2. 上海海洋大学 海洋科学研究院海洋生态环境与修复研究所, 上海 201306;
3. 广东海洋大学 水产学院, 广东 湛江 524094
我国是海藻养殖大国,年总产量1 100万t,占世界海藻年总产量的近60%,但我国海藻养殖仍以褐藻(海带、裙带菜等)和红藻(紫菜、江蓠等)为主要养殖对象,绿藻养殖品种不仅少,仅以浒苔、礁膜等为主,而且产量也仅占全国海藻养殖总产量的0.2%[1]。
浒苔(Ulva prolifera),江浙一带称其为“苔条”,是一种可食用及药用海藻[2]。浒苔营养价值高,富含蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、维生素和P、Ca、Fe等多种矿物质[3-5]。我国在传统食用浒苔的基础上,开发了如浒苔挂面、浒苔酱、浒苔汤料和浒苔功能食品等[6-7]。然而目前,用于食品的浒苔原材料主要来源于野生滩涂和海区绳索自然纳苗。由于这两种传统采集方式局限于自然环境条件,且天然采集的浒苔是野生种,其产品质量均不可控,品种混杂,口感较差。据相关数据统计,宁波象山海域浒苔主要生长季节为每年12月底至次年3月底,具有很强的季节性,野生浒苔产量已经不能满足市场需求[8-9]。
杂种优势是自然界中普遍存在的一种现象。其后代在产量、抗逆性、适应力等方面表现出较强的优势,筛选优质“高生长率”“长成熟期”的浒苔品种成为攻克其产业发展瓶颈的关键手段,并且受到人们的广泛重视,也产生了巨大的经济效益[10]。在海藻养殖中,杂交育种多应用于紫菜和海带[11-12]。针对绿藻杂交方面,国内外研究较少。笔者通过对浒苔进行生活史判定,筛选雌雄配子体世代浒苔,以期解决浒苔人工杂交技术瓶颈,为未来获取优质浒苔品种,并进行规模化养殖,为浒苔绿藻市场供不应求的现状提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 样品采集与培养浒苔属绿藻采集自我国黄海沿海和日本海域,其中日本浒苔为高知大学藻类实验室保藏的藻种,样品信息见表 1。海藻样品运回实验室后挑选藻体完整、健康的新鲜个体,用灭菌海水和软刷去除表面附生生物。通过形态学特征和分子方法对采集的样品进行种类鉴定,确定其为浒苔(U. prolifera)和缘管浒苔(U. linza)种。在光周期12L: 12D,20 ℃和50~60 μmol/(m2·s)的条件下,将其放在VSE培养基中充气培养,每3天更换1次培养基[13]。
将藻体分别剪成3 mm片段,无菌淡水冲洗1 min,按照密度为0.8 g/L培养于烧杯中,在光周期12L: 12D,20 ℃和100 μmol/(m2·s)条件下通气培养2~3 d,每天显微观察藻体孢子/配子放散情况[14],并记录孢子/配子的大小及鞭毛数。
取高密度孢子/配子液滴在盛有12 mL无菌海水玻璃培养皿(直径90 mm)的中心,用白色荧光管对培养皿进行单侧光照射,观察孢子/配子的游动方向[15]。根据藻体两个连续世代放散的孢子/配子的鞭毛数量、大小和趋光性现象来判定藻体的生活史类型[16]。若藻体放散具有正趋光性的两鞭毛配子,则母体藻为配子体世代;若藻体放散具有负趋光性的两鞭毛或四鞭毛游动孢子,则母体藻为孢子体世代。
由浒苔两个连续世代的类型来判断该株浒苔的生活史类型。无性生殖表现为两个连续世代均放散带有负趋光性且大小相同的游动孢子。有性生殖则表现为两个连续世代产生具有正负趋光性的配子/孢子或者均产生具有正趋光性的配子[17]。见图 1。
