2020,
Vol. 29
2. 上海海洋大学 水产科学国家实验教学示范中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
4. 江苏省渔业技术推广中心, 江苏 南京 210036
稻田综合种养是我国重要的生态养殖模式之一[1]，可以有效地减少农药化肥的使用量，并且获得较高的经济效益。随着稻田养殖技术的发展，稻田综合种养的水产品种类也越来越多。目前稻-克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的养殖模式已经成为了一种主要的稻田养殖模式。2017年全国小龙虾养殖产量达到了112万t，养殖面积达80万hm2，其中稻田养殖面积约为56.7万hm2，占总养殖面积的70.83%[2-3]。
微生物群落组成和结构直接影响着水产品的产量、水质土壤环境和动物疾病防控等方面[4]。不同肥料的施用会影响微生物的功能和数量[5-6]。我国现代农业施用的肥料主要是化肥，有机肥使用量仅有不到20%[7]。化肥的过度施用会导致土壤酸化和水体富营养化等问题[8]。有机肥和鸡粪的施用则有利于提升土壤肥力和有机质[9-10]。在施肥模式对水产养殖的影响方面国内外学者已经进行了大量的研究[11]，但是目前对稻田综合种养的影响研究较少。因此本研究通过对不同施肥模式下水体微生物的研究探索适合稻田综合种养的施肥模式。
1 材料与方法 1.1 实验设计及地点养殖场位于江苏省兴化市中堡镇东荡庄村香湖农庄(119.871244°E, 33.128311°N)，位于江苏省中部、长江三角洲北翼，年平均气温16.2 ℃，年总降水量938.0 mm，年日照时数1 890.3 h。克氏原螯虾的放养密度是8 000尾/667 m2。放养规格为200尾/kg。实验采用随机大田块进行处理，设置施用化肥(CF)、有机肥(OF)和有机肥加鸡粪(OM)3个不同处理组。实验肥料分别为兴化市美乐复合肥，兴化市兴友牌发酵有机肥。肥料施用时间为2018年4月下旬。3个实验塘分别为6 003 m2、11 339 m2 和 26 680 m2，根据田块的大小分别采集了3、6、9个样品。3个实验塘分别施用复合肥40 kg/667 m2、有机肥25 kg/667 m2、有机肥10 kg加腐熟鸡粪10 kg/667 m2。3个实验田块均挖有环沟，环沟深度在1.0~1.4 m，沟内培植水花生、伊乐藻等水草。
1.2 水体样品采集及处理水体样品于2018年6月1日采集，采取水样深度为30~40 cm。水样采集后现场过200目灭菌筛绢后用0.22 μm滤膜(millipore)进行微生物的提取。提取后的滤膜置入灭菌离心管中放入干冰盒中带回实验室放入-80 ℃冰箱中等待DNA提取。
1.3 水体样品理化性质检测水体温度、溶氧和pH现场采用多功能水质检测仪(HACH40d)进行检测，总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定，总磷采用钼酸铵分光光度法测定，氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定，亚硝态氮含量采用盐酸萘乙二胺比色法测定，硝态氮含量采用N-(1-萘基)-紫外分光光度法测定。
1.4 水体微生物总DNA提取将滤膜剪碎后，使用快速提取试剂盒(E.Z.N.A.SoilDNAKit试剂盒)提取DNA，得到DNA样品。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。
1.5 PCR扩增及高通量测序运用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因高变区V3-V4进行扩增。PCR扩增体系为25 μL，包括灭菌超纯水8.75 μL包括12.25 μL的2×Taq PCR Star Mix with Loading Dye, 正向引物(10 μmol/L)1 μL和反向引物(10 μmol/L)1 μL总DNA 2 μL。PCR循环顺序为98 ℃ 2 min预热, 25个循环98 ℃15 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 最后在72 ℃下延长5 min。每份总DNA扩增3次，然后将3份PCR产物等浓度混合。PCR产物送往上海派森诺生物科技有限公司进行高通量测序，采用Illumina MiSeq平台，进行双末端测序。最后将得到的测序数据返回，进行数据处理和生物多样性分析。
1.6 数据分析首先，将返回的双末端Fataq序列用fastqc软件对序列文件进行质量检测和质量过滤。然后利用Flash软件对质量过滤的序列进行拼接，用mothur[12]软件去除嵌合体序列。实验用Qiime软件中的uclust[13]对所得到的优质序列按照0.97的相似度进行OTU(operational Taxonomic Units)聚类，选取每个OTU中最长序列为代表序列；用Qiime软件中获得的代表序列与Silva[14]数据库比对，获得OTU分类学信息。根据物种丰度，用mothur软件中求出每个样品的Chao、ACE、Shannon和Simpson指数。其中Chao和ACE指数是群落丰度(community abundance)指数，二者的值越大，说明群落丰富度越高; Shannon和Simpson指数是群落多样性(community diversity)指数，Simpson指数越大，说明群落多样性越低，Shannon指数越大，说明群落多样性越高。用Qiime软件，根据各样品的物种进化和丰度信息，进行Unifrac分析[15-16]，得到样品间差异距离矩阵，然后进行PCoA分析。根据精简后的OTU列表，用R软件中的pheatmap程序包进行属水平上的聚类分析，并绘制出heatmap[17-18]图。
