2020,
Vol. 29
2. 上海海洋大学 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
鳜(Siniperca chuatsi)和大眼鳜(S. kneri)隶属鲈形目(Perciformes)鳜科(Sinipercidae)鳜属(Siniperca)，是东亚地区特有的淡水经济鱼类，具有重要的经济价值、生态价值。鳜是BASILEWSKY(1855)在天津鉴定的物种，主要分布在黑龙江至珠江以北的水系；大眼鳜是GARMAN(1912)在湖北宜昌描述的物种，分布于淮河以南水系[1]。这两个物种的形态鉴定标准主要是头后及背前部隆起程度、眼睛大小、上颌骨后缘是否伸达眼后缘(鳜：头后及背前部隆起较高，眼较小，上颌骨后缘伸达眼后缘之下或更后；大眼鳜：头后及背前部隆起较低，眼较大，上颌骨后端不伸达眼后缘之下)[1]。
随着鳜鱼野外采样工作的扩大和深入，在长江中游发现有些样本兼具鳜和大眼鳜的部分形态特征(口裂后缘伸达眼后缘之下，而眼睛大小、头后及背前部隆起介于鳜与大眼鳜之间)，我们暂将其称为“中间类型”。余帆洋[2]首次将这种类型的鳜鱼称为“过渡类型”(鳜与大眼鳜复合种)，通过线粒体控制区序列比较，但未能观察到“过渡类型”与鳜、大眼鳜间有明显遗传分化。杨敏[3]利用4对微卫星标记对陆水水库、沅江、湘江、赣江、鄱阳湖采集的鳜、大眼鳜群体进行分子鉴定，发现形态上被认为是大眼鳜的群体中有少量杂交F1个体。SONG等[4]利用靶基因富集与多基因测序技术，发现长江水系鳜、大眼鳜样品中存在基因交流的现象。
鳜和大眼鳜为姐妹种，亲缘关系非常近[5-6]。卢薛等[7]对鳜和大眼鳜进行人工授精试验，发现正反交后代、正交F1后代自交的胚胎均能正常发育，受精率和孵化率均达到85%以上，表明鳜和大眼鳜之间能进行种间杂交，杂种繁殖力正常，它们之间没有严格的生殖隔离障碍。在自然环境中，鳜与大眼鳜自然分布范围不同，但也存在同域分布，这些中间类型个体究竟是某个物种的变异类型，还是野生鳜和大眼鳜的杂交后代，需要对此问题作进一步探讨。
为此，在鄱阳湖和洞庭湖采集鳜鱼，根据形态特征鉴定为鳜、大眼鳜及中间类型，测量其相关的形态学数据，同时，筛选鳜和大眼鳜种间特异微卫星位点，对中间类型个体的种属分类进行鉴定，为鳜鱼分类、种质资源监测与管理提供依据。为了减少实验的偶然性误差，尽可能覆盖物种分布最大地理区域，还采集了黑龙江鳜(没有大眼鳜天然分布)和珠江上游大眼鳜(没有鳜天然分布)加以检验。
1 材料与方法 1.1 实验材料2018年3—9月，分别从长江中游湖泊、黑龙江、珠江采集鳜鱼样品共111尾(表 1)。鄱阳湖(28°52'56.87″N，116°25'53.54″E)采集样品72尾；洞庭湖(29°23'49.69″N，113°05'46.07″E)采集样品25尾。珠江(惠州市三防镇，25°15'0.21″N，108°50'28.03″E)采集大眼鳜6尾，黑龙江(抚远市，48°21'44.60″N，134°18'0.15″E)采集鳜8尾。根据传统形态学分类鉴别特征，将收集到的每条鱼进行物种鉴定，归类为3种：鳜(上颌骨后端伸达眼后缘之下及更后、眼睛小，背前部隆起较高)、大眼鳜(上颌骨后端不伸达眼后缘之下、眼睛大，背前部隆起较低)和中间类型(上颌骨后端伸达眼后缘之下，眼睛大小、头后背前部隆起介于鳜与大眼鳜之间), 见图 1。
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表 1 鳜、大眼鳜及中间类型样本采集信息 Tab.1 Information of collected samples of Siniperca chuatis, S. kneri and intermediate form |
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图 1 鳜、大眼鳜及中间类型的形态图 Fig. 1 Morphology of S.chuatsi, S.kneri and intermediate form |
