上海海洋大学学报  2019, Vol. 28 Issue (4): 542-549    PDF    
基于转录组数据的铜藻微卫星标记开发与验证
刘颖1,2, 张鹏1,2, 王铁杆1,2, 张敏1,2, 任鹏1,2, 钟晨辉3, 胡程睿1,2     
1. 浙江省海洋水产养殖研究所, 浙江 温州 325005;
2. 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室, 浙江 温州 325005;
3. 福建省水产研究所, 福建 厦门 361000
摘要:根据铜藻转录组测序数据来进行微卫星标记的发掘,共获得2 800个微卫星位点。二碱基重复出现的次数最多,占32.82%,其次是三碱基重复,占25.21%;在所有重复单元类型中,AC/GT出现频率最高,占9.18%;重复序列的长度则主要集中在12~20 bp,占72.79%;重复次数主要集中在5~10次,占74.14%。随机选取74对引物进行验证,最终获得18个具有多态性的微卫星标记。对31株铜藻个体进行检测和评价,共扩增得到43个等位基因,每个位点平均等位基因数为2.39,平均有效等位基因数为1.91,平均观测杂合度(Ho)为0.318,平均期望杂合度(He)为0.449,平均多态信息含量(PIC)为0.365,在18个位点中有11个显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P < 0.05)。开发的微卫星标记为后续铜藻多样性、起源和迁移等遗传学问题研究提供了有力支撑。
关键词铜藻    转录组    微卫星标记    

铜藻(Sargassum horneri)隶属于褐藻门(Phaeophyta),墨角藻目(Fucales),马尾藻科(Sargassaceae Kuetzing),马尾藻属(Sargassum)[1],属暖温性大型海藻,广泛分布于太平洋西北部[2]。近年来,有关铜藻的研究主要集中在繁殖生物学、增养殖及生态修复等领域,而关于铜藻种群遗传结构和遗传多样性的研究相对较少[3],且相关研究主要集中在线粒体基因、叶绿体基因以及ISSR和SRAP等显性标记技术方面[4-7]。由于线粒体、叶绿体基因的变异水平低于核序列,无法有效检测地理位置或者亲缘关系较近的种群之间的遗传差异[8],而显性分子标记在检测杂合等位基因时存在很大的局限性,故亟需开发适合研究铜藻遗传多样性和种群结构的共显性分子标记。

微卫星(simple sequence repeats, SSR)标记,因其在基因组中含量丰富、分布广泛,多态性高,呈共显性遗传等特点,被广泛用于构建遗传图谱、分析亲缘关系和种群结构等方面[9-10]。有关铜藻微卫星标记开发的研究虽然也有报道[8, 11],但受限于开发手段,目前可供使用的标记相对较少,这在很大程度上限制了微卫星标记在铜藻研究中的应用。近年来,高通量测序技术发展迅速,已被广泛用于微卫星标记的开发[12-14]。因此,采用转录组测序方法开发铜藻的微卫星标记,为铜藻的群体遗传学研究提供更多可用的分子标记。

1 材料与方法 1.1 实验材料及转录组测序

转录组测序所需铜藻样品于2012年4月采自浙江省南麂岛马祖岙(27°28′N, 121°03′E),从中选取1株送至苏州众信生物技术有限公司进行RNA提取和454高通量测序。

SSR扩增所需的铜藻样品为浙江省海洋水产养殖研究所人工养殖铜藻,随机取10株用于检测SSR引物的有效性,另取31株进行SSR遗传多样性的检测和评价。

1.2 微卫星位点的搜索

转录组数据经处理拼接后得到28 608个Unigenes,利用MISA (Microsatellite identification tool)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件在Unigenes中搜索SSR位点,对于非混合型SSR位点,检测标准为:单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基的重复次数不小于10、6、5、5、5、5;间隔小于100 bp的SSR被定义为混合型SSR。

1.3 微卫星引物设计

选取两端侧翼序列不少于50 bp的二至五碱基重复单元的SSR序列,采用Primer Premier 5.0软件设计引物。引物设计的主要参数为:引物长度15~30 bp;退火温度50~60 ℃;PCR产物长度100~320 bp;GC含量40%~60%。从中随机选出74对引物,由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.4 样品DNA的提取