趋光性可检验生殖细胞为孢子还是配子,但无法区分浒苔的雌雄。用无菌吸管吸取不同浒苔藻体释放的配子液放置在载玻片上进行混合镜检。若观察到两种配子各自游动、打圈,则表明这两种配子为同性,若发现两种配子成堆聚集,呈现块状分布,则表明两种配子为异性,可以用于进一步杂交实验。
1.3 浒苔与缘管浒苔雌雄配子体杂交实验将纯化的雌雄配子液滴在装有2 mL灭菌海水的玻璃表面皿的向光一侧,雌雄配子会聚集接合形成合子,由于合子具有负趋光性,因此杂交成功的合子会游向背光一侧[18],用滴管将合子吸取到载玻片上进行显微观察,最后转移至新的无菌烧杯中萌发培养,生长出的幼苗即为杂交后代。
1.4 杂交浒苔后代分子生物学检测杂交后代萌发生长过程中,每2天更换1次培养液,待藻体生长至1 cm后,可转移至新的烧杯进行单株充气培养。选取健康母本浒苔、缘管浒苔及杂交后代进行DNA提取。5S rDNA间隔序列引物设计及扩增程序参照SHIMADA等[19]的方法。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后,用天根普通琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)进行切胶回收,合格的扩增产物送至生工生物有限公司测序[20]。用Clustal X2软件对测序合格的序列进行多重比对分析,通过Mega 7.0.26构建序列对比图[21]。
2 结果 2.1 浒苔生活史的判定浒苔藻体切成3 mm左右的片段,培养于8孔板内,约3~4天后藻体释放生殖细胞。结果显示8株样品中有7株浒苔(编号分别是1,2,4~8),1株为缘管浒苔(编号是3)。这8株藻的F0均释放具有负趋光性的四鞭毛孢子(图版Ⅰ-1, 2),经传代培养获得F1,其中2号和4号藻的F1仍然释放负趋光性的四鞭毛孢子,从而确定其为无性生殖;剩余6株藻的F1释放的生殖细胞为正趋光性的两鞭毛配子(图版Ⅰ-3,4),确定其为有性生殖。
对浒苔配子体世代释放的配子液进行镜检,根据配子大小区分雌雄。镜检结果显示雌配子长和宽均比雄配子大。雌性配子平均大小为6.7 μm长,4.1 μm宽;雄性配子平均大小为6 μm长,3.4 μm宽。见图 2。
从配子囊中释放的雌雄配子呈梨形,具有一个橘红色眼点,两条等长的鞭毛(图版Ⅰ-4)。雌雄配子相遇后接合,其顶端先进行融合,雌雄配子的鞭毛逐渐消失,运动力逐渐下降,由梨形逐渐转变成为圆形,形成合子并开始固着,合子具有两个眼点(图版Ⅱ-1~ 3)。将合子暗处理24 h,5~7 d后固着的合子开始萌发生长成为杂交后代幼苗(图版Ⅱ-4)。
从缘管浒苔、浒苔及杂交后代PCR扩增产物电泳图中得出,5S rDNA间隔区序列的电泳条带有显著区别,缘管浒苔特异性条带位于350 bp左右,浒苔孢子体的条带在450 bp左右,杂交后代条带较多,在350 bp和450 bp处可以看到明亮条带,见图 3。用割胶回收的方法对杂交种的350 bp和450 bp条带进行测序,测序结果分别与亲本浒苔与缘管浒苔的序列进行比较。从序列对比图中得出,杂交后代与缘管浒苔有4个碱基差异(图 4),与浒苔的序列有15个碱基差异(图 5),由此进一步推断杂交成功。