运用SPSS 16.0软件进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析3种模式下稻田水体理化性质数据的差异，用Duncan’s法进行多重比较，同一列不同字母表示显著性差异。
2 结果 2.1 水体理化性质3个处理组pH为8.17~8.36，温度为19.8~20.2 ℃。不同施肥模式下的水体理化性质(表 1)差异较大。与CF组相比，OF组总氮含量明显较高，OM组的总氮、总磷含量明显较高，溶解氧含量明显较低(P < 0.05)。与OF组相比，OM组的总氮、总磷含量明显较高，溶氧含量明显较低(P < 0.05)。
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表 1 3种不同施肥模式下水体理化指标 Tab.1 The water chemical parameters of paddy field in three fertilization models |
CF、OF和OM等3种施肥模式的水体微生物高通量测序所获得的有效平均序列数分别为63 999.00±2 649.24、54 557.56±5 896.21和54 633.67±4 052.70，序列长度在471.60~486.06 bp，见表 2。获得的总的有效序列数为1 174 718条，平均片段长度458.00 bp。
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表 2 3种施肥模式下水体微生物高通量测序结果 Tab.2 The high throughput sequencing of water bacteria in paddy field in three fertilization models |
3个处理组水体微生物多样性(图 1)α多样性分析结果显示：OF组的ACE指数显著高于CF组和OM组，OM组的ACE指数显著高于CF组(P < 0.001)。Shannon指数比较发现，CF组和OF组均显著高于OM组(P < 0.001)。OF组和OM组的水体微生物多样性在丰度上明显高于CF组。在物种多样性上，CF组和OF组明显高于OM组。
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***表示有显著性差异，P < 0.001 ***Indicates significant difference, P < 0.001 图 1 3种施肥模式下水体微生物多样性 Fig. 1 The diversity index of water microbe in three fertilization models |
在97%的相似性下共得到2 564个OTU(图 2)，其中3个处理组共有的OTU占总OTU的36.90%。OF组和OM组共有的OTU占总OTU的67.71%，OF组与CF组共有的OTU占总OTU的41.69%，OM组与CF组共有的OTU占总OTU的39.43%。这表明3个处理组共有的种类不是特别集中，并且OF组和OM组在微生物组成方面相似性明显更高。与CF组的共有OTU相对较少，相似度较低。结果表明施用不同肥料水体微生物组成有着明显的不同。
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图 2 3种施肥模式下水体微生物OTU Venn 图 Fig. 2 The statistical result of OTU in three fertilization models |
在测序结果中得到的菌群分属38门95纲192目378科798属1 399种。得到的序列为细菌序列，在门水平上超过97%的OTU被分类。在细菌组成上3种模式下的细菌是相似的，主要门是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Acfinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，见图 3。这些细菌是组成水体细菌的主要成分，占据了90%以上的OTU。对3种施肥模式下各个主要菌门的相对丰度分析可以看出，各菌群在门水平上有着较大差异：施用有机肥和鸡粪的田块中，放线菌门的相对丰度明显高于施用化肥和施用有机肥的田块(P < 0.001)；蓝藻门的相对丰度明显低于施用化肥和施用有机肥的田块(P < 0.001)；拟杆菌门的相对丰度施用化肥的田块会明显低于另外2个田块(P < 0.05)。