使用“DN14-植物基因组DNA快速提取试剂盒”(北京艾德莱生物科技有限公司,DN1401)按照操作说明提取铜藻基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后,利用全波长酶标仪(Varian 50 Bio UV-Vis Spectrophotometer)测定OD260与OD280以确定DNA的质量与浓度,将DNA浓度调至30 ng/μL,-20 ℃保存备用。

1.5 PCR扩增及多态性位点的筛选

PCR反应体系为20 μL,包括:模板DNA (30 ng/μL) 1 μL,Taq酶(5 U/μL)0.1 μL,10 × PCR buffer(Mg2+plus)2 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/μL each)1.6 μL,引物对(10 μmol/L)各0.4 μL,超纯水14.5 μL。PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,退火温度72 ℃延伸30 s,40个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测引物扩增效果并进行退火温度的优化。采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物进行分析,DuGreen(bridgen)染色,拍照(Bio-Rad Universal Hood Ⅱ),筛选具有多态性的微卫星标记。由生工生物工程(上海)股份有限公司和英潍捷基(上海)贸易有限公司对PCR产物进行测序,通过MEGA 7.0和Clustal X 2.0软件对序列进行比对分析。

1.6 数据分析

将电泳图上清晰的条带按其迁移率的不同,用大写字母A、B、C、……从小到大进行记录。运用Popgene 3.2软件计算微卫星位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He),并进行哈迪-温伯格平衡(hardy-weinberg equilibrium,HWE)检测[15];采用Cervus 3.0.7软件计算各微卫星位点的多态信息含量(polymorphism information content,PIC),按照BOTSTEIN等[16]的标准,当某位点PIC>0.5时,该位点属于高多态性位点。

2 结果与分析 2.1 铜藻转录组中微卫星的分布特征

铜藻转录组测序结果经组装和拼接共得到28 608条Unigenes(总长为10 758 117 bp),从中检索到2 800个SSR位点,分布在2 597条Unigenes中,发生频率为9.08%(含有SSR的Unigenes占总Unigenes的百分比),其中含有1个和含有2个及2个以上SSR的Unigenes分别有2 410条和187条,包含有复合型SSR的Unigenes共244条。SSR的分布率为9.79%(SSR的总个数占总Unigenes的百分比),铜藻转录组中平均每3.84 kb中就有一个SSR位点(表 1)。

在铜藻转录组中出现次数最多的SSR是二碱基重复,约占32.82%;其次是三碱基重复和单碱基重复,各约占25.21%和21.64%;四碱基、五碱基和六碱基重复分别仅占5.79%、4.54%和1.14%,见表 1。1 946个SSR(不计算单碱基的4种类型和复合型SSR)中共包含201种重复单元,二、三、四、五、六碱基重复单元的类型分别有8、30、57、81、25种。在各碱基类型的微卫星中,不同序列组成的SSR数量迥异。二碱基类型中出现频率最高的是AC/GT,有257个,占所有SSR分子的9.18%,GC/GC出现的频率最低,仅3个。三碱基类型中出现频率最高的是CAG/CTG,有143个(5.11%),其次为GCA/TGC(2.46%)和AGC/GCT(2.43%),见表 2

表 1 铜藻转录组中SSR重复单元的分布特征 Tab.1 Distribution of SSR repeat units in Sargassum horneri transcriptome
表 2 铜藻转录组中SSR重复单元的类型 Tab.2 Types of SSR repeat units in Sargassum horneri transcriptome

铜藻转录组中SSR的序列长度从10~309个碱基不等,平均长度为20.98 bp。复合型SSR、单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复的平均长度分别为63.40、11.50、16.12、17.89、23.98、27.76和37.31 bp。重复序列长度范围在12~20 bp的最多,占72.79%,重复长度在21~40 bp的占21.46%,大于40 bp的最少,仅占5.75%(图 1)。SSR重复单元的重复次数在5~38次之间(不计算复合型SSR)。重复次数在5~10次的有2 076个,占SSR总数的74.14%;11~20次的有461个,占总数的16.46%;21~30次和大于30次的分别为13个和2个,占0.46%和0.07%。见图 2

图 1 SSR重复序列长度的分布情况 Fig. 1 Distribution of length of SSR repeat sequences
图 2 SSR重复单元的重复次数分布情况 Fig. 2 Distribution of repetitions of SSR repeat unit
2.2 微卫星标记位点的开发

