2020,
Vol. 29
2. 国家淡水水产品加工技术研发分中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹、毛蟹、大闸蟹，在我国分布广泛，是我国重要的淡水养殖经济水产品，2018年，我国中华绒螯蟹的养殖产量高达75.68万t[1]，因其营养价值高、风味独特而从古至今备受消费者的青睐[2]。有研究表明，中华绒螯蟹较高的营养价值和独特的风味与其多不饱和脂肪酸含量较高有很大关系[3]，鱼油富含n-3 PUFA，因此通常在河蟹育肥饲料中添加合适比例的鱼油来提高河蟹的品质，但近年来鱼油市场供不应求导致其价格不断增长，因而在配合饲料中使用来源广泛、供应稳定、价格低廉的植物油来替代鱼油越来越受到关注[4-6]。同时有学者[6]研究发现，单一使用鱼油不能满足某些水产品的营养需求，而与植物油进行搭配时不仅能满足其营养需求，而且能提高品质。不同的植物油的脂肪酸组成也有差别，因此不同的植物油混合使用能起到脂肪酸互补和平衡的作用，有利于蟹等水产品的生长发育[7]。
先前的研究[8-11]表明，饲料中合适比例植物油替代鱼油对中华绒螯蟹的生长性能没有负面影响，同时可强化营养品质，改善脂肪酸组成，增加香气物质。豆油和菜籽油是目前育肥饲料中最常用的两种植物油，其脂肪酸组成具有一定的互补性，因此采用两者混合使用具有一定的优势[8]。本研究依据课题组先前研究结果使用混合植物油[m(豆油):m(菜籽油)=3:1]替代鱼油进行实验，探讨饲料中植物油部分或全部替代鱼油对中华绒螯蟹可食部位脂肪酸组成的影响，以期为养殖中华绒螯蟹的品质改善和育肥饲料中鱼油替代源的开发等提供一定的理论依据和实践参考。
1 材料与方法 1.1 实验饲料及蟹的养殖根据本课题组前期实验已确定的雌蟹饲料中混合植物油[m(豆油):m(菜籽油)=1:1]替代鱼油的适合水平为50%，且基于50%植物油替代鱼油的水平下豆油与菜籽油的适宜比例为3:1。因此本实验中，配制全鱼油饲料、50%植物油替代鱼油饲料[m(豆油):m(菜籽油)=3:1]和全植物油饲料[m(豆油):m(菜籽油)=3:1]3种等氮等脂育肥饲料，分别记为F1、F2和F3，具体饲料配方见表 1，于-20 ℃冰箱中保存备用。
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表 1 实验饲料配方 Tab.1 Feed formula of experiment |
实验的成蟹采自崇明养殖池塘，均为生殖蜕壳后的雌蟹，体质量为95 g左右，挑选270只附肢健全、体无外伤、活力良好的个体用于育肥实验。本研究中共3个饲料组，每个饲料组设6个重复水槽，每个水槽随机放入15只雌蟹。养殖实验从2018年9月初至11月中旬，养殖期70 d。
1.2 实验样品实验所用中华绒螯蟹于2018年11月21日采自上海海洋大学水产与生命学院崇明养殖基地，并立即运回实验室。3组随机选取20只蟹，清洗后立即活体解剖，分别取出体肉(仅指腹肉，不包括足肉和钳肉)、肝胰腺及性腺，将每组相同部位样品混合均匀分装至小密封袋，均冻藏于-80 ℃冰箱用于后续实验分析。
1.3 主要试剂和设备试剂：37种脂肪酸甲酯标准品、十九烷酸及十九烷酸甲酯标准品购自于上海安谱科技股份有限公司；正己烷、三氟化硼-甲醇选用色谱级；三氯甲烷、甲醇、氯化钠等均为分析级。
设备：电热恒温水浴锅(上海一恒，HWS24)；旋转蒸发仪(德国IKA, RV10 basic)；气相色谱仪(美国Thermo, TRACE GC ULTRA)。
1.4 实验方法 1.4.1 粗脂肪的测定粗脂肪参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》的石油醚索氏提取法测定。
1.4.2 脂肪酸组成的测定参照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》并稍作修改。
总脂的提取：称取体肉2.0 g(精确到0.001 g)，性腺和肝胰腺各1.0 g(精确到0.001 g)于100 mL锥形瓶中，加入V(氯仿):V(甲醇)=2:1充分浸提样品24 h，过滤后加入0.9% NaCl溶液，振荡后静置2 h，待分层完全后移走上层甲醇溶液，重复以上操作两次后用无水硫酸钠过滤，转移下层溶液至圆底烧瓶，在45 ℃水浴条件下旋转蒸发后将烧瓶置于干燥器中冷却至恒重得到总脂。
脂肪酸甲酯化：将上述圆底烧瓶中加入5 mL 0.5 mol/L NaOH-CH3OH溶液和100 μL 10 mg/mL十九烷酸内标溶液，在沸水浴上回流10 min至看不见油状物，然后加入3 mL三氟化硼-甲醇溶液再回流5 min，继续加入2 mL正己烷溶液回流2 min，最后加入饱和NaCl溶液10 mL振摇、静置分层，吸取最上层油状物并用0.22 μm有机相滤膜过滤后注入进样瓶待测。
气相色谱条件：Agilent SP-2560脂肪酸专用毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)。色谱柱初始温度：70 ℃，以5 ℃/min升温至140 ℃，保持1 min，随后以4 ℃/min升温至180 ℃，保持1 min，最后以3 ℃/min升温至225 ℃，保持30 min。汽化室温度：250 ℃，载气：N2，色谱柱流速：1 mL/min，分流比为45:1，进样体积为1.0 μL。
定性和定量分析：通过对比上述色谱条件下测试所得的38种脂肪酸甲酯混标的保留时间，对样品中的脂肪酸进行定性分析，以C19:0作为标准，计算不同脂肪酸的换算系数。同时，根据内标物C19:0峰面积与样品中脂肪酸峰面积，计算样品中单一脂肪酸的含量。
1.5 数据处理实验所有数据使用SPSS 20.0软件进行统计分析，结果均以平均值±标准偏差(Mean ± SD, n=3)表示，采用ANOVA分析，数据进行正态分布检验，符合正态分布的多重比较采用Duncan’s法，不符合正态分布的用Kruskal-Wallis检验，差异显著性为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 河蟹可食部位的脂肪含量分析图 1表明中华绒螯蟹各可食部位的粗脂肪含量不同，肝胰腺的粗脂肪含量大于20%，性腺的粗脂肪含量在15%左右，体肉的粗脂肪含量非常低，不到2%。3组中华绒螯蟹可食部位的脂肪含量无显著性差异(P>0.05)。
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图 1 饲料中植物油替代鱼油对中华绒螯蟹粗脂肪含量的影响(%湿重) Fig. 1 Effect of dietary replacement of fish oil by vegetable oil on crude lipid content of Eriocheir sinensis (% wet weight) |
饲料中的脂类是中华绒螯蟹生长发育所需的必需脂肪酸(Essential fatty acid, EFA)和能量的重要来源。EPA和DHA作为人类和动物所需的必需脂肪酸，其含量直接影响到水生动物的生长发育、免疫性能和脂肪酸组成[12-13]。十足目甲壳动物幼体虽具有利用亚油酸和亚麻酸部分合成EPA和DHA的能力，但这种能力非常有限[14]，因而需要在饲料中补充。鱼油中富含EPA、DHA等n-3PUFA[15]；大豆油中亚油酸(Linoleic acid, C18:2n-6)丰富，但饱和脂肪酸(Saturated fatty acid, SFA)所占的比例较大；而菜籽油的SFA所占比例较低，亚麻酸(Linolenic acid, C18:3n-3)与C18:2n-6的比值合理，油酸(Oleic acid, C18:1n-9)比例较高[16]。因此脂肪源的不同必然会导致各组饲料不同的脂肪酸组成。
由表 2中可看出，C16:0和C18:0是两种主要的饱和脂肪酸，且3组饲料中的含量没有显著性变化(P>0.05)。随着植物油替代鱼油比例的上升，总SFA的含量随之下降，C18:1n9c含量则随之显著增加(P < 0.05)，从而导致∑MUFA含量随之显著增加(P < 0.05)。植物油中亚油酸和亚麻酸含量较高，导致这两种脂肪酸的含量随植物油替代鱼油比例的上升而逐渐增加的结果，从而使得∑n-6 PUFA含量也随之增加。3组饲料中花生四烯酸(ARA, C20:4n6)含量无显著差异。EPA、DHA含量则随着植物油替代鱼油比例的上升而逐渐下降，导致∑n-3 PUFA含量的变化趋势随之一致。
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表 2 不同饲料的脂肪酸组成 Tab.2 Fatty acid composition of different feeds |
表 3显示，体肉中最主要的饱和脂肪酸C16:0和C18:0含量无显著性差异。尽管饲料中∑ SFA含量随着植物油替代鱼油水平的上升而减少，而∑MUFA含量随之增加，但是3组体肉中∑SFA和∑MUFA含量无显著性差异。
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表 3 饲料中植物油替代鱼油对中华绒螯蟹可食部位的脂肪酸组成的影响 Tab.3 Effect of dietary replacement of fish oil by vegetable oil on the fatty acid composition of edible parts of Chinese mitten crab |
油酸为体肉中含量最高的MUFA，DHA和EPA为体肉中含量最高的两种n-3 PUFA，亚油酸是含量最高的n-6 PUFA，与EPA含量相近。这些脂肪酸在3组体肉中的含量都无显著性差异。虽然在饲料中都能检测出ARA，但体肉中的ARA却痕量。3组体肉中∑n-3 PUFA和∑n-6 PUFA含量以及n-3/n-6 PUFA和EPA/DHA均无显著性差异。这些数据表明，饲料中植物油替代鱼油对体肉的脂肪酸组成影响不大。
2.3.2 河蟹性腺的脂肪酸组成分析3组性腺中主要的SFA、MUFA以及∑SFA和∑MUFA含量都无显著性差异，说明植物油全部或部分替代鱼油对河蟹性腺的SFA和MUFA的组成和含量影响不大。随着植物油替代鱼油水平的上升，亚油酸和亚麻酸含量随之增加，导致∑n-6 PUFA含量也随之增加。三组ARA含量无显著差异，而F2组性腺中EPA+DHA含量高于其他两组。
2.3.3 河蟹肝胰腺的脂肪酸组成分析3组肝胰腺中C16:0和∑SFA无显著性差异。随着植物油替代鱼油水平的上升，C18:1n9c和∑MUFA含量随之增加，这和对应饲料变化趋势一致。C18:2n6c、n-6 PUFA和∑PUFA含量也与对应饲料中的变化趋势一致，随着植物油替代鱼油水平的升高而升高，导致n-3/n-6比值逐渐下降。F3组肝胰腺中ARA含量显著低于其他两组，但F2组肝胰腺中ARA与F1组无显著性差异。F2组肝胰腺中的n-3 PUFA以及EPA+DHA含量显著高于F3组，与F1组无显著性差异。
3 讨论 3.1 饲料中植物油替代鱼油对脂肪含量的影响饲料是水产养殖动物的主要食物来源，为其提供所需营养成分，饲料中脂肪源的不同势必影响其生长发育[12]。本实验结果说明，饲料中使用植物油(质量比豆油：菜籽油=3:1)50%或全部替代鱼油对中华绒螯蟹育肥70 d后，对其体肉、性腺和肝胰腺的脂肪累积影响不大，这与WU等[5]得出的结论一致。易新文等[17]发现：饲料中菜籽油替代鱼油对大黄鱼肌肉的脂肪含量无显著影响，结合本实验结果，这可能是因为水产养殖动物肌肉中脂肪含量较低，不容易受饲料影响。同时，本实验所选用的生殖蜕壳后雌蟹中各组织部位脂肪含量相对稳定，且各饲料中脂肪含量一定，只是脂肪源不同，因而其脂肪含量不容易受影响。但赵磊等[9]研究得出“饲料中50%的鱼油替代水平有利于雄蟹肝胰腺和肌肉中的脂肪沉积”，可能由于实验选用中华绒螯蟹蟹的性别不同造成。WU等[11]研究发现植物油[m(豆油):m(菜籽油)=1:1)部分替代鱼油提高了雌性中华绒螯蟹肝胰腺的粗脂肪含量，可能是由于饲料以及养殖条件的差异所导致[18]。
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图 2 饲料中植物油替代鱼油对中华绒螯蟹可食部位的脂肪酸组成的影响 Fig. 2 Effect of dietary replacement of fish oil by vegetable oil on the fatty acid composition of edible parts of Chinese mitten crab |
