2019,
Vol. 28
2. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
随着水产养殖规模不断增加，养殖过程中产生的固体废弃物所引发的水质恶化和环境污染等问题日益突出[1-2]。如何有效控制固体废弃物排放，实现其资源化利用，是我国水产养殖业可持续发展进程中面临的重要课题之一。
生物絮凝技术基于城市污水处理中活性污泥技术，通过提高水体碳氮比(C/N)促使异养细菌数量优势生长[3]，利用异养细菌同化氨氮，大量的异养细菌群落与浮游动植物、悬浮颗粒物通过絮凝作用形成微生物絮团[4]，微生物絮团可以作为饲料再次进行投喂。生物絮凝技术被证明可以提高饲料蛋白的利用效率，实现固体废弃物的资源化利用[5-6]。
pH不仅直接影响处理过程中活性污泥微生物的种类、数量、代谢方式和代谢产物的类型、表面特性，而且与活性污泥的沉降性和沉降过程密切相关[7-9]。本实验拟利用悬浮式生物反应器培养微生物絮团，研究不同pH对微生物絮团的营养组分、活性及氨氮转化效率的影响，希望能为水产养殖固体废弃物的处理和资源化利用提供参考。
1 材料与方法 1.1 悬浮式生物反应器自制悬浮式微生物反应器装置参考LU等[10]，有机玻璃材质，桶状，有效体积为10 L，高为100.0 cm，内径为15.0 cm，外径为15.8 cm(图 1)。烧瓶实验采用玻璃锥形瓶反应器，有效体积2 L。烧瓶实验取9个相同的玻璃锥形瓶，曝气设备为ACO-008B型电磁式空气泵(功率135 W、曝气量100 L/min)分接9个相同规格的石英砂曝气石，为反应器提供相同溶解氧浓度和混合强度。
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1.空气泵；2.曝气石；3.排水口 1.Air pump; 2. Aerolite; 3. Discharge port 图 1 培养絮团用的悬浮式微生物反应器示意图 Fig. 1 Schematic diagram of suspended growth reactors |
养殖固体废弃物收集于上海海洋大学循环水养殖系统研究平台中高体革
取50 g烘干(105 ℃)粉状高体革
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表 1 微生物絮团培养10 d后反应器中水质、絮团性能和营养指标(平均数±标准差) Tab.1 The indexes of water quality and bioflocs after 10 days of cultivating (Mean± SD) |
培养后的微生物絮团悬浊液均匀转入9个洁净的2 L玻璃锥形瓶，锥形瓶内放入石英砂曝气石间歇式曝气30 min。用10% HCl、10% NaOH和20% NaHCO3溶液分别调控pH为6.5、7.5、8.5共3个处理组[12-14]，每组3个平行。每日进行氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮及细菌相关指标检测，连续监测5 d，其间不添加碳源，比较不同pH条件下锥形瓶中的主要氮素指标和细菌组成变化情况。
1.4 分析项目与测定方法 1.4.1 水质指标水质分析于每日上午进行：水样经0.45 μm滤膜过滤后，用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测亚硝酸氮(NO2--N)、紫外分光光度法测硝酸氮(NO3--N)、纳氏试剂分光光度法测总氨氮(total ammonium nitrogen, TAN)、钼锑抗分光光度法测溶解性磷酸盐、用TOC-V·CPH型有机碳分析仪测定DOC、过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测总氮(total nitrogen, TN)[15]。温度、溶解氧、pH、氧化还原电位用YSI556MPS多参数水质测定仪测定。总无机氮(total inorganic nitrogen, TIN)为NO2--N、NO3--N、TAN之和，总有机氮(TON)为TN与TIN之差。
1.4.2 絮团活性指标耗氧速率(oxygen uptake rate，OUR)测定方法：添加NaClO3、ATU抑制剂，用YSI 5000直接测定[16]，采用钼锑抗分光光度法测定脂磷[17-18]。
1.4.3 絮团沉降性能与营养指标[19]5分钟内沉降絮团体积与混合液总体积比例为5分钟絮团体积指数(FV-5min)，滤纸烘干法测定混合液悬浮固体浓度(mixed liquor suspended solid，MLSS)，马弗炉(400~550 ℃)灼烧法测挥发性悬浮固体浓度(volatile suspended solids，VSS)；凯氏定氮法测絮团粗蛋白含量；马弗炉(400~550 ℃)灼烧法测粗灰分含量。
