2021,
Vol. 30
2. 上海海洋大学 国家海洋生物科学国际联合研究中心, 上海 201306;
3. 密歇根州立大学 渔业与野生生物系, 美国 密歇根 东兰辛 48824
自然界中的生物体依靠强大的免疫功能抵御和清除入侵的病原体，使生物体处于动态平衡[1]。目前，病原体与宿主之间的相互作用关系是免疫学领域关注的焦点[2]。鱼类作为脊椎动物，尤其是硬骨鱼类，其免疫系统与哺乳类存在极大的相似性[3]。对其免疫系统研究[4]发现，鱼类的免疫系统主要以细胞免疫和体液免疫的方式对外来病原进行免疫应答。细胞因子行使广泛的免疫防御功能，在众多生物的生理过程中发挥关键作用[5]。
细胞因子来源于被活化后的单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等，其本质是具有广泛生物学活性的一类小分子蛋白质[6]，是重要的免疫信号分子，与相应的细胞受体结合，发挥信号转导、调控炎症反应等生物学效应[7]。它们通常在静息状态下合成量很低，只有在受到刺激后分泌才会升高，以协同作用的方式作用于不同的细胞因子、病原相关分子等[8]。白细胞介素(interleukins，IL)是一类非常重要的细胞因子，成员众多，功能复杂。
白细胞介素11(IL-11)是具备多种功能的细胞因子，来源于骨髓基质细胞，调控造血和巨核细胞系祖细胞的生长[9-10]。临床上已广泛用于非髓性白血病化疗后Ⅲ、Ⅳ度血小板减少症和实体瘤等疾病的治疗[11-12]。近期有关报道[11]称，IL-11通过非经典细胞外蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)依赖性自分泌途径调控成纤维蛋白的活化与失活，进而影响组织器官的纤维化。IL-11可通过调控硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein, TXNIP)的表达从而参与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)逃避宿主的固有免疫[13]。异育银鲫(Carassius auratus)IL-11在鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染过程中发挥先天免疫的作用[14]。鲤科鱼类有il-11a 和il-11b两个直系同源基因，并且它们在免疫应答过程中可能扮演着不同的角色[15]。但是对其转录水平的调控机制及其启动子的研究鲜有报道。
斑马鱼(Danio rerio)、鲤(Cyprinus carpio)和金鱼(Carassius auratus)同属于鲤科硬骨鱼类，近年来广泛应用于早期发育、药物筛选、环境毒理等研究领域。斑马鱼作为脊椎动物，比果蝇和线虫更接近人类[16]，而且十分有利于观察病原体与鱼体内免疫细胞的实时动态变化关系[17-18]。但是，目前相关抗体及细胞系的稀缺是斑马鱼研究的瓶颈，如何以斑马鱼为模型有效地深入研究基因的功能变得十分艰难，找到可行的办法显得格外重要。
目前，报告基因是基因功能研究的有效办法，其中启动子活性的检测通常用到双荧光素酶报告基因系统。因此构建报告基因系统可对目的基因所具备的功能及其所参与的信号通路提供有力的研究工具。目前张秋月等[19]、岳倩文等[20]分别构建了斑马鱼tnfβ和ifnγ的报告基因，为斑马鱼免疫应答机制研究提供了有力工具。但通过文献检索，未发现斑马鱼il-11b的启动子报告基因。本研究通过序列分析，对斑马鱼il-11b的启动子区进行研究，从而构建il-11b基因的荧光素酶报告系统，为今后深入研究与其调控机制相关的转录因子及细胞因子调控网络奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验用鱼试验用斑马鱼来源于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，本实验室参照Westerfield(或http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)养至性成熟。试验按照上海海洋大学动物伦理委员会的相关规定进行(SHOU-DW-2016-002)。
1.2 试验方法 1.2.1 斑马鱼il-11b启动子生物信息分析利用UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/index.html)和Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)数据库获得斑马鱼il-11b启动子序列；利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)及PomoterScan 2.0(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)预测启动子区；利用EMBOSS Cpgplot(http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)和Methprimer-Design(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)预测CpG岛。利用AliBaba(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html) 预测潜在转录因子结合位点。
