中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)属软甲纲(Malacostraca)十足目(Decapoda)，主要分布在亚洲北部、朝鲜西部和中国，是我国水产养殖业主要的淡水蟹类养殖品种之一，经济价值较高^[1]。蟹类在个体的生长发育过程中会蜕去旧外壳，形成新外壳以适应不断生长的身体^[2]。中华绒螯蟹一生中一般蜕壳15 ~ 20次^[3-4]。蟹在蜕壳时容易遭受生物敌害，对环境较敏感，因此蜕壳的中华绒螯蟹存活率较低^[5]。如何提高蜕壳存活率，降低养殖成本，提升经济效益，仍然是中华绒螯蟹养殖业亟待解决的问题之一。蜕壳是一个复杂的生理过程，目前已经有蜕壳行为和形态^[6-7]、营养生化指标^[8-12]、环境胁迫处理^[13]和蜕壳相关基因^[14-15]等方向的研究。

目前，甲壳动物常被作为研究钙离子交换的模型物种^[16]。中华绒螯蟹作为甲壳动物，其蜕壳过程与钙离子交换密切相关，因而极具有研究钙离子交换的价值。中华绒螯蟹蜕壳时，体内的钙离子随着旧外壳的脱落而迅速流失，体表软而脆弱，蜕壳后机体迅速从水体、食物等获取钙质，以便新外壳的形成及硬化^[17]。在人工养殖中，蟹出现大面积蜕壳时，为防止缺乏钙质导致蟹蜕壳不遂，养殖户往往会向水体和饲料中添加钙制剂以帮助蟹顺利蜕壳^[18]。钙离子主要通过2种方式进入蟹的机体内，一种是通过摄入饲料经过消化系统进入机体，另一种则是通过鳃从水体中吸收^[19]。鳃不仅是蟹的呼吸器官，还具有调节渗透压平衡和离子交换的功能^[20]。中华绒螯蟹的鳃共有6对，分为前鳃(前3对)和后鳃(后3对)，前鳃主要负责呼吸，后鳃负责调节渗透压平衡和离子交换^[21]。已经有研究表明，在重金属胁迫条件下，鳃的结构会受到不同程度的损伤^[23-24]，并且鳃的组织结构状况决定着鳃能否正常发挥其生理功能^[22]。目前，在中华绒螯蟹的不同蜕壳时期，已经有肝胰腺、肌肉、Y器官等组织的显微与超微结构的研究^[29-33]，但对鳃的组织结构变化的研究几乎没有。而在其他甲壳动物上，已经有较多对鳃的组织结构的相关研究^[25-28]。

因此，在中华绒螯蟹的蜕壳周期内，对不同蜕壳时期鳃和外壳中的钙含量进行测定，并观察其组织结构的变化，为完善中华绒螯蟹蜕壳方面的研究，进一步研究如何提高中华绒螯蟹的蜕壳存活率，开展健康养殖，提高经济效益提供理论支持。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验中所用到的中华绒螯蟹取自上海海洋大学崇明基地养殖场，在室内养殖系统中驯化、养殖及采样。蟹为一年生幼蟹，背甲宽20~30 mm，平均体质量为(5.82±2.47) g。蟹养殖在配置有循环水系统的双层玻璃养殖缸内，养殖缸内部用亚克力板分隔为多个隔间，1个隔间内放置1只蟹。养殖期间，每天更新约1/4的水，自然水温(20~25 ℃)，持续充氧，自然光节律，持续时间约为60 d。每天傍晚喂食(基地配制的饲料)，喂食前清理残饵。根据康现江等^[34]的方法确定蟹的蜕壳时期，各个蜕壳时期均采集10只蟹用于实验。本研究均采集中华绒螯蟹的后鳃。考虑到蟹壳不同位置的钙含量和组织特征可能有差异^[35]，因此均采集蟹背甲中间位置的外壳。蜕壳期的蟹取刚蜕壳半小时以内的蟹，超过半小时但外壳还未硬化的则归为蜕壳后期。解剖前4 ℃低温麻醉，取蟹的后鳃和外壳样品分别置于-40 ℃冰箱保存用于钙含量的测定及固定液中固定用于显微和超微结构的观察。