采用甲酰胺提取絮团胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)[20]，以葡萄糖为标准采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖；以牛血清白蛋白为标准采用Bradford法测定胞外蛋白质[21]。
1.5 数据分析采用Microsoft Excel和Origin进行数据分析，以平均值±标准差(Mean± SD)表示。
2 结果与分析 2.1 不同pH对反应器中氮、磷的影响 2.1.1 主要氮素指标如图 2所示，3个处理组中亚硝酸盐氮浓度都接近0 mg/L。3个实验组的硝酸盐氮浓度在实验后期逐渐升高，但积累不明显。不同pH对反应器中总氨氮浓度变化较大，都呈升高趋势，实验开始的总氨氮浓度为9.81 mg/L，实验结束时pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5组的总氨氮浓度分别为37.71、12.74、17.55 mg/L。pH 6.5组的总氨氮浓度显著高于pH 7.5、pH 8.5组，pH 6.5组的总有机氮占总氮百分比下降明显，且显著低于pH 7.5、pH 8.5组(图 3)。结果表明，pH 7.5、pH 8.5组的总氨氮向有机氮转化率高于pH 6.5组。
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图 2 不同pH处理组中亚硝酸盐氮(NO2--N)、硝酸盐氮(NO3--N)和总氨氮(TAN)浓度的变化 Fig. 2 Change of the concentration of nitrite-N, nitrate-N and total ammonium nitrogen (TAN) in three groups |
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图 3 不同pH处理组中总氨氮浓度(TAN, a)和总溶解有机氮与总氮的比值(TON/TN, b)的变化 Fig. 3 Change of the concentration of total ammonia nitrogen (a) and TON/TN (b) in different pH groups |
不同pH实验组中溶解性磷酸盐去除效果都较好(图 4)。pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5组的溶解性磷酸盐去除速率分别为1.29、0.92、0.80 mg/(L·d)。pH 6.5组的溶解性磷酸盐的去除率最高，但pH 6.5组的溶解性磷酸盐浓度显著高于pH 7.5、pH 8.5中溶解性磷酸盐浓度。
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图 4 不同pH处理组中溶解性磷酸盐浓度变化 Fig. 4 Change of the concentration of dissolved phosphate in different pH groups |
不同pH实验组的脂磷含量变化趋势相似(图 5)，组间差异不显著。脂类含量随着pH增大而升高，但差异不显著。
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图 5 不同pH反应器中微生物絮团脂磷含量的变化 Fig. 5 Change of the phosphate lipid content of microbial flocs in different pH reactor |
本文用OUR表示微生物活性。如图 6所示，不同pH组的总微生物耗氧率、异养细菌耗氧率逐渐增加，各pH实验组间无显著差异。3个pH组的硝化细菌耗氧率都处于较低水平，各组间无差异性。可看出，在不同pH组中，硝化细菌的活性显著低于异养细菌的活性，异养细菌活性略低于总微生物活性，其中pH 6.5组的总微生物耗氧率、异养细菌耗氧率以及硝化细菌耗氧率都略高于pH 7.5和8.5组。
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图 6 不同pH反应器中微生物絮团总微生物耗氧率(总-UUR, a)、异养细菌耗氧率(异-OUR, b)和硝化细菌耗氧率(硝-OUR, c)的变化 Fig. 6 Change of the total oxygen uptake rates (OUR) of the total bacteria, heterotrophic bacteria and the nitrifying bacteria in the microbial flocs in the three pH groups |
不同pH对微生物絮团沉降比影响较大(图 7a)。3个pH组的FV-5min都呈上升趋势，实验结束时pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5组的FV-5min分别为36%、66%、78%。可以看出，FV-5min值随着pH增大而升高。如图 7b所示，3个pH反应器中微生物絮团的MLSS含量逐渐上升，各组间无显著差异，表明不同pH条件下，微生物絮团的有机物含量差异不明显。pH对微生物絮团FV-5min的影响较明显，pH 6.5组的微生物絮团沉降性能明显优于pH 7.5和pH 8.5组的微生物絮团。
