2020,
Vol. 29
2. 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心, 江苏 连云港 222005;
3. 上海海洋大学 食品学院, 上海 201306
蜈蚣藻属(Grateloupia)隶属于红藻门(Rhodophyta)、隐丝藻目(Cryptonemiales)、海膜科(Halymeniaceae)。目前全世界共报道约80种，中国共报道了32种[1]。蜈蚣藻属植物分布较为广泛，主要集中在亚洲海域，在西班牙沿海也有分布[2-3]。舌状蜈蚣藻(Grateloupia livida)是常见的蜈蚣藻属植物，可用于食用、药用和制胶等方面，其性咸寒，具有清热解毒驱虫之功效，可用于治疗喉炎、蛔虫病[4]。蜈蚣藻(Grateloupia filicina)多糖，通常占到海藻干物质的50%以上[5-6]，具有抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、调节免疫等多种生物活性[7-10]，经济价值高。研究表明：蜈蚣藻多糖具有较好的抗氧化活性。例如：繁枝蜈蚣藻(Grateloupia ramosissima)具有较强的还原力，与浓度呈线性关系，当浓度为0.25 mg/mL时，还原力强于BHA(叔丁基-4羟基茴香醚)和PG(没食子酸丙脂)[11]。蜈蚣藻多糖有良好的清除·OH和·O2-的能力，清除率的半抑制质量浓度(IC50)分别为4.62 mg/mL和0.62 mg/mL[12]。TANG等[8]发现纯化后的蜈蚣藻多糖具有更好的抗氧化能力。
目前，对于舌状蜈蚣藻多糖的提取及抗氧化活性的研究较少，考虑到热水浸提法成本低，适用于大规模工业化生产[13]，故本实验采取热水浸提法提取舌状蜈蚣藻多糖，同时，研究舌状蜈蚣藻多糖的抗氧化性，以期为蜈蚣藻资源的综合开发和利用提供参考和理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器舌状蜈蚣藻采自汕头南澳岛，由汕头大学陈伟洲教授鉴定。
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、维生素C(Vc，华屿欣试剂有限公司)；无水葡萄糖(分析纯，大连美仑生物技术有限公司)；其余试剂均为国产分析纯。
DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒公司)；800Y多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；HWS24电热恒温水浴锅(上海一恒公司)；AvantiJ26XP高速离心机(美国贝克曼库尔特公司)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SUNRISE吸光酶标仪(瑞士TECAN公司)。
1.2 方法 1.2.1 舌状蜈蚣藻多糖的提取舌状蜈蚣藻→清洗烘干粉碎→2倍体积无水乙醇浸泡12 h→抽滤，烘干→按照预设料液比加入蒸馏水→设置不同的温度和时间进行水浴处理→离心取上清→旋转真空浓缩→醇沉过夜→离心弃上清→依次用丙酮、无水乙醇洗涤→冻干→舌状蜈蚣藻粗多糖(GLP)[14-16]。
1.2.2 多糖含量的测定参考张婧婧等[12]和朱良等[14]的方法，首先绘制葡萄糖标准曲线，再进行舌状蜈蚣藻多糖含量的测定。
1.2.3 舌状蜈蚣藻多糖提取条件的优化分析料液比、温度、时间3种因素对粗多糖得率的影响[14-15]。以料液比为1: 30~1: 70 g/mL进行研究；选取60~100 ℃进行温度的研究；选取2~6 h 5个水平进行时间的研究，以多糖得率为评价指标，计算公式：
(1)
式中：F为多糖得率，%；W1为舌状蜈蚣藻的质量，g；W2为粗多糖的质量，g；W3为从W2中取出的用于分析的粗多糖质量，g；V为溶解W3粗多糖定容后的体积，L；f为多糖的校正系数，约为0.9；C为多糖浓度，g/L。
1.2.4 响应面优化试验设计本文根据单因素的实验结果采用Box-Bohnken法[17-18]，对热水浸提法提取舌状蜈蚣藻多糖最优工艺条件(料液比、温度、时间)进行响应面优化试验。实验设计见表 1。
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表 1 响应面试验设计因素与水平 Tab.1 Factors and levels used in response surface analysis |
DPPH自由基清除率的测定参考ZHANG等[19-21]的方法；羟自由基清除率的测定参考CHENG等[22-24]的方法。
1.2.6 数据处理利用Excel和SPSS 22.0软件对数据进行处理和分析。
2 结果与分析 2.1 多糖含量的测定实验得到葡萄糖标准曲线回归方程：
