纯;超微量Ca2+-ATPase活性试剂盒购于南京建成生物工程研究所;KBr(光谱纯)、NaOH(色谱纯)购于上海安谱科学仪器有限公司。
1.2 仪器与设备主要仪器设备:MesoMR23-060H-1型低场核磁共振仪(上海纽迈电子科技有限公司);FJ200-S型数显高速均质机(杭州齐威仪器有限公司);Spotlight 400型傅里叶红外光谱显微成像仪(美国PerkinElmer公司);L-8800型氨基酸全自动分析仪(日本日立公司)等。
1.3 方法 1.3.1 原料处理将完整鲜活的样品碎冰猝死后洗净,随机分为4组,结合文献[12]与前期预实验[14],分别将各组样品在30 g/L蔗糖山梨醇(Sucrose sorbitol, SS)、30 g/L三聚磷酸钠(Sodium tripolyphosphate, ST)与30 g/L卡拉胶寡糖(Carrageenan oligosaccharides, CO)中浸渍处理2 h,期间每隔20 min搅拌1次,以无菌蒸馏水浸渍处理作为空白对照组(CK)。样品处理后置于聚乙烯保鲜袋中,在-20 ℃下冷冻12 h后,4 ℃下解冻12 h,为1次冻融,共重复6次。在每次冻融处理后,分析样品的WHC、Ca2+-ATPase活性与基本营养成分,并在第2、4、6次冻融处理后进行MRI、FT-IRI与氨基酸分析。
1.3.2 持水力根据吴晓等[15]法,称取2.0 g样品用滤纸包裹,置于冷冻离心机中2 000 r/min离心15 min,去滤纸称质量,持水力(water holding capability, WHC)的计算公式:
式中:WHC为持水力,%;M1为离心前样品质量, g;M2为离心后样品质量,g。
1.3.3 MRI分析凡纳滨对虾经“去头、去尾、去壳”等三去处理后,将其用保鲜膜包裹,放入核磁检测管中。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列,根据CHENG等[16]的T2测定参数设置,测定温度为32 ℃。在测定条件为重复等待时间(TR)=500 ms,回波时间(TE)=18.2 ms时,通过MSE成像序列得到样品的质子密度成像。利用拉莫尔定律,得到由8次扫描累加而成的图谱,由上海纽迈电子科技有限公司提供的软件进行映射和伪彩,最后得到质子密度图。
1.3.4 Ca2+-ATPase活性按超微量Ca2+-ATPase测定试剂盒说明书进行操作,依次加入样本和试剂混匀后,室温静置5 min于波长636 nm处,双蒸水调零,测定各管的吸光度值,Ca2+-ATPase活性的计算公式如下:
式中:A为Ca2+-ATPase活性,U/mg;OD0为空白管吸光度值;OD1为标准管的吸光度值;OD2为对照管的吸光度值;OD3为测定管的吸光度值;C为待测样本蛋白浓度, mg/mL。
1.3.5 FT-IRI分析将样品置于50 mL离心管中,在冻干机中处理72 h。随后取出样品,置于加有KBr粉末的玛瑙乳钵中研磨20~30 s,压成直径为13 mm圆片。将其放入机器样品光路中,设置参数为:扫描波数范围4 000 cm-1~750 cm-1,分辨率16 cm-1,干涉仪速度1.0 cm/s,每像素扫描30次。
1.3.6 基本营养成分分析依据GB/T 5009.5—2016[17]与GB/T 5009.6—2016[18]进行粗蛋白、粗脂肪含量测定;依据GB/T 5009.236—2016[19]与GB/T 5009.4—2016[20]进行水分、灰分含量测定。
1.3.7 氨基酸分析称取2.0 g剁碎的虾肉于试管中,加入5 g/100 mL C2HCl3O2溶液15 mL,匀浆均质,经5 min超声后静置2 h,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液用NaOH溶液调节pH至2.0并定容至10 mL,经水相滤膜过滤后待上机测定。
1.4 数据处理实验重复3次,结果用平均值±标准偏差表示。采用SPSS 19.0软件进行Duncan氏显著性分析和ANOVA单因素方差分析,差异显著水平P < 0.05;用Origin 7.5软件作图。
