上海海洋大学学报  2021, Vol. 30 Issue (5): 777-788    PDF    
somatostatin1基因突变斑马鱼仔鱼转录组分析
赵文婷1, 陈洁1, LOURO Bruno2, 曹蕾1, 马静1, MARTINS Rute S. T.2, CANARIO Adelino V. M.1,2     
1. 上海海洋大学 国家海洋生物科学国际联合研究中心, 上海 201306;
2. CCMAR-Centre of Marine Sciences, University of the Algarve, Gambelas Campus, Faro, Portugal 8005-139
摘要:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼中构建了可稳定遗传的生长抑素(somatostatin,SST)基因(sst1)突变体鱼系。通过比较6 dpf(days post fertilization,dpf)的sst1-/-突变体和野生型仔鱼转录组,发现sst1-/-突变体相关生化过程和信号通路发生了显著变化。相比野生型,sst1-/-突变体仔鱼中有354个基因显著上调,504个基因显著下调。GO(gene ontology)富集分析表明,大部分差异基因与氨基酸和蛋白质生物合成相关。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集显示代谢通路、氨基酸合成、氨基酰基-tRNA合成、核糖体合成和rRNA加工相关通路表达增强。结果表明,sst1-/-突变体蛋白质生物合成和代谢过程更加活跃。RT-qPCR验证结果显示,随机选取的10个基因mRNA表达变化趋势与转录组测序结果一致,说明转录组测序结果真实可靠。6月龄突变体体质量、体长和野生型相比并无显著差异。本研究结果为进一步挖掘生长抑素基因家族的潜在功能奠定基础。
关键词Somatostatin1    斑马鱼    代谢    蛋白质合成    

生长抑素(somatostatin,SST),又名生长激素抑制激素,最初在绵羊的下丘脑中分离得到,因其具有抑制垂体生长激素(growth hormone,GH)的分泌作用而得名[1]。生长抑素广泛表达于中枢与外周神经系统、胰腺、胃肠道、唾液腺、甲状腺、肾脏、前列腺、胎盘、血管、淋巴和免疫相关组织[2]。在哺乳动物中,生长抑素具有抑制生长激素分泌和细胞增殖,抑制胃酸、胰腺分泌与胃肠道蠕动,调控学习和记忆等多种功能[3]

脊椎动物基因组中存在6个生长抑素基因(sst1-sst6),在进化过程中,哺乳动物仅保留了2种生长抑素基因,sst1sst2(Cortistatin,CST)[4-5]。在哺乳动物中,生长抑素前体(preprosomatostatin,PPSS)可以通过蛋白水解酶在不同组织中水解产生2种活性多肽(SST-14和SST-28)。SST-28是一种SST-14氨基端延长多肽,在肠道中被发现,相较于SST-14更为活跃[6]。在硬骨鱼类中,基因组的额外加倍导致多个生长抑素基因的存在。研究人员已在斑马鱼基因组中发现6个生长抑素基因(sst1-sst6)。sst1基因编码PPSS1前体,水解产生SST-14肽,最为古老保守,普遍存在于所有脊椎动物中[1, 7]sst2sst5是在第2轮脊椎动物基因组加倍过程中产生的,sst4是硬骨鱼类特有的,在第3轮基因组加倍过程中产生,而sst3sst6分别由sst1sst2串联复制产生[8]。这就导致在鱼类中除了SST-14和SST-28,还存在SST-22和SST-25等多种形式多肽[9]

不同生长抑素多肽生物学功能可能不同,它们可以结合不同的生长抑素受体(somatostatin receptors,sstr),通过抑制Ca2+和K+离子通道、环磷酸腺苷/蛋白激酶A (cAMP/PKA)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸化酶C/肌醇三磷酸腺苷(PLC/IP3)等途径发挥功能[10]。例如,金鱼(Carassius auratus)SST-14通过影响Ca2+信号进而抑制cAMP依赖的生长激素的分泌[11]。点带石斑鱼(Epinephelus coioides)[12]中,SST-14通过PLC/IP/PKC和AC/cAMP/PKA途径抑制生长激素的分泌。

