2019,
Vol. 28
2. 水域环境生态上海高校工程研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306
随着人口数量及生活质量的提高，海产品的需求日益增加，海水养殖产业迅速发展。然而滨海海水养殖水体负载量增大，水质恶化等问题也随之而来。养殖废水中的溶解态营养盐如不经处理直接排入海中，将会导致水质恶化，造成滨海水域富营养化，破坏水体生态平衡，对海洋生态环境有严重威胁[1]。现今，常规物理、化学和生物处理方法能够处理滨海养殖废水，但均存在一定不足。物理、化学方法快速有效，如投放吸附剂、设置拦截过滤，但易造成二次污染且效果持久性差[2]；生物方法则由于水量大[3]，见效慢和盐度的影响而很难提高效果[4]。人工湿地(constructed wetlands, CWs)由于其低成本、高效率、生态化等优点已被广泛应用于多类水体净化[5]。CWs的作用机制为物理、化学和生物三重协同作用，其中生物作用占主导地位，伴随着过滤、拦截及离子吸附。人工湿地处理含盐水体的研究较少且效果不佳，主要的原因仍是高浓度盐离子的胁迫对其生物机制的发挥受阻，但CWs所具备功能能够克服常规滨海养殖水处理方法的瓶颈(如无二次污染、CWs的自我恢复功能可有效提高其去污持久性)，在接种驯化CWs中耐盐微生物的前提下，可实现氮、磷、有机物等多种污染物的同步净化[6]。因此，本文将利用人工湿地对滨海养殖水体进行处理净化，优化运行参数，提高处理效果，阐述净化原理。验证人工湿地处理滨海养殖水体的可能性，并为今后人工湿地处理滨海养殖水工艺实施提供一定理论支持。
1 材料与方法 1.1 人工湿地装置构建本实验采用小试人工湿地(图 1)，装置构建依据《人工湿地污水处理工程技术规范(HJ 2005—2010)》。装置为60 cm×50 cm×40 cm的PVC材质实验箱，在实验箱底部设置取水口，以粒径2~4 mm的石英砂作为填充介质，大粒径在下层，小粒径在上层，层高为25 cm石英砂表面种植幼苗期的美人蕉(株高10~15 cm)，种植密度为20株/m2。装置启动期间，将实际滨海养殖业所排放的水加入到装置中，进行接种驯化，该稳定期为1个月(启动期间使用模拟污水进水，并按照所设计的运行参数保证装置正常运行，同时检测出水水质指标。当出水水质变化趋于稳定后，则认为装置内微生物已富集，实验装置运行状态正常)。
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图 1 人工湿地小试实验装置图 Fig. 1 Diagram of pilot CWs |
本实验于上海松江某生态农场进行，开展季节为春夏季(2017年3月至6月)，主要环境参数为：气温10~18 ℃、相对湿度65%~80%、光照强度7 000~10 000 lx、平均光合有效辐射25~30 μmol/(m2 s)。
本实验主要分为2个阶段，阶段1：人工湿地处理滨海养殖水效果研究；阶段2：不同梯度盐度对人工湿地净化滨海养殖水研究。每阶段模拟养殖水水质见表 1。
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表 1 实验各阶段进水水质 Tab.1 Inflow water quality in whole experiment |
阶段1实验期间，每组设置6个小试装置，采取间歇式进水，并根据装置启动期出水水质变化情况，设定水力停留时间(HRT)分别为1、2、3 d。设置两个对照装置(CK1和CK2)、一个实验组(CW1)，确定最佳养殖水净化效果及运行参数。
阶段2实验则在阶段一基础上，以最佳运行参数为准，每组设置4个小试装置(CW-0、CW-0.5、CW-1、CW-2)，对应4个盐度梯度(0 %、0.5%、1%、2%，氯化钠配置)。每个阶段实验均设置一个平行装置，且每阶段实验需重复3次以便后续数据处理。
1.3 测试方法与试剂实验期间，环境指标及测试所需仪器：气温、相对湿度(空气质量快速测定仪，2927622，绿驰，中国)、光照密度(光照密度测定仪，ALP-01，群智，中国)、平均光合有效辐射(多通道光合有效辐射测定仪，3051E，福禄克，美国)。
水样采集后即刻测试理化指标，随后使用0.22 μm水系玻璃纤维滤膜过滤后，进行水质指标的测试。待实验期结束后，于CWs底部采集10 g石英砂基质材料，使用DNA提取盒提取石英砂表层附着的DNA，并进行扩增后，保存于-20 ℃冷冻冰箱，待用。本实验主要测试指标及方法如下。
测试的理化指标为pH(玻璃复合电极法，HI 9143，哈纳，意大利)、温度(温度计)、DO(荧光法，HI 9143，哈纳，意大利)、盐度(盐度计)。
测试的水质指标为氨氮NH3-N(纳氏试剂法，DR900，尤尼科，美国)、硝态氮NO3--N(紫外分光光度法，UV-2800，尤尼科，美国)、亚硝态氮NO2--N(气相分子吸收光谱法，GMA3202，北裕，中国)、COD(重铬酸钾分光光度法，HH6，江分，中国)。
测试的生物指标为硝化/反硝化细菌数量(最大可能数法[7])、硝化/反硝化势[7]、BIOLOG微生物群落功能多样性(BIOLOG-ECO板，哈希，美国)。
实验过程中均设置平行装置、采集平行水样和重复实验以降低人为和测试方法所造成的误差。
