2021,
Vol. 30
2. 食品热加工工程中心, 上海 201306;
3. 食品科学与工程国家级实验教学示范中心, 上海 201306
南极磷虾(Euphausia superba)是南大洋生态系统中的关键物种，资源量丰富，开发潜力巨大[1]。南极磷虾不仅被称为全球最大的动物蛋白质库，而且还含有丰富的矿物元素和胡萝卜素等，具有广阔的应用前景[2]。目前已有相关产品的研究和开发，如：蛋白质相关产物、壳聚糖和磷虾油[3-5]等。作为新的蛋白质来源，其加工特性备受关注。南极磷虾常见的加工方法有加热、干燥和提取等[6-9]。传统的加工方法耗能、耗时、耗费溶剂，容易造成环境污染。微波加热作为一种快速、均匀、低能耗、操作简单且可控性强的新型加热方式，可有效提高其加工效率，被广泛应用于食品工业中[10]。
在微波加热时，食品的温度分布是不均匀的。微波加热的均匀性和速率取决于食品的介电特性，食品的介电特性被看作是微波和食品反应的主要因素[11]。张毛赛等[12]和ZHANG等[13]已研究过糖和氨基酸对南极磷虾虾肉糜介电特性的影响。也有学者[14-15]研究得出糖类可以抑制南极磷虾的脂质氧化，延长保质期。而美拉德反应(maillard reaction, MR)是食品中的羰基化合物(还原糖)和氨基化合物(氨基酸、蛋白质等)在食品贮藏和加工中自发发生的一系列反应。美拉德反应产物(maillard reaction products, MRPs)不仅具有其独特的香味和色泽，还具有抗氧化、抗病毒、抗诱变等多种生物活性[16-18]。食品加工过程中常见的色泽变化主要由美拉德反应产生[19]。微波加工过程会增加挥发性成分的种类和含量[20], 且MRPs也含有多种挥发性成分。作为众多MR中最简单的模型，微波加热下的赖氨酸和葡萄糖的MR模型已有研究[21]。MRPs添加于食品物料会提高其食品的抗氧化活性[22]和抑菌性[23]。但MRPs添加于食品中是否会改变食品的介电特性从而影响其加热效率还有待于研究，因此有必要研究将MRPs添加于南极磷虾中是否会将产物独特的颜色和香味带入，改善虾肉糜的色泽和香味。这对于南极磷虾产品的加工具有一定意义。
本研究制备了不同微波加热时间下葡萄糖和赖氨酸的MRPs, 对其挥发性成分进行了分析，并将MRPs分别添加到南极磷虾虾肉糜中，考察MRPs对其介电特性、微波加热特性(升温曲线和温度分布)、色泽及挥发性成分的影响。旨在探讨MRPs的添加对虾肉糜微波加工特性及品质的影响，提高加工效率的同时又丰富其色香味，为南极磷虾及其相关水产品的开发利用和品质提升提供新的方法和理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂主要材料与试剂：南极磷虾虾砖(-18 ℃), 青岛大康尚品商贸有限公司；赖氨酸(分析纯), 大连美仑生物有限公司；葡萄糖、无水硫酸钠、无水乙醚(分析纯), 上海国药集团；2, 4, 6-三甲基吡啶(色谱级)、亲水针式滤器，上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备主要仪器与设备：BS224S分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DS-1高速组织捣碎机，上海标本模型厂；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；CR-400色差计，柯尼卡美能达公司；PNA-L网络分析仪，美国安捷伦公司；SH-241恒温恒湿箱，日本ESPEC公司；THERMIC MODEL 2100A热电偶，日本ETO DENKI公司；松下NN-GD568M微波炉，深圳新世联科技有限公司；光纤温度计，加拿大FISO科技公司；TH7700红外热呈像仪，日本NEC San-Ei仪器公司；7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；Christ Alpha2-4冷冻干燥机，德国Christ公司。
1.3 实验方法 1.3.1 MRPs的制备美拉德反应产物的制备参照文献[24]的方法。称量1.46 g(0.01 mol)的赖氨酸和1.98 g(0.01 mol)葡萄糖加入30 mL去离子水中搅拌至全部溶解，倒入平底烧瓶中，在微波炉(设置功率250 W)中分别加热1、3和5 min, 立即冰浴冷却。
1.3.2 色差值的测定使用色差仪测定，平行3次，白板校准。ΔE值表征待测样品与对照样品之间的色差值，ΔE越大，表示颜色变化越大。
(1)
式中：L0*、a0*和b0*分别是未加热时样品的亮度值、红绿值和黄蓝值；L0、a0和b0分别是加热后样品的亮度值、红绿值和黄蓝值。
1.3.3 pH的测量采用pH计测量，测量样品前，用缓冲液校准。