根据转录组测序结果,从两端各具有50 bp侧翼序列的微卫星位点中,随机设计出74对引物,对10株铜藻样本进行PCR扩增,经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,筛选出18个具有多态性的SSR位点,其中,5个为二核苷酸重复型,7个为三核苷酸重复型,6个为五核苷酸重复型,详见表 3。PCR产物经测序后与目的片段比对分析,确定扩增产物均含有目的序列(图 3)。

表 3 18个铜藻微卫星位点概要 Tab.3 Summary of 18 SSR loci in Sargassum horneri
T-SSR49表示目的序列;PCR-SSR49表示PCR扩增产物;“*”表示该列碱基相同 T-SSR49 means target sequences; PCR-SSR49 means PCR amplification products; "*" indicates positions which have fully conserved base 图 3 ShSSR49位点的PCR扩增产物与目的序列比对图 Fig. 3 Comparison of PCR amplification products and target sequences of ShSSR49
2.3 微卫星标记多态性的检测和评价

用18对引物对31株铜藻样本进行多态性检测(图 4),18对引物共扩增得到43个等位基因:每个位点的等位基因数(Na)为2~4不等,平均2.39个;有效等位基因数(Ne)为1.10~3.25,平均1.91个;观测杂合度(Ho)为0.032~0.710,均值为0.318;期望杂合度(He)为0.094~0.704,均值为0.449;多态信息含量(PIC)为0.088~0.641,平均0.365,其中,高多态性位点(PIC>0.5)2个,中多态性位点(0.25<PIC<0.5)13个,低多态位点(PIC<0.25)3个。经检测,有11个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。见表 4

8%聚丙烯凝胶电泳; M:TaKaRa 50 bp DNA Ladder 8% PAGE, M; TaKaRa 50 bp DNA Ladder 图 4 ShSSR8、ShSSR62位点在31株铜藻样品中的扩增情况 Fig. 4 Sequence bands of SSR loci ShSSR8 and ShSSR62
表 4 铜藻的18个多态性位点的遗传多样性信息 Tab.4 Characteristics of 18 SSR loci in Sargassum horneri
3 讨论 3.1 转录组测序技术在开发微卫星标记中的应用

微卫星标记以其含量丰富、多态性高、在基因组中均匀分布以及呈共显性遗传等特性成为基因组研究的理想标记类型[9]。虽然新一代分子标记SNP、Indel等的出现使其关注度有所降低,但是,在所有的标记类型中,微卫星标记的杂合度最高,是信息含量最高的遗传标记,这个特性使其成为个体认证中使用的唯一标记系统,以及其他许多方面应用的必选标记[9, 17]。传统的微卫星标记开发方法需要构建小片段微卫星富集文库[18-21],整个过程繁琐且耗时长、成本高。近年来,利用转录组测序数据来开发水产生物微卫星标记的相关研究和报道越来越多[22-24],这在很大程度上提高了微卫星标记开发的效率。目前,有关铜藻微卫星的研究工作还处于起步阶段,SHAN等[11]和KUBO等[8]通过构建微卫星富集文库分别筛选出了8对和10对微卫星标记用于铜藻遗传学研究,本文则首次报道了利用转录组数据开发铜藻的微卫星标记,筛选出了18对具有多态性的微卫星标记,这些标记将被用于后续的铜藻群体遗传学分析。

3.2 基于铜藻转录组测序的微卫星标记特征

通常,大多数SSR存在于基因组DNA中,转录组中只有少量的SSR存在,一些研究表明在植物EST序列中,SSR位点所占的比例为7%~10%[24]。在铜藻转录组的28 608条Unigenes中发现2 597条中含有2 800个SSR位点,分布率为9.79%,与植物EST序列中的情况相似。铜藻转录组中平均每3.8 kb中就有1个SSR位点,海带(Saccharina japonica)每4.6 kb[24]而坛紫菜(Pyropia haitanensis)每5.8 kb [22]才有1个SSR位点,因此铜藻的SSR分布比海带和坛紫菜都密。其中:二碱基重复数量最多,约占32.82%,AC/GT是出现频率最多的类型,其次是三碱基重复25.21%;四碱基、五碱基和六碱基重复相对较少。这与同属褐藻门的瓦氏马尾藻(Sargassum vachellianum)[25]的微卫星情况相近,但是在大型海藻中,多数研究显示三碱基序列是最主要的重复单元,如海带[24]、条斑紫菜(Porphyra yezoensis)[26]、坛紫菜[22]和裙带菜(Undaria pinnatifida)[27]。这些差异可能由SSR在藻类中的物种特异性引起,也可能是受基因组结构组成、数据库大小、数据分析工具和SSR筛选参数设计等影响[28-29]

