2. 上海市水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
凡纳滨对虾属于节肢动物门、甲壳纲,是我国目前养殖范围最广的对虾品种。但近些年来细菌性疾病和环境胁迫导致对虾大量死亡,严重影响了对虾养殖产业的发展。甲壳类动物只具有先天性免疫防御系统,而不具备获得性免疫能力[1]。在先天性免疫反应中,机体借助细胞外的病原分子识别模式(PAMP)识别病原,通过细胞膜上的多种信号传递通路,将病原感染入侵信号传递到细胞内,产生和释放一系列免疫效应因子完成对病原的消灭和清除[2]。因此, 免疫过程中信号传递通路的关键蛋白以及重要效应因子的转录水平可以在一定程度上反映机体免疫机能。Toll受体作为一种模式识别受体,可以识别入侵异物的PAMP,并激活信号传导以诱导先天免疫反应[3]。IMD基因编码具有与哺乳动物RIP(受体相互作用蛋白)相似的死亡结构域蛋白,激活信号级联因子NF-κB[4]。溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有裂解活性,可以激活补体系统和加强吞噬细胞的吞噬能力[5]。因此, Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA的表达量可以作为评判机体非特异性免疫机能的指标。免疫灵敏性和平衡性(即机体对侵入体内的异物能迅速充分清除并在异物清除后恢复到初始状态)是评判机体免疫机能强弱的核心问题[6]。已有研究[7-9]表明,细菌感染进程中免疫相关基因表达量的上调时刻和变化幅度可以表征机体免疫的灵敏性和平衡性。
胆固醇是构成细胞膜的重要组成部分,可以维持细胞膜的流动性[10];作为类固醇激素如性激素、蜕壳激素、肾上腺皮质激素和维生素D等合成的前体物质,对性腺发育、蜕壳及机体内代谢等具有重要的调节作用[11-13]。但对虾等甲壳类动物缺乏合成胆固醇的能力,必须从饲料中获取胆固醇以满足其生长发育的需求;以生长作为评判指标,凡纳滨对虾对饲料胆固醇的需求水平为0.13%~0.42%[14-17]。已有研究[18-19]表明饲料最佳生长所需的营养水平和发挥最佳免疫机能所需的营养水平并不完全一致。王鑫磊等[20]的研究表明饲料胆固醇水平影响凡纳滨对虾抗弧菌能力和抗亚硝酸态氮胁迫的能力。温度和溶解氧是水生动物赖以生存的重要影响因素。温度影响水生动物的能量代谢、蛋白质代谢、脂肪代谢和核苷酸代谢等[21],凡纳滨对虾的适温范围为23~30 ℃,过高或过低的温度都会导致机体不同程度的应激反应[22];在我国华东及华北地区,凡纳滨对虾养殖早期和晚期均容易受到寒潮影响。在高密度养殖情况下水体溶解氧也是制约对虾生产性能的重要因子。笔者在前期研究的基础上,继续探究饲料中胆固醇含量对淡水养殖的凡纳滨对虾急性感染副溶血弧菌前后免疫相关基因(Toll受体、IMD和溶菌酶)表达量及抗低温和低溶解氧胁迫能力的影响,以完善在淡水养殖条件下饲料胆固醇对凡纳滨对虾免疫及抗逆机能的研究。
1 材料与方法 1.1 饲料制作根据表 1饲料配方,制作5组不同胆固醇含量的等氮等能饲料。原料经破碎后过80目筛,各种原料混合均匀后加水制成面团状。用绞肉机制成粒径1.5 mm的条状,90 ℃熟化20 min后在阴凉处风干,然后破碎筛分成合适的颗粒用于对虾养殖试验。真空包装,-20 ℃保存备用。
实验用凡纳滨对虾虾苗购买自上海彰显渔业专业合作社。虾苗经淡化后暂养,待虾苗达到(0.14±0.03) g时,挑选750尾健康活泼、规格整齐的幼虾,随机分配到同一水池(5.0 m×11.0 m×1.2 m)的15个网箱(1.0 m×1.0 m×1.2 m)中。实验共分5组,每组3个平行,每平行50尾虾。分别投喂5组不同胆固醇含量的实验饲料,投喂时间分别为5:30,11:00,17:00,22:30,日投喂量占虾体质量的5%~8%,根据摄食情况做适当调整。养殖期间,每3天换1次水,换水量约为水体的1/4;连续充氧,保持水体溶解氧>6 mg /L,氨氮<0.2 mg/L,亚硝酸氮<0.01 mg/L,pH 8.0~8.5,水温(31±2) ℃,表观盐度0。8周养殖试验结束后,各组对虾用于弧菌感染试验及低温低溶解氧胁迫试验。