1.2 实验方法

鳃样品测定前经冰浴匀浆，然后离心得到匀浆上清液测定钙含量(钙测试盒购自南京建成)，用mmol/gprot表示。外壳样品在硝化反应后进行钙含量测定(电感耦合等离子放射光谱法)，用mg/kg表示。

光学显微镜观察用样品预处理方法：样品置于Bouin式液里固定24 h，采用梯度乙醇脱水，然后用二甲苯透明，石蜡进行包埋，切片厚度为5 μm，最后用苏木精和伊红进行常规H.E染色。

电镜样品预处理方法：样品置于多聚甲醛固定液中24 h，用1%锇酸和磷酸缓冲液PB(pH 7.4)室温下固定2 h，然后用梯度乙醇和丙酮脱水。鳃样品用812包埋剂包埋，切片厚度为60 ~ 80 nm，经铀铅双染色用于透射电镜观察。外壳样品经临界点干燥仪干燥，然后喷金30 s进行导电处理，用于扫描电镜观察。

1.3 数据分析

数据采用平均值±标准差表示，P < 0.05为统计学差异显著。采用Levene检验法检测方差齐次性，采用ANOVA对实验结果进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，采用t检验法检测样本含量较小的数据。

2 结果 2.1 中华绒螯蟹钙含量的变化 2.1.1 鳃中钙含量的变化

在1个蜕壳周期内，蜕壳前期的钙含量最高，蜕壳期的钙含量最低(P < 0.05)。从蜕壳间期到蜕壳前期，蜕壳期到蜕壳后期，中华绒螯蟹鳃中的钙含量均略有升高(P>0.05)。见图 1。

2.1.2 外壳中钙含量的变化

在蜕壳周期内，蜕壳间期外壳中的钙含量最高，蜕壳期的钙含量最低(P < 0.05)。蜕壳间期和蜕壳前期的钙含量差异不显著，蜕壳期和蜕壳后期的钙含量差异不显著(P>0.05)。见图 2。

2.2 中华绒螯蟹的显微结构观察

中华绒螯蟹在蜕壳间期和蜕壳前期的鳃差异不显著，都有完整的鳃结构，鳃丝排列整齐，每个鳃丝都有中央血腔，血腔中内容物丰富，柱细胞将血腔分隔，鳃丝末端的边缘管空腔明显(图版Ⅰ-1, 2)。在蜕壳期和蜕壳后期，鳃的中央血腔中均有内容物，但是蜕壳后期的内容物染色较浅。在蜕壳期，内外角质层离散明显，边缘管处的空腔较大(图版Ⅰ-3)，直到蜕壳后期，鳃的内外角质层开始聚集(图版Ⅰ-4)。

2.3 中华绒螯蟹的超微结构观察 2.3.1 鳃的超微结构观察

以蜕壳间期为参照，鳃腔中的线粒体丰富，角质层附近的微绒毛结构密集，鳃腔中充满内容物，染色较深(图版Ⅱ-1)。在蜕壳前期，核仁及其周围的内容物的染色加深(图版Ⅱ-2)。在蜕壳期，相较于前期和间期，鳃腔中的线粒体数量更为丰富，微绒毛数量较多，鳃腔中的内容物含量减少，染色颜色较浅(图版Ⅱ-3)。在蜕壳后期，相较于蜕壳期，鳃腔中的线粒体和微绒毛数量均增多，并且内容物含量增多(图版Ⅱ-4)。