葡萄糖、硝酸钠、氯化铵、氯化钠、硫酸镁、氯化钾、氯化钙等主要试剂购自上海国药。模拟养殖水水质参考海水水质标准GB 3097—1997、地表水环境质量标准GB 11607—1989和水产养殖废水排放要求(DB 33/453—2006)。
1.4 数据分析与绘图微生物总体代谢活性指标[8]：将单孔在590 nm和750nm的吸光度值分别减去对照孔的吸光度值，再用新得到的每个对应孔590 nm的吸光度值减去750 nm的吸光度值(C590-C750)，得到单孔实际颜色的吸光度值，其中数值小于0.06时按0处理。单孔颜色平均值(average well color development, AWCD)数值如公式(1)所述。
(1)
式中:DAWC表示单孔颜色平均值；31表示Biolog-Eco板上供试碳源的种类数；C为吸光度值。
本研究使用SPSS 21、Excel 2013、Origin 9.0对所得数据进行绘图与分析。
2 结果与讨论 2.1 不同浓度进水对人工湿地净化滨海养殖水的效果及影响实验期间，进水水温为15~ 18 ℃，进水pH为6.81~7.12，溶解氧(dissolved oxygen, DO)含量为7.21~7.53 mg/L。经过3 d的水力停留时间(hydraulic retention time, HRT=1、2、3)的取样，出水水温为14 ~ 18 ℃，出水pH为6.52~6.88，DO含量为1.52~2.27 mg/L，同时对不同浓度进水中氨氮、硝氮、COD和盐度的去除情况进行了分析，结果见图 2。
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图中表示去除率显著性比较(n=3)，其中，同一系列柱状图间第一个字母表示高浓度条件下该系列所对应装置去除率的显著性差异；第二个字母表示低浓度条件下该系列所对应装置去除率的显著性差异；第三个字母表示不同HRT下该系列所对应装置去除率显著性差异(P < 0.05) Results of significant difference test (n=3), the first letter in the same column means the significant difference result of removal efficiency with high concentration among different CWs; the second letter in the same column means the significant difference result of removal efficiency with low concentration among different CWs, the third letter in the same column means the significant difference result of removal efficiency among the different CWs at different HRTs (P < 0.05) 图 2 高/低浓度进水人工湿地处理滨海养殖水效果 Fig. 2 Efficiencies of coastal aquaculture water purification by CWs with high/low contaminants in influent |
由图 2可知，随着水力停留时间的增加，CWs装置对污染物的去除呈上升趋势。实验初期(HRT=1)，盐度对污染物的去除影响较明显，但随着时间的增加(大于2 d)，通过CWs基质的吸附作用，水体中盐度逐渐降低，伴随着微生物对盐胁迫适应性提高，污染物去除效果略有回升[9]。
针对不同浓度有机物和氮污染物进水，高浓度进水(COD 30 mg/L，NH3-N 1 mg/L，)的CW装置和CK2装置均有较高去除效果，CWs是具有一定承载负荷的生态水处理系统，虽然高浓度进水去除效果较好，但与低浓度进水(COD 15 mg/L，NH3-N 0.5 mg/L)的污染物去除效果相比，出水的氨氮却略高[可达Ⅲ类水标准，地表水环境质量标准(GB 3838—2002)]。张青松等[10]通过利用生态制剂净化高氨氮浓度养虾池养殖水也得到类似研究结果，即硝态氮、氨氮去除效果佳，但氨氮出水浓度仍略高。
针对不同类型氮化合物，氨氮的去除效果较好，在CWs中氨氮的去除主要依靠硝化作用，利用硝化自养好氧菌将氨氮转化为亚硝氮/硝氮；然后在反硝化异养厌氧菌的作用下，以碳源为电子供体，通过反硝化过程完成脱氮[11]。实验初期，由于系统中并无亚硝氮/硝氮，随着氨氮的转化，硝态氮初期存在积累，随着时间的变化，硝态氮去除率明显提高，并伴随着COD去除的增加，可知硝态氮与COD的去除过程是同步的[12]。
CW装置与对照CK2相比，实验初期差别较为明显，可知盐度对CWs内微生物作用冲击较大，污染物去除效果不佳(图 2a-c)，随着时间的增加(至少2 d)，微生物的适应性逐渐提高，CWs的生物去除机制得到一定发挥，造成这种结果的原因可能是滨海养殖水盐度含量与海水相比较低，对微生物细胞的破坏和抑制作用不明显[13]。
2.2 不同浓度盐度对人工湿地净化滨海养殖水的效果及影响由于盐度对CWs微生物污染物去除效果影响明显，本研究设置不同浓度盐度实验，了解盐胁迫下CWs对各污染物的去除情况，结果如图 3所示。