1.2.2 斑马鱼il-11b启动子报告基因载体构建按照设定的试验流程(图 1)构建斑马鱼il-11b启动子报告基因载体。利用DNA提取试剂盒(TIANGEN，PD324-03)提取斑马鱼尾鳍基因组DNA。根据预测的启动子序列，设计引物(表 1)，按照试剂盒PrimeSTAR® Max DNA Polymerase(TaKaRa，R045Q)说明进行PCR扩增，产物经凝胶电泳检测，如条带单一则直接按照试剂盒(TIANGEN，DP204)说明进行，如条带不单一则进行目的片段割胶回收(TIANGEN，DP209-02)，纯化产物按照试剂盒(TaKaRa，6109)进行加A尾反应，反应结束后按照试剂盒(TaKaRa, D102A) 连接pMD19-T载体，之后按照试剂盒(TIANGEN, CB101)转化DH5α，并按照试剂盒(TaKaRa，9152A)挑选单克隆扩培后进行菌液PCR，选取条带明亮单一的克隆进行测序。按表 1中酶切位点引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测，纯化回收PCR产物，将其和pGL3-Enhancer同时按照表 1核酸内切酶酶切位点双酶切，其后操作除测序外同1.2.2节，扩大培养菌液后按照试剂盒(TIANGEN, DP106-02) 提取重组质粒，然后进行双酶切检测，酶切反应均按照试剂盒说明书进行，Kpn Ⅰ(TaKaRa，1068S)、Sac Ⅰ(TaKaRa，1078S)、Nhe Ⅰ(TaKaRa，1241S)。
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图 1 il-11b启动子报告基因构建过程 Fig. 1 Progress of construction of the il-11b promoter reporter gene |
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表 1 启动子片段引物序列 Tab.1 Primer sequences of promoters |
HEK293T细胞培养于10% FBS-DMEM培养液、37 ℃、5% CO2培养箱中，每48 h传代1次，转染前24 h以约2.0×104/孔的密度接种于96孔细胞培养板，达到80%汇合度，进行转染，转染试剂混合物及转染条件按照试剂盒X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche, 06366236001)说明进行。37 ℃、5% CO2培养24 h，荧光素酶检测按照试剂盒Dual-Luciferase® Reporter Assay System(Promega，E1910)使用说明进行，将Firefly Luciferase与Renilla Luciferase进行对比。每次实验设3个复孔，每组实验重复3次。使用Prism graphpad画图，利用SPSS软件进行显著性分析(n=3，ns P>0.05，* P＜0.05，** P＜0.01)。
2 结果与分析 2.1 斑马鱼il-11b启动子序列生物信息学分析 2.1.1 il-11b启动子区域预测分析在UCSC数据库获得一条il-11b 3 000 bp启动子序列，分别使用生物信息学在线软件Promoter 2.0和PromoterScan 2.0对序列进行潜在的启动子区域预测(图 2)，设置cutoff值为53.00。Promoter 2.0在il-11b 3 000 bp启动子序列上预测到2个非常可能的启动子区，分别位于-1 500 bp和-900 bp；PromoterScan 2.0预测到3个启动子区(图 1)，第1个启动子区位于-2 957 bp~-2 701 bp，启动子得分=215.93，第2个启动子区位于-2 502 bp~-2 252 bp，启动子得分=61.20，第3个启动子区位于-1 372 bp~-1 122 bp，启动子得分=66.48，并预测到在转录起始过程中起到至关重要作用的TATA框(TATA box)和转录起始位点(Transcription Start Site, TSS)，分别位于-1 160 bp和-1 130 bp。
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图 2 il-11b的5′调控序列上潜在的启动子区域 Fig. 2 Schematic representation of il-11b promoter construction |
根据Promoter 2.0的预测结果，初步判断斑马鱼il-11b 3 000 bp启动子序列的启动子区域应该位于-1 500 bp至-900 bp。根据PromoterScan 2.0的预测结果，因为TATA box和TSS位于第2个启动子区，所以il-11b核心启动子区应该位于-1 372 bp至-1 122 bp，并且在其上游远端-2 957 bp~-2 707 bp和-2 502 bp~-2 252 bp存在调控元件。综合考虑两个生物信息学预测分析的结果，斑马鱼il-11b启动子区域可能位于-2 957 bp~-900 bp。