2.3.2 外壳的超微结构观察

如图版Ⅲ所示，以蜕壳间期为参照，中华绒螯蟹的外壳具有4层结构，分别是上表皮、外表皮、内表皮和膜层，其中外表皮和内表皮较厚，可见层状结构。与内表皮相比，外表皮的层状结构更为细密(图版Ⅲ-1)。在蜕壳前期，可以观察到除膜层以外的其他3层结构，内表皮最厚(图版Ⅲ-2)。在蜕壳期，蟹的外壳明显变薄，可以观察到上表皮和外表皮已经开始形成(图版Ⅲ-3)。在蜕壳后期，蟹的外壳仍然较薄，外表皮开始形成，外表皮和内表皮的界面不清晰(图版Ⅲ-4)。

3 讨论

不同生境下的蟹鳃具有不同的结构特征^[22]。由于中华绒螯蟹是两栖蟹，其鳃的边缘管处具有空腔，这种结构有利于蟹灵活地调节渗透压和交换离子，而三疣梭子蟹的生活水域较稳定，其鳃的边缘管处没有发现这种空腔结构。这一现象不仅解释了不同生境会导致蟹鳃的组织结构不同，也表明蟹鳃的组织结构可以反映其适应的功能，不同功能的鳃具有不同的组织结构特征。鳃是中华绒螯蟹主要的离子转运器官，与蟹的钙离子交换过程有密切关联，因此，观察蟹在不同蜕壳时期鳃的组织结构特征，区分不同蜕壳时期的特征差异，可以从组织学的角度解释中华绒螯蟹的钙含量变化。

3.1 中华绒螯蟹鳃和外壳的钙含量变化

中华绒螯蟹在蜕壳前需要吸收储存大量能量为蜕壳做准备^[4]，鳃中的钙含量在蜕壳前期增加。有研究^[36]表明蟹在蜕壳前会吸收旧外壳中的钙用于蜕壳后新外壳的矿化，在蜕壳前期，中华绒螯蟹外壳中的钙含量在蜕壳期降低，蟹机体内的部分钙随着旧壳的蜕去而流失，因此在鳃和外壳中的钙离子含量均减少，外壳中的钙大量流失。到蜕壳后期，随着蟹对钙的摄取和吸收，鳃和外壳中的钙含量逐渐增加^[37-38]。田志环等^[28]的结果显示，外壳中的钙含量在蜕壳期最高，在蜕壳后期较低，这与本研究的结果不一致，推测可能是蜕壳时期确定方法及取样位置的不同导致的差异。

3.2 中华绒螯蟹鳃和外壳的组织结构变化

中华绒螯蟹鳃的边缘管空腔对蟹运输血液、离子交换和调节渗透压具有重要作用^[26]。在蜕壳期，鳃的边缘管空腔尚未恢复正常形态，鳃的离子交换功能可能受到影响，钙含量较低。到蜕壳后期，鳃的边缘管空腔形成，钙含量增加。电镜观察结果表明，鳃腔中的内容物含量在不同蜕壳时期发生变化，推测内容物可能是血液或脂类等营养物质。微绒毛与线粒体参与细胞的生长与分裂等活动，其数量与细胞的活跃程度密切相关。在蜕壳期，鳃腔中的线粒体和微绒毛数量较多，表明鳃的细胞活动较为活跃。到蜕壳后期，线粒体和微绒毛趋于密集，线粒体在细胞核和微绒毛周围聚集，可能表明蟹在蜕壳后进行活跃的生理活动，以快速恢复身体各项机能。在蜕壳期，相较其他3个蜕壳时期，外壳非常薄，仅有上表皮和外表皮，在蜕壳前期，外壳内表皮的层状结构明显。有研究^[32]表明，在蜕壳前期，外壳中的糖类、蛋白质和胶原纤维等物质都被重新吸收，并且蟹在蜕壳前已经形成部分新外壳，因此，外壳的钙含量在蜕壳前期降低。本文初步研究了中华绒螯蟹幼蟹在不同蜕壳时期的钙含量及鳃和外壳的形态特征变化，后续将继续在分子水平研究不同蜕壳时期鳃和外壳的钙分布及转运机制，以促进中华绒螯蟹在蜕壳方面的基础生物学研究。