1.3.4 虾肉糜复合物的制备虾肉糜复合物的制备参考文献[13]的方法。南极磷虾虾砖流水解冻1 h后，放于匀浆机中均质3 min制备纯虾肉糜。将微波加热后制备的MRPs真空冷冻干燥48 h, 放于研钵中碾碎，与去离子水、虾肉糜按比例混匀均质，配制成质量分数为5%的MRPs南极磷虾虾肉糜复合物，真空脱气待用。为了之后考察美拉德反应物葡萄糖和赖氨酸对虾肉糜介电特性的影响，也制备了质量分数为5%的葡萄糖虾肉糜复合物和质量分数为5%的赖氨酸虾肉糜复合物。
1.3.5 介电特性的测量使用同轴探针连接网络分析仪测定。使用方法参考YANG等[6]。在使用前，仪器预热稳定2 h, 分别使用空气、短接块和去离子水校准。样品放置于恒温恒湿箱中加热，热电偶实时测量样品中心温度。设置3组平行。
1.3.6 穿透深度的计算穿透深度(dp)是指从介电性材料表面到其微波能衰减至初始值1/e (e=2.718)位置时的距离[25]。当评估某个电磁场频率是否可以均匀加热特定食物时，穿透深度是一个重要的概念。在测量了样品的介电特性之后，电磁能的穿透深度计算公式为
(2)
式中：dp为穿透深度，m; c为光在真空中的传播速度，3×108 m/s; f为频率，Hz; ε′和ε″分别为介电常数和介电损失率。
1.3.7 温度分布和温度曲线的测量称取虾肉糜(20.0±0.1)g填模(尼龙，圆柱形，内径30 mm, 高25 mm), 并用20 mm厚的聚乙烯材料包裹模具，后密封储存在4 ℃冰箱中。微波工作站用于微波加热和实时监测加热过程中的温度。该工作站是在微波炉上方加装一个可以插入光纤并连接电脑的装置，且可以随微波炉内部转盘以同样速度一起旋转[6]。设置微波炉的功率250 W, 加热时间60 s, 测量样品的升温曲线。样品置于微波炉转盘中心，光纤固定于样品的几何中心，电脑实时记录温度变化。加热结束立刻把虾肉糜沿直径纵切成两半，用红外热呈像仪拍摄纵切面的温度分布情况，整个操作时间控制在15 s以内。
1.3.8 能垒的计算为了确定微波加热下葡萄糖和赖氨酸美拉德反应的能量需求，引入了能垒概念。活化分子中可以参与化学反应的最小能量称为化学反应的能垒，能量阈值或能垒的计算方法为
(3)
式中：τ0为弛豫时间，s; KB为玻尔兹曼常数，1.38×10-23J/K; T为绝对温度，K; A为指数前因子。-ln[1/(2τ0)]与1/T的关系图给出了一条直线，其斜率和截距分别用于确定ΔU和A[26]。
1.3.9 MRPs的挥发性成分提取挥发性成分的提取参考文献[24]的方法，并做适当改动：用100mL的乙醚萃取微波加热后的反应液，加入20 g无水硫酸钠脱水3 h, 置通风橱挥发至2 mL, 加入10 μL的2, 4, 6-三甲基吡啶溶液(4.58 mg/mL)作为气相色谱的内标。经0.22 μm针式滤器注入进样小瓶待测。
色谱条件：HP-5MS色谱柱(30 m × 0.25 min; 0.25 μm)。升温程序：柱初温40 ℃, 保持2 min, 以5 ℃/min升温至120 ℃, 再以12 ℃/min升温至250 ℃, 保持3 min, 最后以10 ℃/min升温至260 ℃, 后运行10 min。氦气以1.0 mL/min的恒定速度用作载气，进样温度为260 ℃, 分流比为30∶1, 进样量1 μL。
质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV; 离子源温度为230 ℃; 四级杆温度为150 ℃; 扫描质量为20~550 amu。
1.3.10 微波加热下南极磷虾虾肉糜挥发性成分提取将冰箱中模具里的虾肉糜取出，加入30 mL去离子水在微波炉中加热1 min, 用乙醚收集萃取其挥发性成分，步骤同1.3.9节。
1.3.11 微波加热下的MRPs及南极磷虾虾肉糜挥发性成分分析定性分析：通过NIST 12质谱数据库将美拉德反应产物挥发性成分进行比对查找分析，对匹配指数800以上的物质进行定性分析，利用归一法计算各成分相对含量。
定量分析：内标(IS)法用于量化挥发性化合物，根据内标物2, 4, 6-三甲基吡啶与待测挥发性化合物的峰面积之比求得质量分数，结果用μg/mg表示。
1.3.12 数据处理所有实验数据平行3次测量，使用Excel 2010处理数据和Origin 9.0作图，使用SPSS 16.0软件进行差异性分析。
2 结果与分析 2.1 MRPs的介电特性MRPs的介电常数随频率的增加而减少(图 1a)。随着微波加热时间增加，在低于500 MHz的频率下，MRPs的介电常数增加；高于500 MHz的频率波段，介电常数减小。未加热和微波加热1 min的MRPs的介电损耗无显著区别，但随着微波加热时间增加(超过1 min后), 介电损耗增加；随着频率的增加介电损耗均先减少后增加，拐点为1~2 GHz(图 1b)。在300 MHz到1GHz的低频范围内，食品物料的介电损耗主要受离子传导作用；频率为1~2 GHz时，介电机理从离子传导转移到分子极化；当频率大于2 GHz时，介电损失主要受偶极迟豫机制影响[6, 13]。微波加热使MRPs的临界频率从1.6 GHz降至1.2 GHz。