样本经形态鉴定后，使用测量工具(数显游标卡尺和天平)活体测量其头长、头高、眼径、吻长+眼径、口裂长，逐尾做好标签，用95%乙醇固定后，带回上海海洋大学鳜鱼种质资源实验室。
分别用(吻长+眼径)/口裂长、头长/眼径、头长/头高3个形态分类指标来定量描述：(1)上颌骨后端是否伸达眼后缘之下及更后; (2)眼睛大小; (3)头部隆起高低。应用SPSS 22.0软件[8]对数据进行单因素方差分析(ANOVA)。
取30~40 mg肌肉组织，采用天根生化科技(北京)有限公司海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，溶解于120 μL ddH2O中。1%琼脂糖凝胶电泳、分光光度计检测DNA质量(1.8＜OD260/OD280＜2.0)和浓度，-20 ℃保存备用。
微卫星引物28对，包括鳜微卫星引物7对[9-10]和本实验室开发的大眼鳜引物21对，由生工生物工程(上海)有限公司合成。对鳜、大眼鳜样品进行PCR扩增，扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳10 h，银染，数码相机拍照。
采用筛选出的5对微卫星引物对中间类型样品PCR扩(表 2)增。PCR扩增体系(10 μL)：Premix Taq (TaKaRa，大连)5 μL、上下游引物(5 μmol/L)各0.5 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 3 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，之后进入32个循环：94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后一个循环结束后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经全自动毛细管核酸分析系统(QIAxcel)进行基因分型和片段分析，并对其峰值结果进行比对矫正。
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表 2 5个鳜和大眼鳜种间鉴定微卫星位点 Tab.2 Five species-specific microsatellite loci between S. chuatsi and S. kneri |
使用STRUCTURE 2.3软件[11]进行所有样品的微卫星基因型聚类分析。为了确定中间类型是否是一个有效的群体，在混合模型下预先定义了K值(1 ≤K ≤ 3)，每一个K值进行10次模拟计算，每次模拟进行5 000次预迭代(length of burn-in period)和50 000基于马科夫链的蒙特卡罗迭代(Marco’s chain monte carlo iterations)。分别依据后验概率Delta(k)和连续两个lnP(D)的变化率ΔK[12]进行估算以确定最佳聚类数目。由于位点数目较少，设置q值为0.05作为纯种和杂种判别标准[13]。为进一步揭示鳜和大眼鳜杂交的类别与混杂程度，使用NEWHYBRIDS 1.1软件[14]，设置纯种(鳜、大眼鳜)、杂交F1、杂交F2、回交1代(F1与鳜回交、F1与大眼鳜回交)共6种分型类别，buin-in次数为100 000，运行100 000 MCMC重复计算，P设置为0.6[15]。
2 结果分析 2.1 形态学量化结果表明：鳜(吻长+眼径)/口裂长、头长/眼径范围分别为0.811 ~ 0.999和5.286~7.157，大眼鳜分别为1.040~1.166和3.306~5.106(表 3)；鳜和大眼鳜在(吻长+眼径)/口裂长、头长/眼径上存在显著差异；鳜头长/头高(1.236~1.777)和大眼鳜(1.193~1.798)间互有交叉分布。所以，确定以(吻长+眼径)/口裂长、头长/眼径作为形态量化鉴定指标。
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表 3 鳜、大眼鳜形态比例参数比较 Tab.3 Comparison of morphological ratio parameters between S.chuatsi and S.kneri |