2.1.2 il-11b启动子序列CpG岛预测及分析启动子的一个结构特征就是CpG岛，对真核生物的转录调控起到重要作用，其为转录起始位点处的高CG含量DNA序列，存在十分广泛，一般长于200 bp；G+C含量在50%以上，同时pCpG >0.6×pG×pC，其可为启动子预测并提高预测效率提供帮助[21]。分别使用EMBOSS Cpgplot和Methprimer-Design软件预测斑马鱼il-11b 3 000 bp启动子序列上的CpG岛。
用EMBOSS Cpgplot软件预测到2个CpG岛，分别位于-2 829 bp~-2 528 bp(302 bp)和-1 665 bp~-1 456 bp(210 bp)，见图 3a。使用Methprimer-Design在斑马鱼il-11b 3000 bp序列上预测到7个CpG岛，Island 1位于-2 829 bp~-2 528 bp(302 bp)，Island 2位于-2 476 bp~-2 376 bp(101 bp)，Island 3位于-2 307 bp~-2 155 bp(153 bp)，Island 4位于-1 929 bp~-1 820 bp(110 bp)，Island 5位于-1 665 bp~-1 456 bp(210 bp)，Island 6位于-792 bp~-686 bp(107 bp)，Island 7位于-641 bp~-526 bp(116 bp)，见图 3b。
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图 3 il-11b基因启动子区CpG岛预测结果 Fig. 3 Results of CpG island prediction in il-11b promoter |
利用AliBaba预测il-11b启动子序列上潜在的转录因子结合位点，包括Adf-1、Krox-24、Sp1、CACCC-box、Egr-1、ICSBP、c-Jun、COUP、GR、RAP1、NF-kappaB、REV-Erbalpha、ER、RAR-alpha1、RXR-beta、SRF、Oct-1、Oct-2、Pit-1a、GCN4、HNF-1、TBP、C/EBPalpha、HNF-1C、Oct-2.1、USF等。
对预测出来的各个转录因子结合位点位置、出现次数及对应的转录因子功能进行统计，结果发现，在斑马鱼il-11b 3 000 bp启动子序列上出现次数最多的转录因子结合位点是Sp1(special protein1，Sp1)，多达26次, 而其他的转录因子结合位点出现的次数均不多于5次，其中, RAP1出现4次，GR、ER、RAR-alpha1、RAR-beta、Oct-1各出现2次，其余转录因子均只出现1次。
2.2 斑马鱼il-11b启动子报告基因载体构建以斑马鱼基因组为模板，以il-11b启动子序列设计引物，进行PCR扩增，产物经电泳检测，扩增的条带出现在目的片段处，且无杂带(图 4a)。将扩增的序列连接至pMD-19T载体转化至DH5α感受态细胞中，进行测序，序列比对正确。表明笔者成功克隆了il-11b不同片段长度的启动子。以测序成功的菌液作为模板，按照表 1的限制性核酸内切酶进行酶切位点PCR，纯化后与载体pGL3-enhancert同时进行双酶切，纯化后进行酶切片段与酶切载体连接。之后转化，扩大培养，并抽提质粒。将重组质粒进行双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，均出现2条带，约5.0 kbp的为载体条带，约3.0 kbp、2.0 kbp、1.0 kbp、0.5 kbp的为启动子片段条带(图 4b)。
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M.5 000 bp DNA marker；1.il-11b；2.il-11b-Δ1；3.il-11b-Δ2；4.il-11b-Δ3；5.il-11b-Δ4；6.il-11b-Δ5。 图 4 il-11b启动子PCR产物电泳及双酶切检测电泳 Fig. 4 Electrophoresis of il-11b promoter PCR product and double digestion detection |
将对照组质粒pGL3-Enhancer和实验组构建的目的片段pGL3-il-11b、pGL3-il-11b-Δ1、pGL3-il-11b-Δ2、pGL3-il-11b-Δ3、pGL3-il-11b-Δ4、pGL3-il-11b-Δ5重组质粒分别转染HEK293T细胞，表达一定时间后用双荧光素酶报告基因系统检测酶活。结果显示，构建的不同片段长度的il-11b启动子报告基因的荧光素酶较对照质粒的活性存在差别，其中pGL3-il-11b、pGL3-il-11b-Δ1、pGL3-il-11b-Δ2、pGL3-il-11b-Δ3、pGL3-il-11b-Δ4、pGL3-il-11b-Δ5质粒转染组分别为pGL3-Enhancer对照转染组的1.94、9.11、0.75、1.32、14.92、5.33倍(图 5)，使用SPSS进行显著性分析(n=3，ns P>0.05，* P＜0.05，**P＜0.01)。
