上海海洋大学学报  2020, Vol. 29 Issue (4): 585-592    PDF    
东海区黄鳍东方鲀寄生异尖线虫的鉴定及河鲀毒素检测
毛婕1,2, 龚小玲1,2, 鲍宝龙1,2     
1. 上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306;
2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
摘要:通过检查东海区283尾野生黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)样本,发现具有河鲀毒素的黄鳍东方鲀也受到线虫的感染。11月份黄鳍东方鲀体内异尖线虫感染情况最严重。通过形态学特征和线粒体DNA鉴定,黄鳍东方鲀组织内寄生的线虫为派氏异尖线虫(Anisakis pegreffii)。免疫组学分析发现异尖线虫体内含有河鲀毒素,进一步的高效液相色谱-质谱检测结果显示异尖线虫体内河鲀毒素含量为425 ng/g,这是首次发现寄生在东方鲀体内的线虫具有河鲀毒素。
关键词东海    黄鳍东方鲀    派氏异尖线虫    寄生    河鲀毒素    

派氏异尖线虫(Anisakis pegreffii)感染鱼类的情况较为严重,各海域多种鱼类体内均有发现。在意大利市场上鲱鱼(Clupea pallasi)、印度阿拉伯海区灯笼鱼(Myctophids)和日本海域捕获的鲐鱼(Scomber japonicus)体内均出现异尖线虫高度感染现象[1-3]。我国东海、黄海和渤海鱼类寄生的异尖线虫分子鉴定主要是派氏异尖线虫,占总数的98%以上,为该海域的优势种[4];南海鱼类寄生的异尖线虫与其他海域明显不同,其优势种为典型异尖线虫(A.typica)。多种海洋经济鱼类也发现受到不同程度的异尖线虫感染,如带鱼(Trichiurus lepturus)体内线虫感染率为71%、小黄鱼(Larimichthys polyactis)线虫感染率为94%、蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)线虫感染率为100%[5-6]。国内外报道异尖线虫寄生的鱼类宿主已有249种[7]

东方鲀是近海常见的鱼类,其体内积累可致命的河鲀毒素(Tetrodotoxin,TTX),食用河鲀导致河鲀毒素中毒死亡事件时有发生[8-9]。海区有毒的东方鲀是否也会受异尖线虫的感染呢?在鲀毒动物红色斑点蝾螈(Notophthalmus viridescens)肠道内也发现线虫、吸虫和绦虫等寄生,免疫组织化学染色发现,线虫、吸虫和绦虫等寄生虫含河鲀毒素[10],但其未鉴定寄生虫具体种属。在日本海域的星点东方鲀(Takifugu niphobles)鳃部寄生桡足类山口绦刺鱼蚤(Taeniacanthus sp)和河鲀拟鱼虱(Pseudocaligus fugu),寄生虫中TTX量分别为59 μg/g和74 μg/g[11]。为了了解野生东方鲀是否能寄生线虫情况,以及寄生的线虫是否累积河鲀毒素,调查了东海区常见东方鲀鱼类黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)的线虫寄生情况以及线虫累积河鲀毒素的情况。

1 材料与方法 1.1 样品采集

野生黄鳍东方鲀采自泥城水产品市场,系当地渔民捕自东海海区。清洗黄鳍东方鲀体表黏液后,放在消毒后白色瓷托盘内,用剪刀剪开腹腔,查找和观察各组织线虫寄生情况,然后用镊子夹出线虫,用生理盐水冲洗去除黏附于虫体的组织碎片及黏稠物,放入2 mL离心管中,并用75%乙醇脱水保存,固定备用。

1.2 黄鳍东方鲀体内寄生线虫物种鉴定 1.2.1 扫描电镜(SEM)观察

将线虫标本用0.1 mol/L PBS清洗3次,每次20 min,2.5%磷酸戊二醛溶液固定3 h,0.1 mol/L PBS清洗3次,每次20 min,清洗过后采用逐级酒精脱水,30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇和无水乙醇,各级酒精梯度脱水时间为20 min,将处理后的线虫样品置于超净工作台干燥过夜,接着利用导电胶将线虫样品固定在扫描电镜样品台,喷金之后扫描电镜观察,加速电压6 kV[12]