48尾中间类型中，有5尾鱼(吻长+眼径)/口裂长在0.891~0.981之间、头长/眼径在5.318~5.820之间，符合鳜的形态量化标准，被鉴定为鳜。其他43尾个体中，有31尾(吻长+眼径)/口裂符合鳜，但头长/眼径符合大眼鳜；6尾(吻长+眼径)/口裂符合鳜，头长/眼径位于在鳜和大眼鳜之间；6尾头长/眼径符合大眼鳜，(吻长+眼径)/口裂位于鳜和大眼鳜之间，由于两项指标不能同时满足任一物种的形态量化标准，尚不能鉴定。
2.2 微卫星分析从28对引物中筛选了5对鳜和大眼鳜种间鉴别引物，分别是T063、T089、T103、T135、W19517(图 2)。其中：鳜和大眼鳜在T063、T103位点均表现为纯合型，但等位基因大小(扩增产物长度)不同；在T089、T135位点，大眼鳜表现杂合型，鳜表现为纯合型；在W9517位点，鳜和大眼鳜均表现为杂合型，等位基因大小各不相同。在这些鉴别位点上，中间类型个体或表现为鳜、大眼鳜基因型，或表现为杂合基因型。
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图 2 鳜、大眼鳜及中间类型在5个微卫星位点扩增结果 Fig. 2 Electrophoresis result of S.chuatsi, S. kneri and intermediate form at five microsatellite loci |
运用STRUCTURE 2.3.2对所有鳜鱼样品进行遗传聚类分析表明，K=2时出现最高峰值，为最佳聚类，即鳜为一类，大眼鳜为一类，中间类型大部分个体聚入大眼鳜，小部分个体聚入鳜(图 3)。鄱阳湖、洞庭湖、黑龙江、珠江的鳜和大眼鳜样品q>0.95，表明在传统形态鉴定的31尾鳜个体和32尾大眼鳜个体上没有基因的导入。在48尾中间类型中，有16尾个体的q为0.05~0.95(表 4)，表明鳜和大眼鳜存在种间杂交。应用NEWHYBRIDS分析鳜和大眼鳜种间杂交类型情况(表 4)，在中间类型中检测到了9尾杂交个体，且均为F1与大眼鳜的回交个体类型，其余杂交类型未检测到。
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1(1)~7(1)洞庭湖鳜；8(1)~15(1)黑龙江鳜；16(1)~31(1)鄱阳湖鳜；32(2)~39(2)洞庭湖大眼鳜；40(2)~45(2)珠江大眼鳜；46(2)~63(2)鄱阳湖大眼鳜；64(3)~101(3)鄱阳湖中间类型；102(3)~111(3)洞庭湖中间类型。红色代表鳜，绿色代表大眼鳜 1(1)-7(1) are S. chuatsi in Dongting Lake; 8(1)-15(1) are S. chuatsi in the Heilongjiang River; 16(1)-31(1) are S. chuatsi in the Poyang Lake; 32(2)-39(2) are S. kneri in the Dongting Lake; 40(2)-45(2) are S.kneri in the Zhujiang River; 46(2)-63(2) are S.kneri in the Poyang Lake; 64(3)-101(3) are intermediate form in the Poyang Lake; 102(3)-111(3) are intermediate form in the Dongting Lake. Red represented S. chuatsi population; Green represented S. kneri population 图 3 鳜、大眼鳜及中间类型的STRUCTURE聚类分析图 Fig. 3 STRUCTURE genetic cluster profile for S. chuatsi, S. kneri and intermediate form |