铜藻转录组SSR的重复次数主要集中在5~10次(74.14%),因此SSR的长度较短, 12~20 bp之间的最多(72.79%),与条斑紫菜[30]和龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)[31]中的研究结果相符。SIA等[32]认为具有较大重复次数和长度的SSR位点通常表现出较高的突变率,所以重复次数较少的铜藻转录组SSR可能表现出较低的多样性[31]

3.3 本研究中铜藻群体的种群遗传学特征

群体的遗传多样性主要表现在等位基因数、杂合度和多态信息含量等3个方面[33]。有效等位基因数反映了同一位点等位基因之间的相互作用。本研究所获得铜藻平均等位基因数为2.39,小于野生铜藻群体的3.5~13.5(SHAN等[11]和KUBO等[8]),但是大于瓦氏马尾藻的2.1[34],说明铜藻的养殖群体存在等位基因缺失现象,推测是因为人工选择育种、近交等因素丢失了某些遗传多样性[35]。另外,不同的检测方法可能也是造成等位基因数差异的原因之一。杂合度又被称为基因多样度,是群体杂合程度的度量单位,平均杂合度越高,群体的遗传一致性就越低,其遗传多样性就越高[35]。本研究得到的铜藻群体的观测杂合度和期望杂合度分别为0.318和0.449,低于KUBO等[8]在野生铜藻群体中测得的Ho(0.508)和He(0.616),说明铜藻养殖群体的遗传多样性较低。

多态信息含量(PIC)被认为是衡量变异程度的指标:当PIC>0.5时,该位点具有较高多态性;当PIC<0.25时,该位点表现为低多态性[35]。本实验共获得18个具有多态性的微卫星位点,包括2个高多态性位点(PIC>0.5)、13个中多态性位点(0.5>PIC>0.25)和3个低多态位点(PIC<0.25),表明铜藻养殖群体的遗传多态性处于中度多态性水平,其中ShSSR13和ShSSR41这两个高多态性位点可以提供较多的遗传信息。18个位点中有11个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05),该现象可能是由于在不同个体中存在SNP、Indel等变异,其中的等位基因无法扩增出来,产生无效等位基因而造成[23]

综上所述,从转录组测序数据中筛选铜藻微卫星标记是一种高效可行的方法,研究结果增加了铜藻可用的微卫星标记,对于铜藻的种群结构和遗传多样性研究具有重要意义。后续将继续发掘和公布更多的多态性SSR引物,并对我国沿海主要铜藻种群和漂浮铜藻进行相关的分析和研究。

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Development and verification of SSR based on transcriptome of Sargassum horneri
LIU Ying1,2, ZHANG Peng1,2, WANG Tiegan1,2, ZHANG Min1,2, REN Peng1,2, ZHONG Chenhui3, HU Chengrui1,2     
1. Zhejiang Mariculture Research Institute, Wenzhou 325005, Zhejiang, China;
2. Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-resource, Wenzhou 325005, Zhejiang, China;
3. Fisheries Research Institute of Fujian Province, Xiamen 361000, Fujian, China
Abstract: SSRs were developed and characterized by using transcriptome data. A total of 2800 SSR loci were identified and dinucleotides were the most frequent (32.82%), followed by trinucleotides (25.21%). AC/GT was the most abundant unit (9.18%). The length of repetitive sequences was mainly concentrated between 12-20 bp (72.79%), and 5-10 repeats being the most abundant number (74.14%). 74 pairs of primers were randomly selected for detection, and 18 polymorphic SSRs were obtained finally. The characteristics of these microsatellites were determined in 31 individuals of S. horneri. A total of 43 alleles were detected, the allele number per locus ranged from 2 to 4 (average 2.39), and mean effective allele number was 1.91, and mean observed and expected heterozygosity were 0.318 and 0.449, respectively. The average of polymorphism information content (PIC) was 0.365, and 11 loci deviated significantly from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P < 0.05). These obtained SSR markers will be helpful for the genetic studies in S. horneri.
Key words: Sargassum horneri     transcriptome     SSR