1.3 副溶血弧菌感染试验副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)菌株来自上海海洋大学病原库,经活化培养后,用福尔马林灭活,离心收集弧菌细胞,用生理盐水稀释成1.25×106 CFU/mL的菌悬液,用于感染试验。
每处理组随机取蜕皮间期的对虾45尾,分3个平行,每平行15尾暂养于1个网箱(50 cm × 30 cm × 80 cm)中,所有网箱悬挂于同一水泥池(2.8 m × 4.5 m × 1.5 cm)中。每尾对虾经腹部注射灭活的副溶血弧菌菌悬液25 μL,感染期间持续曝气,水温30~32 ℃。每组分别在感染0、6、12、24、36、42和48 h时随机取3尾虾鳃组织,迅速置于盛有预冷RNA保存液(北京天根公司)的1.5 mL离心管中,带回实验室后用于测定免疫相关基因的相对表达量。
1.4 急性低温胁迫试验在低温恒温液浴循环槽(BH8104-D-D81-R10C,杭州保恒恒温技术有限公司)内设置小网箱。每处理组随机取9尾处于蜕皮间期、规格相近的对虾置于低温循环槽内相同规格的3个小网箱中,连续充气。选取20 ℃为低温胁迫的起始温度,并以1 ℃/h的速度程序降温。以身体僵硬、针刺肌肉不动为死亡标准,依次记录对虾死亡温度和死亡时间。统计各组对虾的累计死亡率。
1.5 低溶解氧胁迫试验各处理组随机取9尾处于蜕皮间期、规格相近的对虾,分3个平行。在2 L的锥形瓶中注入连续曝气24 h的25 ℃自来水,并将3尾对虾和磁力搅拌子、绑定有溶氧仪探头的玻璃棒放于烧瓶中,锥形瓶用液体石蜡封口。将锥形瓶放在磁力搅拌器上以固定转速持续缓慢搅拌。试验在25 ℃的空调房中进行。以对虾侧躺不动判定对虾死亡。记录对虾开始及死亡时的溶氧和时间,并称量对虾体质量。计算耗氧量,耗氧量计算公式如下:
式中:DO0为初始溶解氧,mg/L;DO1为3尾虾死亡时的平均溶解氧,mg/L;V为锥形瓶中水的体积,L;W为三尾虾的总质量,g。
1.6 样品测定 1.6.1 饲料常规测定饲料中水分采用105 ℃烘箱干燥恒重法(GB 6435286)测定;总脂肪测定用氯仿-甲醇法;灰分用550 ℃马福炉灼烧法(GB 6538286)测定;粗蛋白质用凯氏定氮仪(KjeltecTM 2300, 瑞典)测定(GB 6432286)。
1.6.2 胆固醇含量测定胆固醇含量的测定参照王鑫磊等[20]实验方法进行。采用Waters e2695型液相色谱仪联合Waters 2998光电二极管阵列检测器,色谱柱为Agilent TC-C18(2)柱(5.0 μm×4.6 mm×250 mm)。用外标法计算胆固醇含量。
1.6.3 免疫相关基因相对表达量的测定鳃组织总RNA用RNA提取试剂盒(北京天根公司)提取,用NanoDrop2000超微量分光光度计测定其OD260和OD280比值,1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,-80℃保存备用。使用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser (Perfect Real Time)试剂盒将总RNA反转录为cDNA,-20℃保存备用。
引物设计参照美国国立生物技术信息中心的凡纳滨对虾溶菌酶基因、Toll受体基因、IMD基因和β-actin基因,由上海生工生物工程股份有限公司合成(表 2)。
按照SYBR Premix Ex TaqTM (TliRNaseHPlus)试剂盒(TaKaRa公司)说明,使用RT-PCR仪(Bio-rad公司)进行qRT-PCR。RT-PCR程序为95 ℃、30 s预变性;95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,共39个循环;反应后65 ℃上升至95 ℃测定溶解曲线检测反应特异性。每个复孔以β-actin为参照基因。基因表达结果采用相对表达量的形式,以2-ΔΔCt法进行计算。
1.7 数据分析试验结果采用平均值±标准误(Mean ± SE)的方式表示,使用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏法多重比较,P<0.05则表示差异显著。