目前为止,尽管生长抑素功能在鱼类中的报道很多,多数研究利用SS合成多肽或者抑制剂刺激下获得。由于鱼类中多种形式生长抑素多肽存在,可能导致合成多肽刺激过程中特异性不佳,实验结果并不准确。在斑马鱼中存在全部6个生长抑素基因,并且精准的基因编辑系统成熟高效,这使得斑马鱼成为研究somatostatin家族基因功能与进化关系的理想模型[13]。本课题组已系统性地敲除sst1-sst6,已有研究[14]表明:sst4参与斑马鱼生长调控,并影响生殖系统的发育。本研究以最古老与保守的sst1基因为切入点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建可稳定遗传的突变体鱼系,旨在挖掘更多sst基因功能。使用受精后6 d sst1突变体仔鱼与野生型进行转录组测序比较分析,发现sst1纯合突变体中蛋白质生物合成和代谢过程更加活跃,为进一步挖掘生长抑素在斑马鱼早期发育中的潜在功能指明了方向。

1 材料与方法 1.1 试验动物来源与饲养

使用的野生型斑马鱼为AB品系,购买于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。斑马鱼均按照上海海洋大学动物伦理委员会要求处理,按照斑马鱼养殖标准饲养。试验所用鱼均等密度养殖于循环养殖系统(Aquaneering Inc,San Diego,CA,USA),水温保持在27~28 ℃,pH 7.0~8.0,盐度0.25~0.75,氨氮及硝态氮质量浓度小于200 mg/L,光照采取14 h照明(光照强度:54~324 lx)和10 h黑暗。斑马鱼受精卵使用灭菌养殖水培养,并存放于28.5 ℃的培养箱中进行孵化。

1.2 CRISPR/Cas9构建sst1突变体 1.2.1 CRISPR/Cas9靶点设计

利用Ensembl genome brower数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)分析sst1 (ENSDART00000059791.4)基因外显子、内含子与起始密码子位点。使用http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx网站预测Cas9蛋白靶点,sst1基因敲除靶点选择在第1个外显子,ATG后95 bp处。利用NCBI网站检测靶点特异性。

根据靶点位置设计PCR检测引物,检测引物设计还需满足:上下游引物与靶点之间的距离大于100 bp,并且上游引物到靶点的距离和下游引物到靶点的距离之间的差大于100 bp,便于后续电泳检测。sst1检测引物扩增片段为480 bp,PCR扩增为单一条带,引物序列见表 1

表 1 sst1引物信息 Tab.1 sst1 primer information
1.2.2 gRNA制备

以pUC19- scaffold plasmid质粒为模板(北京大学分子医学研究所熊敬维教授实验室赠予),使用含有T7启动子序列、sst1基因gRNA靶点和scaffold特异性上游引物(T7-sst1-sfd)和下游通用引物(trac rev)进行PCR扩增(表 1)。PCR反应体系:HIF enzyme Mix 25 μL, 上下游引物各1 μL,pUC19- scaffold plasmid质粒100 ng,用ddH2O补足50 μL。PCR反应条件:98 ℃预变性3 min;98 ℃变性30 s,65 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,反应35个循环,最后72 ℃延伸5 min。使用DNA Clean & Concentrator-5(Zymo Research,D4014)试剂盒纯化PCR产物。以纯化产物为模板,使用MAXIscriptt T7 in vitro Transcription Kit试剂盒进行体外转录,合成sst1 gRNA。利用Licl沉淀法纯化sst1 gRNA,使用Nanodrop 2000测定gRNA含量和OD值,2%琼脂糖凝胶电泳检测gRNA质量。