式中：x表示质量浓度，mg/mL; y表示吸光度。
2.2 单因素试验结果 2.2.1 料液比对多糖提取的影响设置不同料液比，70 ℃水浴2 h，考察料液比对多糖得率的影响。
由图 1可知，多糖得率随着料液比的增加，呈现先增后减的趋势，当料液比达到1: 40 g/mL时，得率达到最大值11.00%。这多是因为当料液比偏小时，多糖提取不充分，多糖得率低；随着料液比的增加，物料与溶剂接触面积增加，使多糖的得率增加[25-26]；当料液比大于1: 40 g/mL时，多糖得率逐渐降低，可能是由于随着料液比逐渐增加，溶剂渗透到细胞内部的扩散距离增大，导致时间延长，使得多糖得率下降[27]。同时，考虑到溶剂量大时，不利于后续实验的进行，为了提高效率，降低消耗，选择1: 30 g/mL、1: 40 g/mL、1: 50 g/mL进行响应面分析。
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图 1 料液比对舌状蜈蚣藻多糖得率的影响 Fig. 1 Effect of different solid-to-solvent ratio on extraction yield of GLP |
由图 2可知：温度为60~70 ℃时，温度升高，多糖得率增加；温度为70~90 ℃时，随着温度的升高，多糖得率缓慢增长；当达到100 ℃时，多糖得率达到最大值13.38%。在一定程度上，热处理对于多糖得率起着至关重要的作用[28]，多糖的溶解度会随着温度的升高而增大，得率增加[29-30]。因此，选择80、90、100 ℃进行响应面试验。
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图 2 温度对舌状蜈蚣藻多糖得率的影响 Fig. 2 Effect of different temperature on extraction yield of GLP |
固定料液比为1: 40 g/mL，100 ℃水浴处理不同时间，观察多糖得率的变化。从图 3可以得出：多糖得率在2~4 h时间内显著增加，在4 h时达到最大15.11%，超过4 h后，多糖得率逐渐降低。这可能是随着时间的推移，多糖逐渐溶出，得率增加，提取4 h时，多糖基本溶解出来，但随着时间的继续增加，引起了多糖的降解，从而使多糖得率下降[31-35]。
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图 3 时间对舌状蜈蚣藻多糖得率的影响 Fig. 3 Effect of different time on extraction yield of GLP |
本文选取料液比(A)、温度(B)和时间(C)作为3个自变量，以舌状蜈蚣藻多糖得率(Y)为响应值，采用Box-Behnken设计法对浸提法条件进行设计，结果见表 2。
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表 2 舌状蜈蚣藻多糖得率的响应面试验方案及结果 Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis |
舌状蜈蚣藻多糖得率对料液比(A)、温度(B)以及时间(C)的二次多项式回归模型：Y=15.08-0.22A+0.35B-0.15C-0.96AB+0.43AC+0.23BC-1.94A2+0.17B2-0.49C2。
由表 3可知，模型的P小于0.0001，极显著，失拟项的P大于0.05，不显著，说明模型拟合良好，能较好地拟合料液比、温度、时间对多糖得率的影响。回归模型的决定系数Radj2=0.979 7，表明该模型可以拟合97.97%的响应值变化，因此该模型是可靠可信的，可以用来分析和预测多糖得率的实验结果。温度(B)、料液比与温度的交互项(AB)、料液比的二次项(A2)以及时间的二次项(C2)的P值均小于0.001，对多糖得率的影响极显著。料液比(A)、料液比与时间的交互项(AC)对多糖得率的影响高度显著(P＜0.01)。时间(C)、温度与时间的交互项(BC)对多糖得率的影响显著(P＜0.05)。但是，温度的二次项(B2)对于多糖得率的影响并不显著。在回归方程中，一次项系数的绝对值越大，对应因素对多糖得率的影响也越大。因此，3个因素对多糖得率的影响由大到小依次为时间、料液比、温度。
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表 3 回归模型方差分析 Tab.3 Analysis of variance of the regression model |
由图 4可知，料液比与温度相互作用对舌状蜈蚣藻多糖得率的影响极显著，料液比与时间交互作用对舌状蜈蚣藻多糖得率的影响高度显著，而温度与时间的交互影响对于舌状蜈蚣藻多糖得率的影响显著。对以上3组图进行分析可知：时间相关的曲线倾斜率大，则时间对响应值多糖得率的影响最明显；其次为料液比，而温度对响应值多糖得率的影响较小。