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图 1 微波加热下美拉德反应液的介电常数(a)和介电损耗(b) Fig. 1 Dielectric constant (a) and dielectric loss (b) of the MRPs during microwave heating |
微波加热使临界频率所对应的MRPs的介电常数降低(图 2a), 介电损耗增加(图 2b)。上述两种正、负线性相关系数都大于0.9。
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图 2 临界频率所对应的MRPs的介电常数(a)和介电损耗(b) Fig. 2 Dielectric constant (a) and dielectric loss (b) of MRPs corresponding to the critical frequency |
利用MRPs在微波加热过程中的临界频率和温度相关性画出MRPs的降解速率变化趋势(图 3)。代入公式(3)可求出微波加热下葡萄糖和赖氨酸发生美拉德反应所需最小能量为(6.73±0.10)×10-21 J。
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图 3 随微波加热时间的美拉德反应原料的降解速率 Fig. 3 Degeneration rate of Maillard reaction solutions during microwave heating |
在2 450 MHz频率下，MR0和MR3的介电常数无显著性差异(P > 0.05), MR1和MR5的介电常数均比纯虾肉糜高(P≤0.05), 见图 4a。只添加葡萄糖的虾肉糜介电损耗较低(图 4b), 这是由于葡萄糖与水的结合作用，自由水含量减少，从而改变介电特性, 而添加赖氨酸的虾肉糜介电损耗最高，是由于其pH(9.74±0.05)靠近赖氨酸的等电点(9.74), 净电荷和静电斥力增加引起偶极性增加[13]。添加不同微波加热时间下制备的MRPs虾肉糜的介电损耗[(22.51±0.41)~(23.07±0.14)]均比纯虾肉糜(21.63±0.12)和添加葡萄糖的虾肉糜(18.38±0.08)高，且与纯虾肉糜存在显著性差异(P≤0.05)。添加MRPs可增加虾肉糜的介电损耗。
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MR0、MR1、MR3和MR5分别代表添加微波加热0、1、3和5 min的MRPs虾肉糜。图中不同小写字母代表差异显著，P≤0.05。 MR0, MR1, MR3, and MR5 represent minced krill supplemented with microwave-heated MRPs for 0, 1, 3, and 5 min.Different small letters in the figure represent significant differences, P≤0.05. 图 4 2 450 MHz频率下美拉德反应产物对南极磷虾虾肉糜介电常数(a)和介电损耗(b)的影响 Fig. 4 Effects of different MRPs on the dielectric constant (a) and dielectric loss (b) of minced Antarctic krill at 2 450 MHz |
穿透深度可以提供关于微波有效加热深度的信息，与其介电特性有关。添加MRPs的虾肉糜的穿透深度范围为(6.63±0.05)~(6.95±0.07) mm, 比纯虾肉糜的(6.95±0.03)mm略低，但无显著性差异(P > 0.05), 见图 5。这是因为添加MRPs的虾肉糜的介电特性与纯虾肉糜虽然存在显著差异，但数值差别不大，导致穿透深度变化不明显。
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MR0、MR1、MR3和MR5分别代表添加微波加热0、1、3和5 min的MRPs虾肉糜。图中不同小写字母代表差异显著，P≤0.05。 MR0, MR1, MR3, and MR5 represent minced krill supplemented with microwave-heated MRPs for 0, 1, 3, and 5 min.Different small letters in the figure represent significant differences, P ≤ 0.05. 图 5 2 450 MHz下美拉德反应产物对南极磷虾虾肉糜穿透深度的影响 Fig. 5 Effects of different MRPs on the dp of minced Antarctic krill at 2 450 MHz |