2 结果 2.1 对凡纳滨对虾急性感染副溶血弧菌后免疫相关基因表达的影响在弧菌感染前(0 h),各组对虾鳃组织中Toll受体mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。随着感染进程,各组对虾鳃组织中Toll受体mRNA表达量总体上先升高后下降,且均在24 h达到峰值,C2组Toll受体mRNA表达量峰值显著高于其他组的表达量峰值(P<0.05)。随后各组对虾Toll受体mRNA表达量均逐步降低,42 h时C2组Toll受体mRNA表达量依然显著高于C0和C1组(P<0.05),但与C3和C4组无显著差异(表 3)。48 h时各组间Toll受体mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。从感染前后对虾Toll受体mRNA表达量变化箱体图可知,C2组在弧菌感染进程中表现出最大的Toll受体mRNA表达量变化幅度(图 1)。
在弧菌感染前(0 h),C0组对虾鳃组织中IMD mRNA表达量显著低于其他组(P<0.05)。随着感染进程,各组对虾鳃组织中IMD mRNA表达量先升高后降低。感染6 h C0、C1和C2组IMD mRNA表达量即出现显著上调,且C1组表达量显著高于其他组(P<0.05)。感染12 h时C1组表达量依然显著高于其他组(P<0.05)。感染24 h时C2、C3和C4组IMD mRNA表达量达到峰值,且C1、C2组峰值显著高于其他组(P<0.05)。感染42 h时C0和C1组IMD mRNA表达量达到峰值,此时C1组显著高于其他组(P<0.05)。48 h时C2和C3组IMD mRNA表达量依然显著高于C0、C1和C4组(P<0.05,表 3)。从感染前后对虾IMD mRNA表达量变化箱体图可知,C1和C2组在弧菌感染进程中表现出最大的IMD mRNA表达量变化幅度(图 2)。
在弧菌感染前(0 h),各组对虾鳃组织中溶菌酶mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。随着感染进程,各组对虾鳃组织中溶菌酶mRNA表达量也呈先升后降的变化。感染6 h C1和C2组溶菌酶mRNA表达量即出现显著上调(P<0.05)。感染24 h时各组溶菌酶mRNA表达量均达到峰值,且C3组具有最大峰值,显著高于C0和C1组的表达量峰值(P<0.05);随后各组溶菌酶mRNA表达量均逐步降低。48 h时除C1组外,其余各组溶菌酶mRNA表达量恢复到初始水平(表 3)。从感染前后对虾溶菌酶mRNA表达量变化箱体图可知,C2组在经历弧菌感染后表现出最大的表达量变化幅度(图 3)。
由表 4可知,饲料胆固醇含量对凡纳滨对虾急性溶解氧胁迫下的耗氧量和致死溶氧浓度均无显著性影响(P>0.05)。
在急性程序降温胁迫下:当温度降低到18 ℃时,C0组表现出最大的死亡率,而C2和C4组无死亡对虾;当温度降低到17 ℃时,C2组表现出最小的累积死亡率;当温度降低到15 ℃时,C3组表现出最小的累积死亡率,而C0和C4组累计死亡率达到100%;当温度降低到14 ℃时,所有实验组对虾均达到100%死亡(图 4)。
营养素水平可以影响感染后对虾机体免疫相关基因表达量。罗词兴等[8]认为饲料中添加酵母提取物可以提高弧菌感染后凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体mRNA、IMD mRNA和溶菌酶mRNA表达量的峰值。赵利斌等[9]研究发现饲料中花生四烯酸含量也影响弧菌感染后Toll受体mRNA、IMD mRNA和溶菌酶mRNA表达量的峰值。本研究发现饲料胆固醇含量显著影响弧菌急性感染后凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量。感染后C2组对虾Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量峰值大于其他组(P <0.05);而IMD mRNA表达量峰值在C1组最大,其次为C2组。并且,Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量峰值均出现在24 h,而IMD mRNA表达量峰值出现时间随饲料胆固醇含量的增加而提前。