1.2.3 显微注射

将1 nL含有100 pg gRNA和300 pg cas9蛋白(购于南京金斯瑞生物技术有限公司)混合物注射到1细胞期斑马鱼胚胎动物极中,共注射200枚胚胎,并保留未注射的野生型斑马鱼胚胎作对照。注射48 h后取胚胎(25枚,5枚/管)用碱裂解法提取基因组。具体步骤:将5枚胚胎置于1.5 mL离心管中,加入50 μL 50 mmol/L的NaOH,充分振荡,95 ℃变性20 min,加入5 μL 1 mol/L Tris-HCl,10 000 r/min离心6 min。取2 μL DNA上清液为模板,使用靶点检测引物进行PCR扩增,PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃退火,72 ℃ 1 min延伸,30个循环,72 ℃最后延伸5 min。然后用T7核酸内切酶(T7 endonuclease Ⅰ,T7E1)检测靶点敲除效率,反应体系:PCR产物7 μL,Buffer 2 1.1 μL,DEPC水添加至10 μL。加入0.25 μL T7E1酶,37 ℃孵育45 min。2%琼脂糖凝胶120 V电泳25 min。将T7E1酶切检测阳性的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证,利用chromas软件分析靶点是否敲除成功。将T7E1酶切检测和测序为阳性的培养至成鱼,进行基因型鉴定与传代。

1.2.4 sst1基因打靶F1突变类型鉴定

将阳性F0与野生型外交产生的F1鱼系养至3月龄,剪取3月龄F1尾鳍,使用碱裂解法提取基因组,使用靶点检测引物进行PCR扩增,通过T7E1酶切检测阳性产物克隆至pMD19-T载体进行测序,通过Serial Cloner软件序列比对确定F1代突变类型。

1.3 总RNA提取和转录组测序

将有义突变F1内交后获取F2鱼系,通过T7E1酶切测序鉴定基因型,获得F2纯合突变体与野生型。将F2鱼系养至性成熟后,分别通过纯合突变体与野生型鱼系内交获得F3胚胎。将F3胚胎放置于28.5 ℃培养箱孵化至受精后6 d仔鱼。每管分别取15尾野生型和纯合突变体仔鱼冻存于液氮中进行总RNA提取,步骤:每管加入1 mL TRIzol试剂(Invitrogen,USA)匀浆,加入200 μL氯仿,使用异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤,最后溶于无RNA酶的水中。共提取5管野生型总RNA和4管突变体总RNA。使用NanoDrop 2000(Thermo,USA)检测每个样品中总RNA的含量及OD值,利用2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。利用安捷伦2100生物分析仪(Agilent,San Diego,CA,USA)检测质量。使用Illumina(Vazyme,#NR603)VAHTS stranded mRNA-seq Library Prep Kit制备测序文库,并使用Illumina Hiseq X Ten(Annoroad Gene Technology,上海,中国)测序。

1.4 生物信息学分析

使用Trim_galore wrapper script version 0.3.3 (Krueger,2015,https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore)对原始读长进行质量控制和编辑,生成简单的可描述性统计学及可编辑的读长。通过Galaxy [15]分析平台调用RNA-seq比对软件HISAT v2.1.0版本[16],将剪切和过滤后的序列映射到斑马鱼参考基因组(zfish_GRCz11)。使用Ensembl Genome Browser(http://ensembl.org)下载相关文件和各自的注释文件(.gtf)。使用Stringtie version 1.3.6组装转录本和基因转录本丰度评估[17],使用DeSEQ2 version 2.11.40.6建立差异表达基因[18],差异表达基因阈值为矫正后P < 0.05。使用G.profiler[19]进行GO(gene ontology)、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)和Reactome通路富集,使用ReViGO除去冗余的GO注释,并对GO注释进行归纳[20],使用Cytoscape进行结果展示[21]

1.5 荧光定量PCR(RT-qPCR)