浒苔的生活史为配子单倍体与孢子二倍体同形世代交替。它的繁殖方式多样化,兼具有性繁殖、无性繁殖、单性繁殖和营养繁殖[22]。海区晴天时光照强度高于300 μmol/(m2·s),浒苔的雌雄配子具有正趋光性,经单侧光照射后,雌雄配子在海平面聚集,利于其进行有性繁殖[13, 23]。有性繁殖可以使得亲本的序列发生重组,能够促进有利突变的形成,增强子代适应自然选择的能力[24]。在过去的十几年中,黄海绿潮优势种浒苔在基因序列上的演变可能与其进行有性生殖有关。此外,有报道[25]显示海区自然环境复杂多变,浒苔雌雄配子也可不通过接合直接附着萌发发育成为配子体,甚至不放散出来直接附生在老藻体上,从而通过单性生殖完成生活史。
对于无性生殖浒苔,因为这种生殖方式释放的孢子附着后即可萌发生长成为新藻体,无须经过雌雄配子的杂交过程,大大缩短了繁殖周期,节省了生命周转过程中的能量损耗,为藻体在短时间内的快速生物量聚集提供基础[15];此外,在浒苔经典养殖过程中,也往往采用藻种的无性生殖进行海上养殖,这种生殖方式既可以为浒苔人工栽培提供丰富的苗源,更重要是的可以保障优质基因稳定的遗传给后代,极大地降低养殖成本[14]。
截至目前,黄海绿潮灾害已连续12年大规模暴发,对沿海生态环境和生态服务功能均造成重大破坏[26]。绿潮平均每年覆盖面积可达500 km2左右,生物量可达34.6万t [27-28]。虽然绿潮优势种浒苔能够竞争性快速吸收海水中的营养物质,但浒苔的生活史策略在其中扮演着重要作用[29-30]。有研究[31]表明,1株浒苔在环境胁迫下,如果全部释放生殖细胞,经过1个生命周期,可形成数以万计的新生藻体。此外,浒苔生活史策略多样化,单性生殖、无性生殖和有性生殖可以同时进行,可以根据环境条件的变化,通过自身调控改变生殖方式,以期获得最大生物量,成为绿潮快速暴发的原因之一[32]。
3.2 绿藻浒苔杂交技术研发与应用浒苔是一种重要的经济海藻,其营养价值高,在食品、能源及生态修复方面应用广泛。由于传统浒苔优质品种的退化与海区环境因子的改变,可以利用杂交技术进行优质品种筛选,获得高生长率、高蛋白和低繁殖期的浒苔后代,有利于浒苔的人工规模化养殖。
藻类杂交育种是以基因型不同的品系进行交配产生具有一定优势的杂交种,再经过反复选育获得新品种的方法,其优势是可以有目的地将双亲的优良性状重组到杂交子代中杂交育种在农业上已应用得非常成功,杂交水稻是利用杂种优势的成功典范之一[33]。笔者通过筛选有性生活史的浒苔藻体,根据雌雄配子大小进行雌雄配子区分,分别获得雌雄配子体,再经过同时诱导雌雄配子体放散,获得雌雄配子纯化溶液,混合均匀后,雌雄配子便可自由杂交,后代进行独立纯化培养,通过分子检测确定成功杂交的浒苔后代。
浒苔藻类杂交有两个关键难点。第一,在杂交进行之前,要了解该浒苔的生活史以及藻体切段后的放散时间,确保雌雄配子体浒苔能够在同一时刻或相近时刻进行放散,从而获得活性高的雌雄配子,提高接合率。第二,雌雄配子结合形成合子后,两次以上的负趋光性纯化必不可少,因为培养皿中仍然存在未杂交的浒苔雌雄配子。趋光性纯化的目的是除去合子培养液里配子的污染,使得合子聚集在背光一侧,获得高度纯化的合子液。杂种优势已有很多研究,在藻类领域中,紫菜和海带的杂交研究较多,紫菜的耐高温、耐低盐和高蛋白的优质品种已进行了海区规模化养殖[34],已获得产量高、根系发达、色泽深褐的优质品种[35],未来优质的浒苔品种也将会通过杂交技术的进一步成熟而产业化应用。
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