因此,胆固醇可以上调弧菌感染后免疫相关基因的表达量峰值,但不影响Toll受体和IMD mRNA表达量峰值的上调时间。有研究[23]表明胆固醇可以增强小鼠细胞中髓样分化因子(MyD88)和泛素连接酶(TRAF6)的募集,而MyD88和TRAF6可以促进Toll受体和IMD信号传导,刺激免疫效应因子的产生和释放。凡纳滨对虾肝胰腺和肌肉中的胆固醇沉积水平与饲料中胆固醇含量呈正相关[20]。推测细胞膜中胆固醇增加,通过MyD88和TRAF6的募集调控Toll受体和IMD mRNA的表达,并通过信号级联反应刺激溶菌酶基因表达。然而,过高的胆固醇水平导致病菌感染后Toll受体mRNA、IMD mRNA和溶菌酶mRNA表达量峰值降低的机理尚不清楚。
评判机体免疫机能是否改善,不单要看某些免疫指标的水平,更要看感染进程中免疫指标的变化情况。细菌感染进程中免疫相关基因表达量的上调时刻和变化幅度可以表征机体免疫的灵敏性和平衡性[7-9]。黄旭雄等[7]研究发现饲料中添加酵母提取物可以提高人工感染溶藻弧菌后免疫相关基因的灵敏性,但不影响Toll 受体mRNA的平衡性。赵利斌等[9]研究表明饲料中花生四烯酸水平为0.56 mg/g(鱼油组)和1.44 mg/g(植物油组)时,免疫相关基因表达量具有较好的免疫灵敏性。在本研究中,C2组Toll受体和溶菌酶mRNA表达量变化幅度最大,而IMD mRNA表达量变化幅度最大的是C1组,其次为C2组,表明在相同剂量弧菌感染下,饲料胆固醇含量影响凡纳滨对虾免疫反应的灵敏性。
本研究中,C2组(2.45 g/kg diet)对虾表现出最大的免疫灵敏性和较好的免疫平衡性,这与前期王鑫磊等[19]研究结果相吻合。王鑫磊等[20]发现在淡水养殖条件下,生产性饲料中2.45 g/kg饲料的胆固醇含量可获得最佳的抗弧菌能力。
3.2 对凡纳滨对虾抗低温胁迫能力的影响温度是影响鱼虾生存的重要理化因子,水温的急剧变化会引起水生动物机体生理性变化。低温可以通过抑制机体免疫系统和干扰生理过程影响对虾的健康[24]。在急性程序降温胁迫下,C0和C4组对虾100%死亡的温度为15 ℃,而C1、C2和C3组对虾100%死亡的温度为14 ℃,表明饲料中胆固醇含量过低或过高均会影响凡纳滨对虾的抗低温胁迫能力,其机理推测可能与胆固醇在细胞膜中与磷脂的相互作用有关。在动物细胞中,胆固醇对细胞膜的流动性起到了重要的调节作用,一方面胆固醇分子与磷脂分子相结合限制了磷脂分子的热运动,另一方面胆固醇又将磷脂分子相隔开使其更易流动[25]。在较低温下细胞膜中磷脂分子运动较弱时,胆固醇可以提高细胞膜的流动性;在较高温度下细胞膜磷脂分子运动较强时,胆固醇可以降低膜的流动性,使细胞膜在很大温度范围内保持相对稳定的半流动状态[26]。一般认为机体抗低温性能与细胞膜的流动性密切相关,低温下保持细胞膜的流动性是发挥细胞正常生理功能的基础。IRVINE等[27]研究表明饲料中添加胆固醇可以提高金鱼的耐高温和低温能力,并且耐温性能的提高与组织中胆固醇含量的增加有关。
3.3 对凡纳滨对虾抗急性低溶解氧胁迫能力的影响低溶解氧环境会影响水生动物的摄食、生长、发育、繁殖等方面[28]。有关饲料胆固醇与水生动物抗低氧胁迫能力的研究未见报道。对哺乳动物红细胞氧合作用的研究发现,红细胞中血浆膜胆固醇含量与红细胞氧气的摄入和释放能呈正相关[29-30],表明胆固醇会影响脊椎动物的耐低氧能力。然而,本研究中饲料中胆固醇含量并未影响凡纳滨对虾抗低氧胁迫能力,一方面可能是对虾具有不同的氧合作用机制,对虾通过血蓝蛋白而不是血红细胞进行氧的运输,另一方面可能与低氧胁迫试验的设置强度有关。
综上所述,在淡水养殖条件下,饲料中胆固醇含量为2.45 mg/g时可以提高凡纳滨对虾免疫灵敏性,而胆固醇含量在1.57~3.43 mg/g时凡纳滨对虾表现出较好的低温胁迫能力。
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2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306, China;
3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China