分别取3组野生型和3组突变体仔鱼(6 dpf)提取总RNA。使用PrimeScriptTM RT reagnt kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa,RR047A)将RNA(1 μg)反转录成cDNA,并保存于-80 ℃冰箱。使用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站设计RT-qPCR引物,所有引物检测效率均为90%~105%,引物序列见表 2。以cDNA为模板,β-actin为内参进行荧光定量检测。RT-qPCR反应体系:LightCycler 480 SYBR Green I Master 10 μL,cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL,RNase free water补充体系至20 μL。反应条件为95 ℃,10 s;60 ℃,30 s;40个循环。荧光定量数据采用2-ΔΔCT (Livak) 法进行计算,试验结果用平均值±标准误(Mean±SE)表示,利用Prism 6.0作图,对需要比较显著性差异的数据进行t检验,P < 0.05时有显著性差异。

表 2 RT-qPCR引物信息 Tab.2 RT-qPCR primer information
2 结果 2.1 sst1突变体构建

根据sst1基因组序列,在第一外显子上设计了CRISPR/Cas9系统靶向位点,靶点长度为20 bp,靶点序列信息如图 1a。将gRNA与Cas9蛋白共同注射到1细胞期的野生型斑马鱼胚胎中,使用T7E1酶对48 hpf胚胎进行酶切检测(图 1c),同时对PCR产物测序验证,发现在靶点处出现乱峰(图 1d),表明sst1 gRNA成功编辑靶位点。将阳性F0与野生型外交产生F1杂合子鱼系,获得缺失7 bp和10 bp两种移码突变(图 1b),致使转录提前终止(图 2)。F1内交后的鱼系混合养殖,避免养殖密度与喂食对试验结果造成影响。将6 dpf F3野生型和突变体仔鱼进行转录组分析。

(a)sst1基因第一个外显子上的靶点序列;(b)野生型和sst1-/-DNA序列信息,突变体1:-7 bp,突变体2:-10 bp;(c)T7E1酶切检测;(d)测序图谱。 (a) Structure of the target sequence in exon 1 of sst1 gene; (b) The DNA sequences of wild-type and sst1-/-, which shows the sequences of deleted 7 bp in mutant 1 and deleted 10 bp in mutant 2; (c) T7E1 enzyme digestion; (d) Sequencing map. 图 1 CRISPR/Cas9构建斑马鱼sst1突变体 Fig. 1 CRISPR/Cas9-mediated sst1 mutant in zebrafish
“*”代表终止密码子;蓝色方框代表与野生型相比,突变体缺失碱基;红色方框代表终止密码子。 "*" represents a termination codon; Blue box represents the deletion of the base compared with the wild type; Red box represents the termination codon. 图 2 野生型和sst1-/- 突变体氨基酸比对 Fig. 2 Amino acid comparison between the wild-type and sst1-/- mutant
2.2 转录组序列质量分析

对6 dpf sst1-/- 突变体和野生型仔鱼转录组测序分析,共产生174 849 174个原始读长(野生型平均21 148 551个,突变体平均17 276 605个),去除低质量、Ns和接头污染序列,得到170 625 884个高质量读长,Q30为95%(表 3)。

表 3 野生型和sst1-/- 突变体转录组序列信息 Tab.3 Information of transcriptome sequencing of wild-type and sst1-/- mutant
2.3 差异表达基因