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图 7 不同pH反应器中5分钟絮团体积(FV-5min, a)和混合液悬浮固体浓度(MLSS, b)的变化 Fig. 7 Change of the FV-5min of microbial flocs and mixed liquor suspended solid (MLSS) in different pH reactors |
3个pH组生物絮团的胞外蛋白质、胞外多糖含量变化趋势相同(图 8a和b)，其中pH 6.5组中生物絮团的胞外蛋白质、胞外多糖含量最高，pH 8.5组中生物絮团的胞外蛋白质含量最低。不同pH对絮团胞外多糖含量影响较小(图 8b)。实验期间，各pH组的EPS总有机碳含量基本保持稳定，其中pH 6.5组的EPS总有机碳含量略高于pH 7.5、pH 8.5组，且差异不显著(图 8c)。
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图 8 不同pH处理组中微生物絮团胞外聚合物粗蛋白质含量(a)、多糖含量(b)和总量(c)的变化 Fig. 8 Changes of crude protein (a), polysaccharide (b) of the EPS and the total EPS content of microbial flocs in different pH groups |
由表 2可知：pH 6.5组的灰分含量略低于pH 7.5组和pH 8.5组，但无显著差异；pH 6.5组的微生物絮团粗蛋白含量高于pH 7.5、pH 8.5组。与实验启动时所用高体革
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表 2 不同pH处理组中微生物絮团的粗灰分和粗蛋白含量(平均值±方差) Tab.2 The crude ash and crude protein content of microbial flocs in different pH reactors (Mean± SD) |
本实验研究了不同pH对微生物絮团活性、营养组分及氨氮转化效率的影响。不同pH反应器中亚硝酸盐氮、硝酸盐氮浓度都较低，表明实验期间硝化作用较弱，这符合生物絮团养殖水体中以氨氮异养同化过程为主的特征[31]。絮团主要由细菌等微生物组成，死亡的细菌会被降解而产生氨氮，可能会造成氨氮的再释放[5]。本实验各处理组中均存在总氨氮的明显积累，这可能是因为絮团释放氨氮的速率大于异养细菌同化氨氮的速率。
pH 6.5组的溶解性磷酸盐的去除率最高，这可能是由于pH降低会导致微生物细胞结构和功能破坏，细胞内聚磷在酸性条件下被水解，磷释放；若pH升高，碱性环境下会产生磷酸盐沉淀，使部分磷沉积到了菌胶团表面，不利于磷的去除[22]。从整个实验过程来看，pH为6.5~8.5时，序批式反应器培养的微生物絮团对溶解性磷酸盐去除效果较好，原因可能是间歇式曝气的厌氧和好氧阶段符合聚凝菌厌氧放磷和好氧吸磷的生物特性，有利于聚凝菌充分发挥除磷作用[23]。
图 6表明，絮团总OUR主要来自于异养细菌OUR，表明异养细菌是微生物絮团微生物中的优势菌群。本实验表明微生物絮团的EPS含量与pH关系密切：pH 6.5组的EPS总量、胞外蛋白质含量和胞外多糖含量都高于pH 7.5、pH 8.5组，表明pH为6.5的弱酸性环境更利于微生物絮团中EPS、胞外蛋白、胞外多糖的合成。这与郑蕾等[32]的实验结果EPS浓度及多糖、蛋白质浓度均随pH的增大而升高不一致。可能原因是本研究中提取EPS的样品是反应器中的混合液，而非过滤后的微生物絮团。李延军等[33]研究得出好氧颗粒污泥体系上清液中EPS含量的变化不同于颗粒污泥，酸性条件下EPS含量最大，碱性条件下的EPS含量与中性条件差别不大。研究提取出的EPS含量主要以多糖为主，这与程丽妹等[34]的研究结论相符。
实验结束时3个处理组的微生物絮团粗蛋白含量都显著下降，主要原因是实验期间未向反应器补充氮源。絮团的粗蛋白主要由菌体蛋白组成。菌体死亡后，菌体蛋白中的氮被降解成氨氮，溶解在水中，因此，絮团粗蛋白含量降低，水体中氨氮浓度升高[5, 35]。
不同pH对微生物絮团的灰分含量和粗蛋白含量影响较小。pH 6.5组培养的生物絮团的沉降性能较好、粗蛋白含量最高且有机成分含量较高。这与之前得到的pH 6.5组培养的微生物絮团的总微生物活性、异养细菌活性、硝化细菌活性以及EPS含量都高于pH 7.5、pH 8.5组的结果一致。
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2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China