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n=3; ns P>0.05; * P＜0.05; *** P＜0.001; **** P＜0.000 1。 图 5 重组质粒pGL3-il-11b-promoter-Enhancer转染HEK293T细胞后荧光素酶相对表达量 Fig. 5 Luciferase relative expression of recombinant plasmid pGL3-il-11b-promoter-Enhancer after transfecting HEK293T |
通过生物信息手段获得斑马鱼il-11b的启动子序列并对其进行相关的分析，在此基础上成功构建启动子报告基因，为研究细胞因子调控网络及相关信号通路之间的调控提供了强有力的研究工具。
利用UCSC Genome Browse数据库预测并获得斑马鱼il-11b启动子序列，Promoter 2.0预测出2个启动子区，Promoter 3.0预测出3个启动子区，且发现TSS和TATA框。TATA框为TBP(TATA box binding protein)提供结合位点，两者是转录起始的关键因子，说明il-11b启动子序列上存在多个调控转录的元件。预测结果的不同是因为二者算法的差异，Promoter 2.0采用的是基于神经网络的算法函数，而PromoterScan 2.0采用的是基于位置矩阵的算法函数。之前大多数的研究仅采取一种算法软件进行启动子区预测，考虑到不同算法的准确性，本研究采用代表 2种算法的软件对启动子区进行预测，可以尽可能准确地预测序列中所包含的启动子区。
CpG岛通常以甲基化状态位于基因的启动子区和第一个外显子区。启动子区的甲基化导致DNA发生构象改变，影响转录因子与DNA之间的互作，降低RNA聚合酶对启动子的识别，甚至无法识别，造成基因转录降低，甚至沉默[22]。本研究中利用EMOSS CpG plot在il-11b启动子序列上预测出2个CpG岛，利用Methprimer-Design预测出7个CpG岛。虽然两款软件的预测结果存在差异，但是2个软件均预测出-2 829~-2 528(302 bp)和-1 665~-1 450(210 bp)2个位置可能存在CpG岛。因为CpG岛是预测启动子并提高预测准确性的重要序列，所以我们所获得序列的启动子可能存在于-2 829 bp~-2 528 bp和-1 665 bp~-1 456 bp处。之所以Methprimer-Design预测出的结果多于EMBOSS Cpgplot，是因为这两个预测软件所使用的函数关系是不同的，因为CpG岛长于200 bp，而Methprimer-Design预测出的CpG岛中Island 2, Island 3, Island 4, Island 6, Island 7长度均小于200 bp，表明Methprimer-Design对CpG岛的预测存在假阳性现象。
用AliBaba预测出启动子序列上存在Adf-1、Krox-24、Sp1、CACCC-box、Egr-1、ICSBP、c-Jun、COUP、GR、RAP1、NF-kappaB、REV-Erbalpha、ER、RAR-alpha1、RXR-beta、SRF、Oct-1、Oct-2、Pit-1a、GCN4、HNF-1、TBP、C/EBPalpha、HNF-1C、Oct-2.1、USF等位点。其中Sp1、USF、C/EBPalpha和NF-kappaB[22]是直接参与炎症反应的细胞因子，表明斑马鱼il-11b可能在免疫调控的过程中发挥重要作用。Sp1调控管家基因的表达，参与细胞增殖、分化、细胞凋亡、衰老、DNA损伤反应、血管生成和炎症发生等过程[23-24]，表明斑马鱼il-11b可能在以上这些过程中扮演重要角色。因此，构建的报告基因质粒对于探究 il-11b的功能以及其在免疫应答信号通路中参与的具体机制提供了有力的工具。
通过双荧光素酶检测系统，发现构建的斑马鱼il-11b不同位置和大小的启动子存在活性差异(图 5)，il-11b、il-11b-Δ1、il-11b-Δ4、il-11b-Δ5启动子活性较对照组有显著性增强，且强度依次降低，而il-11b-Δ2、il-11b-Δ3启动子活性较对照组没有显著性差异，说明斑马鱼il-11b基因的核心启动子区域为-3 000~-2 000 bp，有待后续进行详细的研究。
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ZHANG Qiuyue1,2,
ZHANG Zhe1,2,
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YUE Qianwen1,2,
REN Jianfeng1,2,
LI Weiming3,
ZHANG Qinghua1,2
2. International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA