2020,
Vol. 29
2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;
4. 上海海洋大学 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心, 上海 201306;
5. 上海申漕特种水产开发有限公司, 上海 201516
多环芳烃(PAHs)在各个环境介质中广泛存在，是一类具有半挥发性、高毒性和生物累积性的持久性有机污染物[1]。环境介质中的多环芳烃不仅具有致癌作用、致畸作用和致突变作用，而且还会对生物体的免疫系统产生一定的威胁[2-3]。因此，多环芳烃引发的各种环境污染问题正日益受到高度重视。罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)也被称为马来西亚大虾，是一种大型淡水虾，原产于印度洋、西太平洋岛屿[4]。罗氏沼虾因具有较快的生长速率且食物来源多样化、个体大、肉质好、生长快和易于养殖等优点，是目前我国重要的养殖虾类[5]。金山区是上海市水产养殖大区，尤其罗氏沼虾池塘养殖较多。据统计，2017年金山区养殖水产品产量为8.55×103 t[6]，廊下特种养殖场、漕泾爱国路虾类养殖场和朱行养殖场等重要的产学研基地都分布在金山区。如今消费者对于水产品质量安全日益关注，评估罗氏沼虾体内多环芳烃残留水平和潜在食用风险是当地政府和民众较为关心的问题。
这些污染物可能会通过大气干湿沉降和地表径流等多种途径进入水体，进而进入鱼、虾、蟹和贝等水生生物体内，通过食物链传递，最终被消费者食用后在人体内蓄积，进而对人体产生潜在的健康风险[7]。一般来说，鱼类等水产品只占人类饮食的一小部分(10%左右)，但已被证明也是污染物进入人体的主要途径之一[8-9]。因此，本文通过对金山区典型池塘内罗氏沼虾在完整养殖周期中PAHs的残留水平、生物体内的单体组成、生物累积特性、生长周期内的浓度变化、来源诊断以及食用风险评价等方面的跟踪监测和风险计算，基于PAHs的残留浓度评价金山区漕泾建国路某养殖虾塘内罗氏沼虾产品品质，为水产品质量评估和保障消费者的健康提供数据支撑和依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验中所用到的二氯甲烷(Dichloromethone)、乙腈(Acetonitrile)、石油醚(Petroleum ether)和无水乙醇等均为色谱纯，均购自国药集团；实验硅胶于马弗炉650 ℃下灼烧4 h，冷却后转移到干燥器中保存待用。16种PAHs混标购自安捷伦科技(中国)有限公司，置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2 样品采集采样虾塘于2018年5月22日投苗，并于养殖的关键阶段即7月至9月[10]在金山区漕泾爱国路虾类养殖场(8个虾塘)进行罗氏沼虾的采集，分别在7月12日(436尾)、8月2日(252尾)、8月24日(178尾)、9月14日(111尾)和9月27日(97尾)采样。样品由养殖人员从养殖虾塘中随机捕捞，并将样品装入铝箔自封袋中，标明虾塘号及采样时间。随后将采集的虾样置于事先加有冰袋的泡沫保温箱中运回实验室，在-20 ℃冰箱中保存待测。
1.3 样品的预处理萃取：将去除虾头、虾壳和肠腺后的肌肉剪碎，用铝箔包好冷冻干燥，再用玻璃研钵研磨成粉末。精确称取3 g(精确到0.001 g)研磨后的虾粉置于无水乙醇清洗过的萃取管中，加入15 mL二氯甲烷进行微波萃取。
去脂：将萃取得到的样品液氮吹至干，随后加入4 mL乙腈旋涡振荡1 min充分溶解后，再加入4 mL用乙腈饱和过的石油醚。旋涡振荡1 min，使其充分混合，再于3 000 r/min离心10 min，将上层溶有脂肪的石油醚层吸出，留下乙腈层。将余下的乙腈用氮气吹干，再加入2 mL左右的二氯甲烷溶解上述去脂后的残留物。
净化：实验硅胶事先置于马弗炉中将水分烘干，用10 mL的二氯甲烷冲洗硅胶净化柱后，将约2 mL浓缩去脂后的残留物转移到硅胶柱内，用10 mL二氯甲烷分多次进行净化处理，将净化后的洗脱液收集于玻璃离心管中，用氮气吹干浓缩洗脱液，最后用乙腈分多次清洗玻璃离心管将洗脱液定容至1 mL自动进样瓶中待测。
1.4 样品的测定采用气质联用仪测定样品中的PAHs[11]。色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，流速为1.2 mL/min，进样口温度280 ℃，进样量2 μL，进样方式不分流，升温程序以15 ℃/min的速率升至190 ℃，再以6 ℃/min的速率升至215 ℃，然后以20 ℃/min的速率升至280 ℃，保持10 min，最后以20 ℃/min的速率升至310 ℃，保持2 min。