在0~60 s的微波加热过程中，添加MRPs虾肉糜的微波升温曲线均高于纯虾肉(P≤0.05), 见图 6。这是由于添加MRPs的虾肉糜的介电损耗均高于纯虾肉糜，电能转化为热能的能力提高，促使升温速率加快。
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MR0、MR1、MR3和MR5分别代表添加微波加热0、1、3和5 min的MRPs虾肉糜。图中不同小写字母代表差异显著，P≤0.05。 MR0, MR1, MR3, and MR5 represent minced krill supplemented with microwave-heated MRPs for 0, 1, 3, and 5 min.Different small letters in the figure represent significant differences, P≤0.05. 图 6 不同的美拉德反应产物对南极磷虾虾肉糜微波升温曲线的影响 Fig. 6 Effects of different MRPs on the temperature history of minced Antarctic krill during microwave heating |
微波加热样品后的截面温度分布均呈现中心温度高四周低的现象(图 7)。这是因为微波与样品相互作用导致样品中心电场聚集，致使样品中心温度较高。添加了MRPs的虾肉糜的中心温度和边缘温度略高于纯虾肉糜。而红外热呈像仪所呈现的中心温度比光纤所测的温度低是测量过程中的热损失造成的。
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图 7 美拉德反应产物对南极磷虾虾肉糜温度分布的影响 Fig. 7 Effects of different MRPs on the temperature distribution of minced Antarctic krill during microwave heating |
纯虾肉糜微波加热前后ΔE值为7.82±1.74。随着MRPs在微波下制备时间的延长，虾肉糜ΔE值减小，MR5加热前后的ΔE值仅为2.49±0.79 (图 8)。随着美拉德反应程度加深，反应物不断被消耗，导致反应速率减慢，色差的变化程度减小。这与孟岳成等[27]研究结果相似。
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图中不同小写字母代表差异显著，P≤0.05。 Different small letters in the figure represent significant differences, P≤0.05. 图 8 不同的美拉德反应产物对微波加热后南极磷虾虾肉糜表面ΔE值的影响 Fig. 8 Effects of different MRPs on the ΔE values of the surface of minced Antarctic krill after microwave heating |
微波加热下MRPs与添加MRPs南极磷虾虾肉糜的挥发性成分如表 1所示。微波加热下的MRPs共检测出10种挥发性物质，其中烷烃类2种、酮类1种、吡嗪类2种、芳香烃类4种、其他1种。微波加热1 min, 只进行到反应前期阶段，没有挥发性物质产生，其产物是挥发性香味物质的前体成分。随着微波加热时间的延长，挥发性物质种类(由0到10种)和质量分数[由0到(41.81±1.89) μg/mg]均增加。微波加热3 min的主要特征香味物质是甲基-吡嗪(焦香味), 质量分数为(0.72±0.12) μg/mg。加热5 min主要香味物质是吡嗪类(焦香味)、吡喃酮(肉香味), 质量分数分别为(5.89±0.56) μg/mg和(9.03±0.91)μg/mg。说明美拉德反应的中期阶段仍在不断进行。这与YEO等[24]和AMES等[28]等研究结果一致。
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表 1 MRPs与添加MRPs南极磷虾虾肉糜的挥发性成分对比分析 Tab.1 Comparative analysis of volatile components in MRPs and MRPs-added minced Antarctic krill |