2 结果 2.1 持水力冻融期间的温度波动易造成虾肉中的蛋白质冷冻变性和肌肉组织中冰晶体的膨大,使细胞机械损伤,导致肌肉持水力下降,并对其嫩度、弹性等品质带来影响[21]。
由图 1可知,4组样品的持水力均呈下降趋势。其中,抗冻剂组样品持水力的下降速度明显缓于对照组样品,表明抗冻剂处理能减缓凡纳滨对虾冻融期间的持水力下降,减少其解冻时的汁液流失,在一定程度上减弱冰晶对细胞破损。有研究[22]表明,在冻融循环过程中,凡纳滨对虾持水力的持续下降是由于冰晶的生长随冻融循环加快,连续的温度波动会加剧虾体的组织软化和蛋白冷冻变性。卡拉胶寡糖处理组样品在第6次冻融循环结束时,其持水力仅下降了11.86%,而经SS与ST处理的虾样持水力显著下降,分别下降15.25%与20.61%。可见,卡拉胶寡糖在冻融过程中对凡纳滨对虾肌肉组织中水分的保护效果要优于三聚磷酸钠与蔗糖山梨醇混合物。吴海潇[4]研究发现,卡拉胶寡糖处理能有效抑制冷冻虾仁解冻损失率,其持水力的下降趋势与本研究结果一致。卡拉胶寡糖处理良好的效果,可能由于卡拉胶寡糖对蛋白结构具有较好的稳定效果,其表面的活性羟基基团可与肌肉蛋白中金属离子螯合,形成紧密的三维网络结构,阻止肌肉组织内部水分的大量流失[23]。
通过核磁成像伪彩图的亮度变化可直观揭示凡纳滨对虾虾肉中的水分含量变化及水分迁移状况。在一般情况下,样品中的水分含量越高,其伪彩图中的颜色越趋于红色;反之趋于蓝色[24]。
由图 2可知,随反复冻融次数增加,4组虾样的伪彩图颜色均由深红逐渐趋淡红或黄色,这种变化在CK组最为明显,而卡拉胶寡糖处理组的颜色变化程度最小。冻融循环加剧了样品中水分的迁移流失,而抗冻剂处理可明显保护细胞结构,锁住肌肉内水分[25]。这与夏克鑫[26]研究冻融循环对大菱鲆品质影响时采用LF-NMR观察到的T2加权成像图变化相一致。通过MRI图,结合持水力与基本营养成分分析结果可知,与磷酸盐、山梨醇蔗糖混合物相比,同浓度的卡拉胶寡糖处理对凡纳滨对虾冻融期间的保水效果更佳。
反复冻融会加剧肌球蛋白头部结构的改变,致使肌肉组织内Ca2+-ATPase活性下降,故凡纳滨对虾中的肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性反映其蛋白变性程度,酶活性下降则对应蛋白变性[27]。图 3为3种抗冻剂处理对反复冻融凡纳滨对虾Ca2+-ATPase活性变化影响。
由图 3可知,凡纳滨对虾经过6次冻融后,CK组的Ca2+-ATPase活性由0.181 U/mg prot迅速降至0.101 U/mg prot。CO组样品的Ca2+-ATPase活性在第3次冻融循环结束时,其值下降趋势较ST与SS组样品缓慢,由此表明卡拉胶寡糖对蛋白保护作用的优势在第2次冻融后逐渐显现。CO、SS与ST组样品经6次冻融循环后,酶活性分别下降17.13%、28.18%与39.23%。Ca2+-ATPase活性降低主要由于强烈的温度波动加剧虾肉中的肌原纤维断裂,使其蛋白质冷冻变性。3种抗冻剂处理可显著抑制Ca2+-ATPase活力下降,其酶活力均高于CK组样品,其中以卡拉胶寡糖组的作用效果最明显。卡拉胶寡糖对蛋白保护作用可能通过取代部分水分子与蛋白残基形成氢键,减少侧链疏水基的暴露,稳定蛋白二级结构,达到抗冻保水效果[14]。ZHANG等[28]研究了卡拉胶低聚糖和低聚木糖对温度波动下冻虾仁冰晶生长和重结晶的影响,发现冻虾仁经卡拉胶寡糖浸渍处理后,其在肌原纤维蛋白含量、Ca2+-ATPase活性等方面均有显著改善,卡拉胶寡糖处理对肌肉蛋白质的稳定性有明显影响,并抑制了肌肉蛋白质的降解。
2.4 FT-IRI分析红外光谱联合显微镜成像技术,利用官能团化学分析,可直观反映样品中物质组成含量及分布变化情况[29-30]。为分析冻融凡纳滨对虾蛋白变化情况,选取1.6×103 cm-1~1.7×103 cm-1波长范围进行扫描,在红外成像图中,虾样中的蛋白含量越高,吸光度越强,其颜色越趋粉红;反之,颜色越趋于暗蓝[14]。