1.2.2 分子鉴定线虫物种

选取野生黄鳍东方鲀体内的异尖线虫,将单条线虫放入2 mL离心管中,管中加入500 mL组织裂解液,加20 μL的20 mg/mL蛋白酶K, 简短混匀后置于56 ℃水浴锅过夜,组织裂解完全后,使用海洋动物组织DNA提取试剂盒(天根)提取线虫DNA。线虫线粒体基因引物序列,上游线虫COⅠ引物为TTCTCCACCAACCACAARGAYATY GG,下游线虫COⅠ引物为CACCTCAGGGTGTCCGAARAAY CARAA,引物设计参照文献[13]。PCR总体积为50 μL,2×Taq PCR Mix 25 μL,模板DNA 2.5 μL,上下游引物各2.5 μL,无菌水17.5 μL。反应程序为95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,32个循环;72 ℃ 10 min;保持4 ℃。配制1%琼脂糖凝胶,电泳检测,切割纯化700 bp条带送生工生物有限公司测序,序列在NCBI上使用Blast比对,相似性高于95%以上物种。从GenBank下载8种线虫的COⅠ序列,与本实验获得的线虫序列进行种系发育分析。

1.3 黄鳍东方鲀体内寄生线虫TTX检测 1.3.1 免疫组织检测

经过4%PFA过夜固定的线虫,通过70%乙醇,80%乙醇、90%乙醇和2次无水乙醇各1 h的梯度脱水后,用lemonsol透明组织15 min,浸泡替换3次,肉眼观察组织透明情况。将透明处理后的组织放入组织包埋框,置于65 ℃的液体石蜡中浸蜡2 h,再换包埋框浸蜡2 h,组织包埋好后,切片6 μm,37 ℃烘干过夜,脱蜡切片与抗TTX多克隆抗体(Anti-Tetrodotoxin polyclonal antibody DPAB-DC4815, CD Creative Diagnostics)一起孵育[14],然后与荧光标记的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG polyclonal antibody. Alexa Fluor 488)标记绿色荧光,使用共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope)观察拍照。

1.3.2 高效液相-质谱联用检测

分别取2 g线虫或5 g黄鳍东方鲀组织,加入10 mL的0.1%乙酸溶液提取TTX,用水浴锅煮沸10 min后,冷却至室温后,配平离心管,在12 000 r/min离心10 min后取上清液,使用旋蒸仪将上清液浓缩定容至10 mL[15]。加1 mL旋蒸液到超滤管中,4 000 r/min离心30 min,取出过滤液用注射器过0.22 μm滤膜后,移150 μL过滤液至液相小瓶内的中心小管,收集的提取液用于LC-MS/MS检测[16]

2 结果 2.1 黄鳍东方鲀组织内线虫感染情况

对2018年1月至2018年12月每月中旬采集的野生黄鳍东方鲀体内异尖线虫感染情况做周年调查,每月都有发现异尖线虫感染情况,其中55尾检出有异尖线虫,检出率为19%,11月是异尖线虫感染的高发期,感染率可达到33%,感染最严重黄鳍东方鲀体内寄生了105条异尖线虫,见表 1

表 1 2018年东海区黄鳍东方鲀体内线虫感染情况统计表 Tab.1 Statistics on the infection of Anisakis in T. xanthopterus of the East China Sea in 2018

异尖线虫寄生于黄鳍东方鲀肝脏33尾、肠道12尾、卵巢6尾、精巢4尾。黄鳍东方鲀感染最高的组织是肝脏,在55尾被异尖线虫感染的黄鳍东方鲀中,肝脏感染了33尾,构成比为60%,见表 2。黄鳍东方鲀肝脏、肠道、精巢内寄生较多异尖线虫,卵巢较少,心脏、肾脏、鱼鳃和胃部等异尖线虫感染率则为零。各组织平均异尖线虫感染强度为肠道感染3条、肝脏感染3条、卵巢感染1条、精巢感染28条。

表 2 异尖线虫感染部位及感染强度 Tab.2 Infected parts and infection intensity of Anisakis spp

黄鳍东方鲀感染异尖线虫的症状,表现为明显的弥漫性肠系膜增厚,主要为黏膜下水肿,厚度达1.8 mm,并伴有肠壁腹水(图版Ⅰ-2),异尖线虫聚集贯穿于精巢组织内部和存活于卵巢组织膜外(图版Ⅰ-4),对比肝脏检查结果,可见肝脏组织黏膜下水肿突出的褶皱,轻微的腹围脂肪胶合(图版Ⅰ-6)。

1.异尖线虫寄生黄鳍东方鲀肠系膜;2.局部放大;3.异尖线虫寄生黄鳍东方鲀卵巢外侧;4.局部放大;5.异尖线虫寄生黄鳍东方鲀肝脏;6.局部放大 1.Anisakis in T. xanthopterus mesentery; 2. Partial magnification; 3.Anisakis in T. xanthopterus ovary; 4. Partial magnification; 5.Anisakis in T. xanthopterus liver; 6. Partial magnification 图版 Ⅰ 黄鳍东方鲀不同组织原位感染异尖线虫情况 Plate Ⅰ In situ infection of Anisakis spp in different tissues of T. xanthopterus
2.2 黄鳍东方鲀体内寄生线虫物种鉴定 2.2.1 线虫外部形态结构