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表 4 基于STRUCTURE和NEWHYBRIDS对中间类型进行分类鉴定 Tab.4 Identification of intermediate form in STRUCTURE and NEWHYBRIDS |
形态特征是物种遗传特性最直观的表现形式，也是传统分类学上重要的依据[16]。通过量化这些形态分类特征，鳜(吻长+眼径)/口裂为0.811~0.999，大眼鳜1.040~1.166，从数值上准确反映了鳜与大眼鳜在口裂后缘与眼睛后缘相对位置上的差异；鳜头长/眼径为5.286~7.157，大眼鳜为3.306~5.106，这与成庆泰等[17]提出的鳜眼睛较小(头长为眼径的5.3~8.1倍)，大眼鳜眼睛较大(头长为眼径的4.7~5.1倍)基本符合。鳜和大眼鳜在(吻长+眼径)/口裂长、头长/眼径存在差异性显著，这些形态定量指标可作为鳜与大眼鳜物种鉴定的依据。鳜和大眼鳜的头高/头长比分别为1.236~1.777、1.193~1.798，数值上明显交叉。这可能是本研究中样品均为1龄鱼，在自然水体中，饵料生物资源不均、个体捕食能力差异，导致个体生长慢、个体间生长变异大，在一定程度上影响该参数的稳定可靠性。根据(吻长+眼径)/口裂长、头长/眼径2项定量指标，鉴定出5尾个体为鳜，4尾样品和微卫星标记结果一致，仅有1尾样品在STRUCTURE分析中出现杂交信号，但在NEWHYBRIDS分析中归类为鳜。其他43尾因不能同时满足上述2项定量指标，身份无法鉴别，表明形态学定量鉴定指标对中间类型的鉴别仍有较大的局限性。
从28对微卫星引物中筛选了5对鳜和大眼鳜种间鉴别的微卫星标记，这一结果支持了鳜与大眼鳜物种的有效性。相比线粒体标记[18]，微卫星标记鉴定更加有效。在STRUCTURE聚类分析中，洞庭湖鳜(7尾)、鄱阳湖鳜(16尾)、黑龙江(鳜8尾)聚为一个群体，洞庭湖大眼鳜(8尾)、鄱阳湖大眼鳜(18尾)、珠江大眼鳜(6尾)聚为另一个群体，表明这5对种间特异性鉴定位点不受地理地域差异的影响，同时也支持了本研究样本形态学分类鉴定结果。
根据5对微卫星标记对48尾中间类型进行鉴定，在STRUCTURE聚类分析中有16尾出现杂交信号(0.95＜q＜1)，证实了长江中游鳜与大眼鳜之间存在种间杂交，在NEWHYBRIDS分析中，检测到9尾个体为杂交F1与大眼鳜回交后代类型，表明鳜与大眼鳜间不仅存在种间杂交，而且存在杂交渐渗现象。两个分析方法对9尾杂交个体的判定是一致的，另外7尾(1、10、13、22、35、38、48)在STRUCTURE聚类分析被归类为杂交个体，但在NEWHYBRIDS分析中，因其杂交确定性值较低，而被判定为亲本个体，推测它们可能是多代回交杂种的缘故。杂种F1、F2和回交F1×(SC)的类型并未检测到，可能是由于采样样品数量有限，或与鉴定位点数目偏少有关，今后还需再扩大样本和标记数量进行深入探讨。此外，在STRUCTURE聚类分析中，中间类型有26尾鉴定为大眼鳜、6尾为鳜，在NEWHYBRIDS分析中，28尾鉴定为大眼鳜，10尾为鳜，表明鳜、大眼鳜自然群体内存在明显的个体变异，变异类型是个体因其生存环境做出的适应性改变[19]。
当亲缘关系相近的两个亲缘物种在地理分布上重叠时，易发生渐渗杂交。由于鳜和大眼鳜在自然分布区域上存在重叠，给鳜和大眼鳜种间杂交提供了可能性，而人类活动引起的生态环境的改变可能加快了杂交渐渗发生频率[20]。近年来，由于气候变化、长江大型水利工程(葛洲坝、三峡大坝)建设、围湖造田、渔业过度捕捞等，长江中游水域水文特征发生了显著变化，枯水期提前、枯水期延长已经成为长江中游湖泊的常态，水位年年降低，严重时湖区仅剩下航道[21-22]，这些环境剧变会引起物种栖息场所和繁殖场所变动，这可能是造成种间生殖隔离破坏的主要原因。此外，长江中游湖泊附近有大量鳜鱼繁殖场、养殖场，也不排除人工杂交鳜鱼逃逸到自然水体并与野生鳜鱼间杂交造成渐渗的可能性。本研究结果证实了长江中游湖泊鳜和大眼鳜之间存在种间渐渗杂交，因此，我们需要加大对长江鳜于种质资源的遗传保护举措，并监测鳜鱼种间渐渗杂交的发展趋势。
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