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分析过程中将相对丰度低于1%的归于“其他”组内。CF1-3.化肥组; OF1-6有机肥组; OM1-9.有机肥加鸡粪组 Sequences whose relative abundance was lower than 1% were assigned as "others". CF1-3. chemical fertilizer group; OF1-6. organic fertilizer group; OM1-9. organic fertilizer+fowl manure 图 3 3种施肥模式下细菌门水平的细菌组成丰度图 Fig. 3 Abundance of bacterial composition at the level of phyla under three fertilization modes |
3个处理组共得到798个属。56.89%的菌属是3种模式共有的，CF组和OF组、CF组和OM组、OF组和OM组共有的细菌分别占据总菌属的59.77%、58.65%、83.21%。OF组和OM组的相似度更高。对3种不同模式下的含量超过0.1%细菌进行丰度的排序(图 4)。3种模式下Polynucleobacter、Candidatus_Aquiluna、Sporichthyaceae hgcl_clade、Limnohabitans、Synechococcus、Comamonadacea、Alpinimonas、norank c_Cyanobacteria等均为主要的菌属。聚球藻属(Synechococcus)是实验水体环境中平均相对丰度最高的属，在3个组中分别占据了13.64%、7.82%和0.28%。norank c_Cyanobacteria、Comamonadaceae、Polynu-cleobacter、Candidatus_Aquiluna、Sporichthyaceae、Flavobacterium、Alpinimonas、Klebsiella、Massilia、Sphingomonas、Exiguobacterium等菌属在3个不同处理组中差异显著(表 3)。
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表 3 3种施肥模式下差异较大主要菌属 Tab.3 The major bacteria with significant differences under the three fertilization modes |
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分析过程中将相对丰度低于1%的归于“其他”组内。CF1-3.化肥组; OF1-6有机肥组; OM1-9.有机肥加鸡粪组 Sequences whose relative abundance was lower than 1% were assigned as "others". CF1-3. chemical fertilizer group; OF1-6. organic fertilizer group; OM1-9. organic fertilizer+fowl manure 图 4 3种施肥模式下细菌属水平的细菌组成丰度图 Fig. 4 Abundance of bacterial composition at the level of genus under three fertilization modes |
对3种施肥模式下的水体微生物群落进行聚类分析, 可以看出相同处理下的样本聚集在一起，表明了样品有很好的重复性，并且PCoA图中OF处理组和OM处理组的距离较近，表明2个组的相似性更高，见图 5a。在等级树中，OF处理组和OM处理组聚集在一个分支上，而CF组独立于另外一个分支，同样表明了OF处理组和OM处理组更高的相似度，见图 5b。
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CF1-3.化肥组; OF1-6.有机肥组; OM1-9.有机肥加鸡粪组 CF1-3. chemical fertilizer group; OF1-6. organic fertilizer group; OM1-9. organic fertilizer+fowl manure 图 5 基于OTU水平下水体微生物群落的主成分(PCoA)分析图(a)以及聚类分析树(b) Fig. 5 PCoA analysis diagram (a) and cluster analysis tree (b) at OTU level |
为了解3种施肥模式下水体理化性质对与水体微生物的相关性，运用冗余分析(RDA)对这3种施肥模式下10种主要菌属和水体理化性质的相关性进行分析(图 6), 结果显示：前2个排序轴的特征值分别为0.485 9、0.139 0，硝态氮0.485 9、氨氮0.139 0、亚硝态氮0.050 5、总氮0.027 9、总磷0.015 3、溶解氧0.003 4主要贡献于第一排序轴，pH 0.003主要贡献于第二排序轴。对细菌组成和这些菌属主要的影响因子为溶氧、总氮、pH、总磷。图 6中Polynucleobacter、Candidatus_Aquiluna、Sporichthyaceae hgcl_clade、Comamonadacea、Alpinimonas等菌属与硝态氮、氨氮、亚硝态氮、总氮、总磷、pH呈现正相关，与溶氧呈负相关；norank c_Cyanobacteria、Synechococcus、Limnohabitans等菌属与溶氧呈现正相关，与硝态氮、氨氮、亚硝态氮、总氮、总磷、pH呈负相关。