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图 4 各因素交互作用对多糖含量影响的响应面图 Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on polysaccharide yield |
通过对实验模型的分析，得出料液比1: 37 g/mL、提取温度99.25 ℃、提取时间3.94 h为提取舌状蜈蚣藻多糖的最佳工艺条件，考虑到实际情况，将最佳的实验条件调整为料液比1: 37 g/mL、提取温度100 ℃、提取时间4 h，此时多糖得率为15.23%，误差为0.99 %，因此本实验得到的最优条件可靠可行，具有一定的参考价值。
2.4 体外抗氧化活性测定结果 2.4.1 舌状蜈蚣藻多糖清除DPPH自由基的能力DPPH自由基的清除率是评判抗氧化剂的抗氧化能力的常用指标[35]。由图 5可知，舌状蜈蚣藻多糖清除DPPH自由基能力呈现剂量依赖性，且具有良好的线性关系(R2>0.93)。根据回归方程，计算舌状蜈蚣藻多糖对DPPH自由基清除能力的IC50值为12.61 mg/mL，低于龙须菜中硫琼脂对DPPH自由基的IC50(17 mg/mL)[35]，表明舌状蜈蚣藻多糖抗氧化性强于龙须菜中的硫琼脂，具有较好的抗氧化性。但是舌状蜈蚣藻多糖DPPH自由基清除能力明显低于Vc。
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图 5 多糖对DPPH自由基清除能力 Fig. 5 Scavenging effect of GLP on DPPH |
由图 6可知，舌状蜈蚣藻多糖对·OH清除率呈现剂量依赖性，在0.25~2.00 mg/mL之间线性关系良好。依据清除率曲线y=20.045x+8.841 2，R2=0.944 2，计算舌状蜈蚣藻多糖对·OH的IC50为2.05 mg/mL，低于蜈蚣藻多糖对·OH的IC50(4.62 mg/mL)[36]，说明舌状蜈蚣藻多糖的抗氧化性优于蜈蚣藻多糖。但由图 6可知，舌状蜈蚣藻抗氧化性明显低于Vc。
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图 6 多糖对·OH自由基清除能力 Fig. 6 Scavenging effect of GLP on·OH |
海藻多糖的提取方法主要有溶剂提取法、酶解法、物理提取法以及复合法等，方法众多，各有利弊。目前，主要以水浸提法为主。本文采用热水浸提法提取舌状蜈蚣藻多糖，多糖提取的最佳工艺条件为料液比1: 37(g/mL)、100 ℃沸水浴提取4 h，此时多糖得率为15.23%，约为带形蜈蚣藻(Grateloupia turuturu)多糖得率[37]的1.9倍，但是明显低于蜈蚣藻(Grateloupia filicina)[38]、赛氏蜈蚣藻(Grateloupia setchellii kylin)、青岛蜈蚣藻(Grateloupia qingdaoensis)[39]。这可能是由于蜈蚣藻的种类不同，使得多糖得率不同。研究发现，提前浸泡、适当增加多糖提取次数可以提高多糖得率。同时，藻类自身的产地、生长期，以及提取时的醇沉浓度对多糖得率也有一定的影响[38, 40]。
我国是海藻养殖大国，但是海藻的利用率不高，主要用来食用、制胶等。大量研究表明，海藻多糖具有抗氧化、抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性，有望应用于医药保健方向，提高海藻利用率以及海藻产业价值。近年来，海藻多糖的抗氧化活性受到越来越多的关注。研究表明，海藻多糖有较强的清除自由基的能力，能减少自由基的氧化反应，降低自由基对于人体细胞的氧化攻击。本文通过测定舌状蜈蚣藻多糖的DPPH自由基和羟自由基清除率，评价其体外抗氧化活性。结果表明：舌状蜈蚣藻多糖对DPPH自由基和羟自由基的清除能力均呈现剂量依赖性，随着多糖浓度的增加，自由基清除能力增强。舌状蜈蚣藻多糖对DPPH自由基和羟自由基的IC50分别为12.61 mg/mL和2.05 mg/mL，体外抗氧化活性较好，有望成为应用于食品、药品和化妆品行业的新型抗氧化剂。
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2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology, Lianyungang 222005, Jiangsu, China;
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