基于基因表达数据主成分和相关性分析表明,sst1-/- 突变体和野生型样本之间出现明显分离,同一组样本之间呈现高相关性(图 3)。比较分析后发现,sst1-/- 突变体与野生型之间共有858个差异表达基因,其中,354个基因表达显著上调,504个基因表达显著下调。表达差异最显著的10个基因,包括4个显著上调的基因:核蛋白1(nuclear protein 1,nupr1)、蛋白磷酸酶2磷酸酶激活剂(protein phosphatase 2 phosphatase activator,ptpa)、抗增殖蛋白2b(prohibitin 2b,phb2b)、锌指蛋白518A(zinc finger protein 518A,znf518a)。6个显著下调的基因:WWC家族成员3(WWC family member 3,wwc3)、四肽重复结构域4(tetratricopeptide repeat domain 4,ttc4)、非编码RNA(LOC100535170)、PPFIA结合蛋白1b(PPFIA binding protein 1b,ppfibp1b)、线粒体外膜70同系物A移位酶(translocase of outer mitochondrial membrane 70 homolog A,tomm70a)和1个未知蛋白的编码基因(si: ch211-281l24.3)(表 4)。突变体中有2个与SST-GH-IGF(somatostatin-growth hormone-insulin like growth factor)轴相关的显著下调差异基因,为胰岛素样生长因子结合蛋白1a(insulin-like growth factor binding protein 1a,igfbp1a)和胰岛素样生长因子结合蛋白5a(insulin-like growth factor binding protein 5a,igfbp5a)。

(a)野生型和sst1-/-突变体转录组主成分分析,两组间沿PC1分离;(b)野生型和sst1-/-突变体样本间相关性,颜色越深表明样本间的相关性越高。 (a) Principal components analysis of transcriptome samples from wild-type and sst1-/- mutant showing separation between the two groups along PC1; (b) Correlation of distances between wild-type and sst1-/- mutant samples, and a darker colour indicates a higher correlation between samples. 图 3 测序数据总结 Fig. 3 Summary of sequencing data processing
表 4 突变体比野生型表达差异最显著的10个基因 Tab.4 Top ten differentially expressed genes in the mutant compared to the wild-type
2.4 GO(Gene ontology)富集

与野生型相比,sst1-/-突变体中发现43个显著性GO富集,大部分属于生物学过程范畴,许多与氨基酸和蛋白质的生物合成有关。例如“细胞氨基酸代谢过程”、“羧酸代谢过程”、“用于蛋白质翻译的tRNA氨基酰基化作用”、“酮酸代谢过程”、“tRNA氨基酰基化过程”(图 4表 5)。在分子功能方面,蛋白质生物合成过程高度表达,如“连接酶活性”、“氨基酰基-tRNA连接酶活性”、“碳氧键形成的连接酶活性”、“作用于tRNA的催化活性”(图 5)。细胞组分差异分析主要集中在细胞核中,如“核仁”、“前核糖体”,再次表明了活跃的蛋白质生物合成过程。

散点视图将GO术语可视化到一个“语义空间”中,其中相似的术语放在更靠近的位置。圆形颜色反映在G: profiler中获得的P,大小反映了UniProt-GOA数据库中GO术语的通用性(圆形越大通用性越强)。 The scatterplot view visualizes the GO terms in a "semantic space" where the more similar terms are positioned closer together. The colour of the bubble reflects the P-value obtained in the G: profiler, while its size reflects the generality of the GO term in the UniProt-GOA database (bubbles of more general terms are larger). 图 4 sst1-/-突变体相对野生型生物学过程GO富集 Fig. 4 Enriched GO Biological Process in sst1-/- mutant compared with wild-type
表 5 sst1-/-突变体相对野生型差异表达基因富集程度最高的KEGG和Reactome通路 Tab.5 Enriched KEGG and Reactome pathways of differentially expressed genes with highest probability in sst1-/- mutant compared with wild-type
散点视图将GO术语可视化到一个“语义空间”中,其中相似的术语放在更靠近的位置。圆形颜色反映在G: profiler中获得的P,大小反映了UniProt-GOA数据库中GO术语的通用性(圆形越大通用性越强)。 The scatterplot view visualizes the GO terms in a "semantic space" where the more similar terms are positioned closer together. The colour of the bubble reflects the P-value obtained in the G: profiler, while its size reflects the generality of the GO term in the UniProt-GOA database (bubbles of more general terms are larger). 图 5 sst1-/-突变体相对野生型分子功能GO富集 Fig. 5 Enriched GO Molecular Function in differentially expressed genes of sst1-/- mutant compared with wild-type
2.5 KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)与Reactome通路分析