1.5 质量控制与质量保证为保障数据准确，对其进行严格的质量控制，利用内标法定量获得样品浓度。16种多环芳烃分别为萘(NAP)、苊烯(ANY)、苊(ANA)、芴(FLU)、菲(PHE)、蒽(ANT)、荧蒽(FLA)、芘(PYR)、䓛(CHR)、苯并[a]蒽(BaA)、苯并[b]荧蒽(BbF)、苯并[k]荧蒽(BkF)、苯并[a]芘(BaP)、二苯并[ah]蒽(DBA)、茚并[1, 2, 3-cd]芘(IPY)和苯并[ghi]苝(BPE)。
罗氏沼虾体内PAHs测定方法的检出限及回收率如表 1所示。所有样品的测定均设置全流程空白实验及2个平行以保障数据准确性。
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表 1 罗氏沼虾体内PAHs测定方法的检出限及回收率(干质量) Tab.1 Detection limit and recovery rate of PAHs determination method in Macrobrachium rosenbergii(dry mass) |
采用终身致癌风险评价模型评估多环芳烃对人体健康危害的大小。因为目前仅苯并[a]芘具有致癌斜率因子(FCS)，因而常将PAHs各单体的浓度通过毒性当量因子(FTE)转化为BaP的毒性当量浓度进行终身致癌风险的估算(RILC，Incremental Lifetime Cancer Risk)，EBaP和RITL的计算公式：
(1)
(2)
式中：Ci表示第i个多环芳烃单体的浓度，ng/g；FTEi表示第i个多环芳烃单体基于BaP的毒性当量因子[1]；FCS为致癌斜率因子，采用苯并[a]芘的致癌斜率因子取值7.3 mg/(kg·d)[2]；RI是水产品的摄入速率，虾类为15.4 g/d[3]；FE是暴露频率，其值为365 d/a；DE是暴露持续时间，其值为30 a；W表示体质量，取值70 kg；TA是平均年龄，取值70 a。罗氏沼虾含水率按75%计算。
2 结果与讨论 2.1 罗氏沼虾体内PAHs的含量及组成特征育成期罗氏沼虾体内∑PAHs平均含量为106 ng/g(表 2)，除了ANY、ANA、DBA、IPY和BPF外，其余11种PAHs均被检出。与其他地区相比，低于长三角地区上海养殖虾塘(257 ng/g)、浙江养殖虾塘(120 ng/g)[15]、湛江地区(424.3 ng/g)[16]、巢湖秀丽白虾(489 ng/g)[17]和深圳大鹏湾养殖虾类(493 ng/g)[18]，略高于渤海湾养殖虾类(56.2 ng/g)[19]和厦门地区养殖虾类(21.3~27.2 ng/g)[20]，见图 1a。总体来讲，本养殖区罗氏沼虾PAHs含量在中等偏低水平，相比其他地区处于相对较低的污染状态。潜在的7种致癌性PAHs(BaA、CHR、BbF、BkF、BaP、DBA和IPY)浓度为29.9 ng/g，占∑PAHs比例为28.2%，占比较低。
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表 2 养殖周期中罗氏沼虾体内多环芳烃含量 Tab.2 PAHs content in the breeding cycle of M. rosenbergii |
对育成期即将上市的罗氏沼虾体内PAHs环数分析(图 1b)可知，3，4环结构的单体占∑PAHs的75.2%，环数分布以3~4环为主，占比最高的为4环单体(44.4%)，这与珠三角河网水产品组成研究结果一致[21]，其中尤以ANT、BaA和CHR等3种PAHs单体的含量(表 2)最为丰富，检出率为100%，这与其他研究者得出的淡水水产品中高环PAHs的积累较低环PAHs多的结论一致[22-23]，总体排序为4环>3环>2环>5环>6环，与环渤海地区养殖虾类体内环数分布(3环>2环>4环>5环>6环)有所不同，体内组成的差异可能是地区污染源不同所致，环渤海地区虾类污染主要来自于船舶石油泄漏污染[19]，而本研究虾塘地处内陆，受船舶石油泄漏污染可能性较小。长三角地区池塘养殖水产品以4环为主，主要来源于草木和煤的燃烧及成岩作用[15]。高环PAHs在罗氏沼虾体内累积浓度偏高可能与该地区PAHs污染状况有关，如工厂内煤等化石燃料的燃烧，因为燃烧途径生成的PAHs以高分子量单体为主[24]。此外，罗氏沼虾营底栖生活，一般与底泥直接接触的生物体内高环PAHs比例高于与水体直接接触的水生生物[18]。
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图 1 其他地区养殖水产品体内PAHs含量(a)及各时期组成特征(b) Fig. 1 Content of PAHs (a) in cultured aquatic products in other regions and characteristics of each period (b) |