鱼油和植物油中的脂肪酸组成不同，因而植物油替代鱼油后各饲料组中脂肪酸组成也不同。本实验结果表明，在中华绒螯蟹的3个可食部位均能被检测出SFA 10种、MUFA 6种、PUFA 10种，包含人体必需的n-6系列的亚油酸和n-3系列的亚麻酸。
总体而言，饲料中植物油替代鱼油对中华绒螯蟹可食部位中SFA组成及含量影响不大，SFA是主要的供能脂肪酸[19]，因而蟹需在体内储存SFA为其生存活动提供所需能量[20]，这证明了蟹中SFA组成可能具有较强的保守性。与脂肪含量一致，肝胰腺中∑ SFA含量高于性腺，体肉中最低。
河蟹体肉及性腺中脂肪酸组成以PUFA为主，而肝胰腺中则以MUFA为主(36%左右)，其占总脂肪酸的含量高于体肉(20%左右)和性腺(28%左右)，与WU等[21]的研究结果一致，这可能是由于育肥后期(11月)的水温较低，性腺发育速度下降并且肝胰腺需要贮存较多的MUFA用于过冬的能量消耗[22]。
油酸是饲料及蟹可食部位中最主要的MUFA，尽管饲料中其含量随着植物油替代鱼油水平明显呈现上升趋势，但是除肝胰腺中油酸含量与之变化趋势相同之外，3组体肉和性腺中均没有显著性差异，说明饲料中过量油酸并不能影响河蟹体肉和性腺中油酸的含量，但能显著影响肝胰腺中油酸含量。肝胰腺中∑n-6PUFA和∑PUFA含量随着植物油替代水平升高而升高，可能是由于植物油中亚油酸含量很高但缺乏鱼油富含的n-3 PUFA，激发了水生动物PUFA合成能力的提高，进而导致PUFA含量增加[23]。总的来说，肝胰腺的脂肪酸组成受饲料因素影响最大，这由于肝胰腺是中华绒螯蟹脂肪存储的部位，而非脂肪发挥功能性作用的部位，并且肝胰腺作为蟹脂肪酸的吸收和代谢中心[24]，其含量变化受饲料影响较为显著。
人们摄食水产品主要获取DHA、EPA以及ARA，其为人体营养、健康所必需，对降低胆固醇有很大帮助[25]。性腺中EPA、DHA和∑ n-3 PUFA含量高于体肉和肝胰腺，这可能是由于11月份是雌蟹性腺的快速发育时期，雌蟹肝胰腺中的脂肪酸，特别是n-3 PUFA会转移至性腺中供其发育所需，从而导致性腺内n-3 PUFA大量积累，而肝胰腺中n-3 PUFA含量有所下降[26-27]。
尽管饲料中所含ARA较低，但3组性腺及肝胰腺中ARA含量远超饲料所提供，证明中华绒螯蟹具有将亚油酸转化为ARA的能力，WU等[21]也有相关报道。蟹体肉中缺乏ARA，但富含DHA和EPA，占脂肪酸总量的30%左右，其含量超过饲料本身所提供。这可能由于河蟹在生长发育过程中，体肉中十八碳PUFA可以部分转化成DHA和EPA[24]，而过多的EPA对ARA有竞争排斥作用。性腺中的ARA含量较高，人们可通过摄食性腺补充ARA。
当使用50%植物油替代鱼油时，体肉、性腺和肝胰腺中EPA和DHA含量并没有减少，甚至在性腺中有增加，推测可能是河蟹在育肥阶段具有将亚油酸和亚麻酸合成DHA和EPA的一定能力。
从营养角度出发，FAO/WHO推荐人类饮食的n-3/n-6 PUFA比例为0.1~0.2时对人类健康有益，比值越高越有益[11]，合理的n-3/n-6 PUFA比例有利于降低血压、抑制不规律心脏跳动、维持能量平衡、糖代谢和其他慢性疾病的发生以及促进正常的生长发育[28-29]。本实验测得河蟹体肉n-3/n-6 PUFA比值(1.50~1.57)高于性腺(0.66~0.87)和肝胰腺(0.19~0.43)，说明从本角度看体肉的营养价值大于性腺和肝胰腺。
对于养殖者而言，使用50%植物油替代鱼油饲料不但有利于雌性中华绒螯蟹的脂肪酸组成，而且降低了养殖成本，促进了养殖业发展。
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2. National R & D Branch Center for Freshwater Aquatic Products Processing Technology, Shanghai 201306, China;
3. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China