线虫形态特征为静态卷曲(图版Ⅱ-1),虫体粗壮,体色透明,活体时做波浪线运动,行为较为活跃。形态学观察显示线虫生殖腺没有发育,尾部比较短,只有顶端的尾突(图版Ⅱ-3, 6)。异尖线虫物种鉴定取决于是否存在具有黏膜的圆形尾部(图版Ⅱ)。角质层横向横纹(图版Ⅱ-5),尾巴不规则地起皱。食道位于前部肌肉和后部腺体,在活幼虫中明显可见(图版Ⅱ-2)。虫体体壁厚且长,有角质层牙(图版Ⅱ-2)。无胃盲囊和肠盲囊,胃较大且呈圆锥形(图版Ⅱ-4)。由此可以判断本次所采集线虫标本是异尖属线虫。

1.线虫整体;2.头端;3.尾部;4.胃部;5.头部;6.尾部;dc.角质层牙;ep.排泄孔;nr.神经环;e.食管;v.胃;i.肠;g.腺体;ap.肛门;ct.圆锥尾;m.尾突 1.Anisakis overall; 2.Cephalic extremity; 3.Posterior end; 4.Stomach; 5.Cephalic extremity; 6. Posterior end; dc. Cuticular tooth; ep. Excretory pore; nr. Nerve ring; e. Esophagus; v. Ventriculus; i.Intestine; g. Glands; ap. Anal pore; ct. Conical tail; m. Mucron 图版 Ⅱ 黄鳍东方鲀体内寄生线虫形态 Plate Ⅱ Morphological observation of Anisakis spp in T. xanthopterus
2.2.2 黄鳍东方鲀体内寄生线虫的分子鉴定

野生黄鳍东方鲀寄生线虫从外形上看为同一种线虫,随机提取10条线虫的DNA进行扩增COⅠ测序分析。将扩增产物经BLAST在线比对,10条与派氏异尖线虫COⅠ基因(登录号为LC222461.1)同源性为95%~98%。GenBank数据库已公布的8种线虫COⅠ线粒体基因序列包括:典型异尖线虫、简单异尖线虫(A.simplex)、派氏异尖线虫、抹香鲸异尖线虫(A.physeteris)、盲囊线虫(Contracaecum muraenesoxi)、内弯宫脂线虫(Hysterothylacium aduncum)、带鱼针晶蛔线虫(Raphidascaris trichiurid)和小抹香鲸异尖线虫(A.paggiae)。利用COⅠ序列数据和参考物种的序列通过MEGA6软件采用NJ法构建系统进化树,黄鳍东方鲀组织内寄生线虫S1~S10基因序列结果见图 1,同派氏异尖线虫COⅠ基因的亲缘关系较近。

图 1 黄鳍东方鲀体内寄生线虫COⅠ基因的聚类分析 Fig. 1 Cluster analysis of COⅠgene sequences of Anisakis spp in T. xanthopterus
2.3 线虫体内TTX检测 2.3.1 线虫TTX免疫原位表达

使用TTX特异性单克隆抗体,将标记特异性绿色荧光信号用于免疫组化检测,发现TTX在整个线虫几乎都有分布,最主要分布在异尖线虫体壁,体腔中的TTX主要在胚层之间(图版Ⅲ)。

1.阴性对照;2.横切面;3.纵切面;绿色为TTX信号.红色箭头示信号较强区域 1.Nagative contral; 2.transection view; 3.longitudinal section view; Positive signal is green. Red arrous show the regions with relative high TTX 图版 Ⅲ 异尖线虫TTX的免疫组化荧光检测 Plate Ⅲ Immunostaining detection of TTX in Anisakis spp
2.3.2 线虫体内TTX高效液相-质谱联用

根据LC-MS/MS检测结果,在正电喷雾模式下,样品在MRM模式下检测碎片离子为320.1/162.0。线虫样品有与标准品TTX相同的出峰时间为1.99 min。根据不同浓度1 ng/mL TTX、10 ng/mL TTX、25 ng/mL TTX、50 ng/mL TTX、100 ng/mL TTX得出河鲀毒素标准品曲线,TTX的标准曲线为Y=782X-8.26(图 2ab),R2值为0.996 7,在100 ng/mL的浓度范围内对TTX的对数浓度显示出良好的线性。异尖线虫河鲀毒素含量为425 ng/g (图 2c)。根据标准品的出峰时间,在302离子峰和161离子碎片的峰图确定河鲀毒素。野生黄鳍东方鲀肝脏中的TTX浓度测定为1 707 ng/g(图 2d)、肠道中的TTX浓度为29 ng/g、精巢中的TTX浓度为22 ng/g、卵巢中的TTX浓度为5 270 ng/g。异尖线虫寄生在野生黄鳍东方鲀组织内的TTX含量高于黄鳍东方鲀肠道和精巢中TTX含量。