将罗氏沼虾的养殖过程分为幼苗期、育成前期、育成中期、育成后期和育成期，养殖日龄分别为51、72、95、115和129 d，平均体质量为0.46、2.30、5.90、9.86和12.9 g，并对不同时期沼虾体内的PAHs含量(图 2)进行了跟踪分析。幼苗期至育成期PAHs含量从47.6 ng/g上升到106 ng/g，含量增加了1倍多，育成初期和育成后期PAHs在沼虾体内的浓度变化不大(增长率分别为19%和7%)，但中间存在一个沼虾体内PAHs含量迅速增加的阶段，育成前期至育成中期PAHs增加了52.0%。这种现象与沼虾养殖周期中生长速率关系最为密切(图 2)[25]，罗氏沼虾在养殖前期(60 d以内)生长速率较慢，中期到3月龄左右(60~100 d)为生长高峰阶段，体质量生长速度达到最大值，应加大投饵量以促进其生长[26]，此阶段对应的PAHs在其体内的累积速率也达到最大。因为此时罗氏沼虾的摄食量较大，来源于饲料本身及大气沉降和地表径流中的PAHs均可能进入到生物体内，导致PAHs残留的上升，因此应注重饵料投喂量，防止过多饵料残余，同时加强对水体和沉积物质量的监测，养殖中后期注重改良水体环境，减少外部PAHs污染。
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图 2 罗氏沼虾体内多环芳烃含量变化及体质量变化 Fig. 2 Changes of PAHs content and body mass in M. rosenbergii |
比值法是分析生物体内PAHs来源的主要方法，低相对分子质量(low molecular mass，LMM，2~3环的PAHs)和高相对分子质量(high molecular mass，HMM，4~6环的PAHs)的比值一定程度上可作为指示PAHs来源的指标[27]。LMM/HMM > 1表示低分子质量PAHs占比较多，说明污染主要来源于石油源；LMM /HMM < 1表示高分子PAHs占比较多，则污染主要来源于燃烧源[28-29]。从图 1可以看出，各时期LMM/HMM均小于1，初步表明罗氏沼虾体内PAHs主要来自燃烧源。为了进一步确认该区域中PAHs的来源，又采用了两种同分异构体比值法进行验证[30]，进一步明确了虾塘PAHs污染主要来源于草木、煤和化石燃料等的燃烧(图 3)。燃烧源可能来源于其远处工业区生产活动，该工业区进行工业生产活动已久，但对PAHs污染相关处理装备和预防措施上尚不完善，生产过程中的原油蒸馏以及催化裂化等生产工艺，使用以煤为主的化石燃料，不完全燃烧生成的污染要比天然气和石油严重得多。因此，草木、化石燃料等的高温燃烧是本实验虾塘PAHs的主要来源。
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图 3 育成期8个虾塘罗氏沼虾PAHs来源 Fig. 3 Source of PAHs from 8 shrimp ponds of M. rosenbergii during the breeding period |
根据公式(1)和(2)计算罗氏沼虾体内7种致癌性PAHs的苯并芘毒性当量浓度EBaP和食用风险值RILC(表 2)可知，养殖虾塘罗氏沼虾的食用健康风险随养殖日龄的延长呈上升趋势，育成期RILC(1.07E-06)与和庆[15]对上海池塘养殖罗氏沼虾的RILC(1.0E-06)评价结果水平相当，低于郑关超等[19]在2015年对环渤海地区养殖虾类的食用致癌风险结果(3.69E-05)和秦宁等[17]在2013年对巢湖地区养殖水产品致癌风险评价结果(3.73E-05~9.59E-05)。与EPA规定的可接受风险值(1.0E-06)相当，在可控范围，说明该虾塘罗氏沼虾是安全的，在正常情况下食用该地区养殖的罗氏沼虾不会对人体健康造成威胁。
3 结论金山区漕泾建国路罗氏沼虾多环芳烃浓度为47.6~106 ng/g，与其他地区相比处于中等偏低水平，所有虾塘PAHs优势组分均为3，4环结构，优势单体为ANT、BaA和CHR，比值法溯源结果表明，养殖池塘中PAHs污染的主要来源是燃烧源。终生致癌风险结果表明金山区罗氏沼虾养殖虾塘PAHs致癌风险RILC值处于可接受水平，正常情况下食用不会对消费者的人体健康产生明显影响。由于本研究只选取了罗氏沼虾，在水产品的选择上具有局限性，在以后的研究中可以选择其他不同品种的鱼蟹贝类等了解其累积规律以及对人类的健康风险，另外可以采集水样和沉积物样品，对水、沉积物和生物进行系统研究。
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