KEGG通路富集分析显示,差异基因主要与代谢通路、生物合成和氨基酸合成过程相关,包括“氨酰-tRNA生物合成”、“代谢通路”、“氨基酸生物合成”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”、“精氨酸生物合成”和“真核生物核糖体合成”。其中富集程度最高的Reactome通路与核糖体RNA加工相关(表 5)。

2.6 荧光定量PCR(RT-qPCR)验证

为验证转录组结果,分别随机选取5个显著上调和下调的差异表达基因进行RT-qPCR验证。RT-qPCR验证结果(图 6)显示,与野生型相比,突变体中nupr1phb2batf7bstau1、arl3基因mRNA表达水平上调,tomm70awwc3jak1pfdn5ttc4基因mRNA表达水平下调,其变化趋势与转录组测序分析结果一致。

*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1具有显著统计学差异,无显著性差异未显示。 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1 represents statistical significance, no significant difference is not shown. 图 6 野生型和突变体相关基因表达量变化 Fig. 6 Changes of gene expression levels in wild type and mutant
2.7 6月龄野生型和突变体体质量体长分析

转录组结果表明,与野生型相比,突变体中发现了两个显著下调的igf(insulin like growth factor,igf)结合蛋白差异表达基因igfbp1aigfbp5aigf是调节鱼类生长的关键因子,因此对6月龄野生型和突变体体质量及体长进行分析,结果发现,与野生型相比,突变体体长略微降低,体质量略微升高,但均无显著性差异(图 7)。

图 7 6月龄野生型和突变体体质量体长分析(n=15) Fig. 7 Body length and body mass analysis of 6-month-old wild type and mutant fish(n=15)
3 讨论

sst1基因突变导致6 dpf仔鱼的基因表达谱发生显著变化,改变了多种生物学进程和生化途径,其中大量的差异表达基因与代谢相关,尤其是蛋白质的生物合成。与野生型相比,sst1-/-突变体中出现858个差异表达基因,且有58%的基因表达下调。与野生型相比,sst1-/-突变体表达差异最大的10个基因中,有4个基因显著上调,其中一些与细胞周期调节相关,例如核蛋白1(nuclear protein 1,nupr1)[22]、蛋白磷酸酶2磷酸酶激活剂(protein phosphatase 2 phosphatase activator,ptpa)[23]、抗增殖蛋白2b(prohibitin 2b,phb2b)[24]。这表明sst1基因缺失后,生长抑素对生长的抑制作用降低,细胞分裂活动增强。下调基因进一步验证了这一结论,包括抑制细胞增殖和促进细胞凋亡基因(WWC family member 3,wwc3)[25]、细胞周期和肿瘤抑制因子(tetratricopeptide repeat domain 4,ttc4)[26]。有研究[27]表明,nupr1基因的缺失可以防止葡萄糖耐受不良,并且幼年sst1缺失小鼠(Mus musculus)的糖耐受能力低于成年小鼠[28]

GO富集分析表明, sst1-/-突变体与野生型相比,连接酶活性、tRNA合成活性、氨基酸、蛋白质和核糖体代谢过程以及核仁和前核糖体的细胞定位等方面高度富集,这在KEGG和Reactome通路富集中得到进一步证实,例如tRNA生物合成、氨基酸生物合成和核糖体合成与rRNA加工出现高度富集。