图 2 LC-MS/MS检测异尖线虫和黄鳍东方鲀肝脏中TTX图谱 Fig. 2 LC-MS/MS chromatograms of samples from Anisakis spp and from liver of T. xanthopterus
3 讨论 3.1 黄鳍东方鲀寄生异尖线虫感染情况分析

经统计发现,在东海区黄鳍东方鲀体内共计采集到253条派氏异尖线虫。在所调查的283尾黄鳍东方鲀中,各季黄鳍东方鲀异尖线虫感染率的差异较大,冬季黄鳍东方鲀的感染率较高,感染强度最高的是在11月份,雄性黄鳍东方鲀体内共检出105条派氏异尖线虫。异尖线虫广泛寄生在海洋经济鱼类如凤尾鱼(Engraulis encrasicholus)、澳洲鲭(Sarda sarda)、沙丁鱼(Sardina pilchardus)和大西洋竹荚鱼(Trachurus trachurus) [17]。海洋鱼类感染异尖线虫报道中异尖线虫病与吃生鱼片密切相关。严重时可引发消化道出血、溃烂、肠壁增厚、肠阻塞甚至肠坏死[18]。本研究发现派氏异尖线虫在肠系膜、卵巢、精巢和肝脏寄生,而在肌肉组织中没有发现寄生的派氏异尖线虫,食用黄鳍东方鲀鱼肉也相对不容易引起异尖线虫的感染。

3.2 黄鳍东方鲀组织内分离的线虫物种鉴定

异尖线虫物种鉴定取决于是否存在具有黏膜的圆形尾部[19]。本文异尖线虫形态有角质层牙和横向横纹,尾巴不规则地起皱,食道的漏斗形特征也符合文献中异尖线虫形态学分类描述[20]。利用形态和分子相结合的方法,已在几种鱼类中开展了寄生异尖线虫的鉴定,鉴定出厦门宫脂线虫(Hysterothylacium amoyense)、带鱼针蛔线虫(Raphidsascaris trichiuri)[21]。本研究对从黄鳍东方鲀体内分离的线虫DNA测序结果经比对和聚类分析后,发现其与派氏异尖线虫最为接近,结合形态特征,可以确定所分离的线虫为派氏异尖线虫。已有报道派氏异尖线虫分布在日本海到东海的鱼类中,东海区黄鳍东方鲀感染的优势种即为派氏异尖线虫[3]

3.3 黄鳍东方鲀寄生线虫含河鲀毒素

本研究所采集的东海区野生黄鳍东方鲀,其体内寄生的派氏异尖线虫通过质谱和免疫组化检测,发现含有河鲀毒素。高效液相-质谱方法是目前检测河鲀毒素最可靠方法[22],荧光免疫组化显示,TTX在派氏异尖线虫各部位均有分布,在线虫肌肉细胞分布最多,这是首次发现派氏异尖线虫体内具有TTX。派氏异尖线虫体内的TTX含量达到425 ng/g,虽然低于黄鳍东方鲀肝脏和卵巢中TTX含量,却超过肠道和精巢中的TTX含量,表明派氏异尖线虫具有累积TTX的能力,而且派氏异尖线虫能寄生在黄鳍东方鲀TTX含量很高的肝脏和卵巢组织中,表明派氏异尖线虫具有很强的耐受TTX的能力。目前只有报道线虫、吸虫、绦虫、山口绦刺鱼蚤和河鲀拟鱼虱等少数几种寄生生物含有TTX[10-11]。派氏异尖线虫耐受TTX的机制,需要今后进一步研究。

综上所述,本研究首次发现东海区野生黄鳍东方鲀组织内寄生的派氏异尖线虫含TTX,表明派氏异尖线虫具有耐受TTX的能力。

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Identification of TTX Anisakis pegreffii parasites in Takifugu xanthopterus from the East China Sea
MAO Jie1,2, GONG Xiaoling1,2, BAO Baolong1,2     
1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract: We examined 283 wild Takifugu xanthopterus samples from the East China Sea to investigate the infection of Anisakis. It was found that the infection of Anisakis in T. xanthopterus was the highest in November. In situ photographing of the infected tissue of T. xanthopterus showed that the highest infection rate was as high as 60% in the liver and average infection intensity in the liver is 3 anisakises per fish. Identification by mitochondrial DNA molecules and morphologic features, the parasite of T. xanthopterus is Anisakis pegreffii. LC-MS/MS showed that the content of TTX in Anisakis was 425 ng/g. This is the first time that an anomalous nematode parasitic in T. xanthopterus has been found to have a tetrodotoxin.
Key words: East China Sea     Takifugu xanthopterus     Anisakis pegreffii     parasitic     TTX