添加了MRPs的虾肉糜在微波加热后共鉴定出4类，9种挥发性成分，其中烷烃类1种、醇类1种、芳香类3种、酯类4种。纯虾肉糜、MR1虾肉糜、MR3虾肉糜、MR5虾肉糜挥发性成分分别为4、4、5和8种。其中，醇类和酯类构成了挥发性物质中的主要成分。随着MRPs的添加，虾肉糜加热后挥发性成分种类和绝对质量分数都增加。在高温条件下，虾肉糜中的氨基化合物和糖类作用，产生大量的香味成分。MR1虾肉糜比纯虾肉糜略低。这是因为加入的MRPs是前期产物，在虾肉糜加热期间，其产物与南极磷虾虾肉糜中的蛋白质反应，导致MR1虾肉糜中挥发性物质的总绝对质量分数略低。醇类的绝对质量分数一直在增加。烷烃类、芳香类和酯类的绝对质量分数先下降后上升。增加了2种芳香类物质，分别为1, 3-二甲基-苯和苯乙烯，与检测出来的部分MRPs相对应。酯类物质也增加了2种，且质量分数较高。酯类化合物通常是通过脂肪代谢生成的羧酸和醇的酯化作用所产生[29]。美拉德反应过程中也会产生酸性物质，促进酯类物质的形成，对虾肉风味贡献加大。
微波加热5 min时产生吡喃酮物质，质量分数为(21.69±3.16)%(表 2)。微波加热时间延长，芳香类物质的个数和质量分数增加，尤其是特征香味物质吡嗪类。吡嗪是α-二羰基和胺通过Strecker降解相互作用所产生。温度高于100 ℃时，加热时间增加，吡嗪的量增加得更快[30]。
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表 2 MRPs与添加MRPs虾肉糜混合物的挥发性化合物个数及相对含量 Tab.2 Number and relative content of volatile components in MRPs and MRPs-added minced Antarctic kril |
随着MRPs的添加，虾肉糜挥发性成分中烷烃类质量分数下降，醇类和芳香类物质的种类各增加了两种，质量分数均上升，且酯类质量分数一直较高。这与前人[31-32]研究的南极磷虾虾肉糜的挥发性成分相比，种类略低，但虾肉糜中主要挥发性成分烃类、醇类、酯类和芳香类均被检测出来，醛类物质未被检测出来。这与挥发性成分的提取方法有关，以前采用的是固相微萃取，虾肉糜不经高温处理，萃取温度较低，而本实验采取的是在微波加热下冷凝萃取挥发性物质，醛类物质在高温下反应, 也可能与冷冻虾肉糜的脂肪质量分数低有关，脂肪氧化是形成醛类挥发性成分的主要途径之一[29]。挥发性物质中的醇类能生成柔和的清香气味，与羰基化合物共同影响水产品风味[33]。而酯类化合物可以产生香甜的花果香味[34]。芳香类物质阈值相对较高，低质量分数时对风味贡献较小，所有虾肉糜中检测出的质量分数均高于阈值[35], 而且添加了MR5虾肉糜芳香类物质绝对含量增加了12倍，在保留虾香味的基础上又增加了烤香味、肉香味，因此MRPs的添加对丰富虾的风味有一定的影响。
3 讨论本文以南极磷虾为研究对象，添加了不同微波加热时间下制备的美拉德反应产物，考察对其介电特性、加热特性、表面色泽以及挥发性成分的影响。微波加热下美拉德反应液的介电特性随频率的变化规律与郭文川等[36]研究的不同频率下的牛乳介电特性变化趋势类似。美拉德反应产物挥发性成分特征香味成分为吡嗪类和吡喃类。这与YEO等[18]在微波加热下发现的美拉德反应产物挥发性成分种类类似，但个数相对较少，这是因为本实验所选的加热时间较短，防止反应进行过度生成有害物质。
美拉德反应产物对南极磷虾介电特性的影响与葡萄糖[11]不同，与赖氨酸[12]对其的影响类似，这是因为美拉德反应过程中有氨基化合物的存在以及生成胺类化合物，说明美拉德反应产物中的氨基化合物对南极磷虾的介电特性影响较大。添加美拉德反应产物后虾肉糜的介电损耗均比纯虾肉糜高，穿透深度变化不明显，升温曲线上升，可提高虾肉糜的升温速率，提高加工效率。
添加了美拉德反应产物的虾肉糜加热前后表面色差值的变化随制备的美拉德反应产物所用的微波加热时间增加而减小，随美拉德反应进行，速率减慢，色差变化程度减少[23]。
添加了美拉德反应产物后的虾肉糜的挥发性物质种类与含量均增加，芳香类与酯类分别增加了2种，相对含量与绝对含量增加，说明美拉德反应产物的添加丰富了虾肉糜在微波加热下的的香味。
美拉德反应产物的添加可以在提高南极磷虾虾肉糜微波加工效率的同时，又丰富其香味，为南极磷虾及其相关水产品的开发利用和品质提升提供新的方法和理论依据。
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2. Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology, Shanghai 201306, China;
3. National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering, Shanghai 201306, China