研究结果表明,sst1-/-突变体代谢通路高度富集,这一发现与在鱼类中生长抑素刺激脂肪降解和碳水化合物分解的研究一致[29]。例如,在大鼠(Rattus norvegicus)和虹鳟鱼中,生长抑素的灌注引起肝脏三酰甘油脂肪酶活性的变化,进而导致血浆脂肪酸水平的改变[30-31]。生长抑素在小鼠脑脂质代谢中起着重要的作用,可降低cAMP(cyclic adenosine monophosphate)和甘油三酯脂肪酶的含量[32]。除此之外,生长抑素类似物对内脏血流和葡萄糖稳态也具有重要影响[33]

生长激素(growth hormone,GH)主要通过IGF(insulin like growth factor,IGF)调节鱼类肌肉生长[34]。本研究结果与已有鱼类中SST调节GH-IGF轴的观点一致[35]。然而与野生型相比,突变体中只发现了2个显著下调的IGF结合蛋白差异表达基因igfbp1aigfbp5a。IGF结合球蛋白结合IGF后,具有增加半衰期,调节与不同组织受体的结合,抑制有丝分裂、分化和存活等功能[36]。但是本研究没有发现GH的差异表达,对6月龄野生型和sst1突变体体质量体长分析初步结果显示,野生型和sst1突变体体质量和体长之间并无显著差异(图 7)。但是之前的报道[14]表明,sst4基因缺失显著增加45 dpf、50 dpf和55 dpf突变体的体质量及体长。这表明其他sst基因可能在斑马鱼生长中发挥着特有的作用。最后,与野生型相比,在突变体中没有发现任何sst1转录本的差异表达,表明不存在sst1基因的反馈调节机制。

综上所述,sst1基因突变导致SST1蛋白失活,导致6 dpf斑马鱼仔鱼基因表达发生显著变化。sst1基因突变显著改变了代谢基因,特别是与氨基酸、tRNA和核糖体生物合成相关基因的变化,但是活跃的蛋白质合成过程并未引起6月龄野生型和sst1突变体体质量体长的变化,这为进一步筛选sst基因在斑马鱼生长中的特定功能提供参考。并且sst1基因缺失导致代谢过程更加活跃,尤其是蛋白质合成。这将为研究sst1基因在代谢中功能提供参考,为进一步解析生长抑素基因家族在鱼类中的功能奠定基础。

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Transcriptome sequencing analysis of somatostatin 1 gene mutation in zebrafish larvae
ZHAO Wenting1, CHEN Jie1, LOURO Bruno2, CAO Lei1, MA Jing1, MARTINS Rute S. T.2, CANARIO Adelino V. M.1,2     
1. International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. CCMAR-Centre of Marine Sciences, University of the Algarve, Gambelas Campus 8005-139 Faro, Portugal
Abstract: Somatostatin (SST), is a kind of neurohormone with key roles in regulating growth and metabolism in all vertebrates. In zebrafish and other fishes, SST peptides are encoded by six genes, and sst1 exists in all vertebrates and is the most evolutionarily conservative. Here, we explored sst functions through a transcriptomic comparison of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish sst1-/- mutants generated by CRISPR/Cas9 gene-editing technology and their wild type counterparts. It is found that several biological processes and biochemical pathways were modified in sst1-/- zebrafish. The mutant had 354 significantly up-regulated and 504 significantly down-regulated genes. Gene ontologyi(GO) enrichment analysis showed that most of the differentially expressed genes were related to the biosynthesis of amino acids and proteins. Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) pathway enrichment indicated metabolic pathways as well as pathways related to amino acid biosynthesis, aminoacyl-tRNA biosynthesis, ribosome biogenesis and rRNA processing were highly represented in the mutant, indicating a more active protein biosynthesis and metabolism. The results of RT-qPCR illustrated that the mRNA expression trends of 10 randomly selected genes were consistent with the results of transcriptome sequencing analysis, indicating that the transcriptome results were accurate and reliable. There was no significant difference in body weight and body length between 6-month-old mutant and wild-type. The results provide a foundation for further exploring the potential functions of the somatostatin gene family.
Key words: Somatostatin1     zebrafish     metabolism     protein biosynthesis