由图 4可知,样品在红外成像图中随反复冻融次数的增加,颜色逐渐由粉红趋于暗蓝,表明虾样中蛋白含量逐渐减少。其中:CK组样品的蛋白含量减少最明显,尤其在第4次冻融循环后;样品经6次冻融后,SS组样品的蛋白含量高于ST组;在冻融循环结束后,CO组红外成像图仍保持大面积红色。凡纳滨对虾中蛋白含量的下降主要由于冻融循环破坏了凡纳滨对虾肌肉蛋白二级结构的稳定性,造成其蛋白冷冻与氧化变性[14]。3种抗冻剂的加入可明显改善蛋白质的减少,而卡拉胶寡糖对蛋白的保护效果最佳。该结果与图 3中凡纳滨对虾的Ca2+-ATPase活性变化相一致。由此得出,傅里叶红外成像可较好表征凡纳滨对虾贮藏期间的蛋白含量变化。
凡纳滨对虾受到较大温度波动的影响,肌肉组织中冰晶生长和再结晶,其内的蛋白质、脂肪与水分等基本营养成分混杂在一起,甚至组织破损随汁液流失于细胞外。脂肪水解产生的部分游离脂肪酸和脂肪氧化产物同蛋白质进一步作用,使蛋白质的空间构象紊乱,加速其变性[31]。
由图 5可知,凡纳滨对虾样品中的粗蛋白与水分含量随冻融循环均呈下降趋势,这与红外成像及MRI伪彩图结果一致。此外发现,4组虾样的粗脂肪含量均显著下降。与CK组相比,抗冻剂处理组样品在整个冻融期间的基本营养成分始终保持较好水平,其中CO组样品最佳。部分学者[32]认为,反复冻融会造成冰晶生长,破坏细胞结构,导致细胞内脂质氧化初级产物碳氢化合物、醛酮类形成与释放,加速水产品蛋白质与脂肪的氧化水解、异味与变色发生。卡拉胶寡糖可有效抑制凡纳滨对虾水分和粗蛋白的下降,保持其较高含量,这可能归因于卡拉胶寡糖可与虾肌球蛋白相互作用,通过与极性残基形成氢键来取代蛋白质表面周围的部分水分子,维持虾仁肌肉蛋白质构象稳定[33]。
冻融凡纳滨对虾在内源酶与微生物共同作用会加速虾肉中的蛋白质与脂肪氧化分解,使部分氨基酸含量发生变化,造成营养劣变。
由表 1可知,新鲜凡纳滨对虾肌肉中含量较高的氨基酸主要为甘氨酸、精氨酸与丙氨酸,其含量分别为389.69 mg/100 g、236.01 mg/100 g与89.60 mg/100 g。样品随着冻融次数的增加,各氨基酸含量随之下降。同时,由于样品细胞组织的机械损伤,氨基酸随汁液流失而溶出组织外,虾肉中的氨基酸总量、必需氨基酸与鲜甜味氨基酸含量均呈下降趋势[34]。这种趋势在CK与ST组样品中变化最为明显,而CO与SS组相差不大,降幅均较小。苦味氨基酸总量呈上升趋势,是导致虾肉的风味品质劣变的因素之一,特别是作为重要的水产品增味氨基酸的精氨酸含量也逐渐降低[35]。此外研究还发现:样品在第4次冻融循环结束后,ST组中组氨酸与酪氨酸等苦味氨基酸含量明显高于CK组样品,说明三聚磷酸钠处理可能会加剧虾肉后期风味劣变;而在CO与SS组样品中,丝氨酸与苏氨酸鲜甜味氨基酸含量有轻微上升,表明卡拉胶寡糖和蔗糖山梨醇处理可改善对虾甜味氨基酸的呈味效果。整体来看,卡拉胶寡糖处理组样品在冻融期间的鲜甜味氨基酸、必需氨基酸与氨基酸总量均保持在较高水平。
通过对凡纳滨对虾品质指标测定与营养成分分析,由持水力、Ca2+-ATPase活性、MRI与基本营养成分分析结果得出,3种抗冻剂的抗冻保水效果由高至低分别为卡拉胶寡糖>蔗糖-山梨醇混合物>三聚磷酸钠;由氨基酸分析得出,卡拉胶寡糖处理可延缓凡纳滨对虾风味的劣变和改善对虾甜味氨基酸的呈味效果,而三聚磷酸盐处理会导致苦味氨基酸含量增加;傅里叶红外成像较好表征了凡纳滨对虾冻融期间的蛋白含量变化。就蛋白保护效果而言,卡拉胶寡糖组在3组抗冻剂处理组中效果最佳,尤其在冻融后期效果更好。因此,从抗冻效果、综合品质及营养变化上,卡拉胶寡糖均显示出明显优势,其在凡纳滨对虾的抗冻保鲜上具有广阔的应用前景。
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2. Shanghai Aquatic Products Processing and Storage Engineering Technology Research Center, Shanghai 201306, China;
3. National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China