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图 6 10种主要菌属与水体环境因子的RDA排序图 Fig. 6 RDA sequencing diagram of 10 major genera and water environmental factors |
水生生物的多样性受到多方面的影响，包括人为因素和自然因素，以往对于水体微生物的研究多集中在自然水体如湖泊[19]、海洋[20]之中。有研究[21]表明养殖活动会改变群落结构。本研究中OF组与OM组的水体细菌丰度显著高于CF组。与施用化肥相比，施用有机肥能够有效提升微生物生物量，这与孙凤霞等[22]对土壤微生物的研究结果一致。鸡粪与有机肥配施降低了水体细菌物种多样性，推测可能是由于鸡粪等畜禽粪便对抗生素和重金属等有吸附作用[23-24]，在腐熟鸡粪处理不完全时带入水体，抗生素和重金属会对菌群结构造成不利影响。生物多样性可以在一定程度上反映生态系统的稳定性。较高的生物多样性能够使得生态系统更加稳定[25]。由此可以推测OF组水体生态系统更加稳定。3个处理组的PCoA图和聚类分析表明，同一处理组的样品细菌群落结构相似度较高，不同处理组的样品分离度很好，表明不同的施肥种类会对水体细菌有着很明显的影响。聚类分析中，OF组与OM组聚为1支，与CF组分离，表明鸡粪的配施对水体菌群的影响小于施用有机肥与化肥的差异。
水体生态系统的稳定与良好不仅与生物多样性有关，也与水体细菌组成及功能相关。本研究中主要的细菌组成在门水平上与之前的研究[26]基本一致，获得的变形菌门相对丰度更高。蓝藻门细菌在3个实验塘中均有广泛分布，与成敏玲等[26]对湖泊水体细菌组成研究结果一致。在3个处理组中蓝藻门细菌相对丰度差异显著。N、P元素是决定蓝藻生长的营养元素，并且当N/P大于7时，P元素是限制蓝藻生长的因素[27]。本实验处于养殖初期，底肥的施用导致N、P元素已经在水体中有较多的积累，不再是限制蓝藻生长的因素。OM组蓝藻门细菌相对丰度显著低于其余2组，这与之前孟顺龙等[28]研究鸡粪的施用可以降低水体环境中蓝藻的含量结果一致。水体细菌属水平上分析结果显示，黄杆菌属(Flavobacterium)广泛存在于养殖水体之中[29]。黄杆菌属是严格的好氧菌，本实验中3个处理组中均存在，表明3个处理组溶氧条件相对良好。CF组中克雷伯氏菌属(Klebsiella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、微小杆菌属等菌属均显著高于OF组与OM组。克雷伯氏菌属具有降解氨氮、去除有机物等作用[30]；鞘氨醇单胞菌属，常被用于有机污染物的生物降解[31]；微小杆菌属(Exiguobacterium)在有机物污染、重金属处理等方面有着积极作用[32]。这些菌属的相对丰度较高可能是由于化肥在底肥施用前期较短时间内释放大量的营养元素和化肥施用的污染导致这些细菌的大量生长。
水体理化因子是微生物群落的重要影响因子。在底肥施用1个月后，水体中N、P含量受到肥料的影响含量较高，此时水体处于富营养化的状态。OF组与OM组总氮含量显著高于CF组，推测是由于化肥肥效短，释放速率快，有机肥和鸡粪肥效长，使得水体中N、P始终保持较高的含量。本研究将细菌结构和水体理化因子进行关联分析，发现溶氧、总氮、总磷和pH是影响水体细菌的主要因素。对湖泊水体细菌进行的研究[27, 33]也发现pH、水温和溶氧是影响细菌群落结构组成的主要因素。相较于湖泊，本实验中养殖水体面积小，不同田块水体温度无明显差异，温度对水体细菌群落结构的影响无法辨别。稻田综合种养由于施肥等人工活动N、P积累量大，并且有研究[34]表明水体营养是影响到水体细菌组成的主要因素。在本次研究中总氮和总磷也是影响水体细菌的主要环境因子之一。
综上所述，不同的施肥模式会影响水体的理化性质和改变细菌的群落结构组成。研究结果表明，相较于施用化肥与有机肥加鸡粪的田块，施用有机肥的田块水体生物多样性更高，生态系统更加稳定。有机肥与鸡粪配施虽然会降低水体细菌的物种多样性，但是会大大减少蓝藻细菌的丰度。溶氧、总氮、总磷、pH是影响水体细菌群落结构的主要环境因子。
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2. National Experimental Teaching and Demonstration Center of Fisheries Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. Shanghai Aquaculture Engineering Technology Research Center, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
4. Fisheries Technology Extension Center of Jiangsu Province, Nanjing 210036, Jiangsu, China