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字母表示不同装置对不同污染物去除率的显著性差异(n=3)(P < 0.05) Results of significant difference test (n=3), the letter in the same column means the significant difference result of removal efficiency in different CWs treatments (P < 0.05) 图 3 人工湿地对不同盐度滨海养殖水净化效果 Fig. 3 Efficiencies of coastal aquaculture water purification by CWs at different salinity in influent |
由图 3可知：当盐离子浓度低于2%时，人工湿地的污染物去除效果较好，且低浓度盐离子对微生物的胁迫基本可以消除(CW-0与CW-0.5去除效果差异不明显)，当盐度为2%时，装置经一定适应期(本研究为3 d后)也能得到较好的污染物去除效果(特别是COD和NH3-N)。在本研究中，CWs的最佳去除效果是在1 %盐胁迫得到的，甚至要高于无盐胁迫的对照组。在一般情况下，人工湿地去除有机物和氮的主要途径为硝化-反硝化，通过自养好氧硝化菌将氨氮转化为硝态氮；在碳源提供电子供体的前提下，异养好氧的反硝化菌将硝态氮转化为气态氮，实现脱氮[6]。根据上述实验结果分析可知，在盐胁迫下人工湿地中的硝化/反硝化细菌等微生物能通过体内渗透调节等活动而增加自身对外界盐度的耐受能力[14]。当盐度为1%时，CW-1去除效果好于空白CW，原因可能是装置内非功能性菌种在盐胁迫下生物量和活性受到抑制。这一情况将有利于优化CW的群落结构，更有利于脱氮。人工湿地的基质填料可吸附一定的盐离子，也可以为微生物提供栖息的载体，缓解微生物在盐度抑制下凝聚性下降的问题[15]。
为了确定不同盐度影响下，CWs装置微生物的具体情况，硝化/反硝化细菌数量及硝化/反硝化势情况如表 1所示。
硝化/反硝化细菌数量可以表示实验装置中能够进行硝化-反硝化微生物的生物量，在理想状态下，可反映系统硝化-反硝化能力。但在实际处理过程中，为了消除环境及其他微生物菌种的影响，利用硝化/反硝化细菌数量辅助硝化/反硝化势说明系统的脱氮能力更具有说服力。从表 2可知系统中硝化细菌的数量较多且硝化势较高，硝化反应较强，这可能与进水水质有直接关系，进水中含有NH3-N，在装置稳定期间至实验期，硝化细菌得到了较好的富集。设置不同浓度的盐胁迫条件，根据硝化/反硝化菌数量和硝化/反硝化势结果，可知当进水中盐浓度为1%时，硝化-反硝化作用明显。低于该浓度时，硝化细菌首先受到抑制而生物量减少，随着浓度的逐渐增加，硝化细菌逐渐恢复生物量和硝化能力，但超过1 %浓度盐胁迫后生物量和硝化能力又受到抑制，这可能是由于装置稳定期间所富集的硝化细菌来源于滨海养殖海水，对不同浓度盐胁迫虽有抑制，但也能自我恢复和适应[16]，但与其他淡水水生态处理装置的硝化菌生物量[8]相比，硝化细菌的富集量仍不佳。而对于反硝化细菌，随着盐胁迫浓度的增加并未出现硝化细菌的“S”型生长变化，而是服从对数生长变化，但反硝化细菌富集情况较差，可能与装置内硝态氮含量和COD含量较低有关[17]。
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表 2 人工湿地硝化/反硝化细菌数量和硝化/反硝化势情况 Tab.2 Condition of nitrification/denitrification bacteria content and the nitrification/denitrification potential in CWs in stage 2 |
为了进一步确定CWs装置内反硝化微生物对不同浓度盐度的响应情况，利用BIOLOG-ECO板测试反硝化区的微生物总体代谢活性结果如图 4所示。BIOLOG-ECO微平板上共有31种不同碳源，利用AWCD值表征微生物群落整体代谢活性，当AWCD值越大，表面填料中微生物整体代谢能力越强，活性越高[18]。不同装置填料中微生物AWCD随时间的增加逐渐升高，这表明微生物对碳源的利用能力随着时间的延长而提高。盐度对微生物代谢能力的影响较为明显，当低浓度(0.5%)盐胁迫时微生物活性与空白对照相比略差，当高浓度(2 %)盐胁迫则对微生物的抑制作用较大，而当盐胁迫浓度为1 %时，微生物总代谢能力最佳。这说明在适宜的盐浓度影响下，微生物具有一定的耐受能力并能有效发挥其去除污染物的功能[19]。
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图 4 不同人工湿地微生物群落代谢活性 Fig. 4 AWCD in CWs in stage 2 |
BIOLOG-ECO微平板上的31种碳源底物分为六类(C1-糖类; C2-氨基酸类; C3-多聚物类; C4-酚酸类; C5-胺类; C6-羧酸类)，选取72 h BIOLOG-ECO微平板不同CW碳源利用程度(图 5)进行分析，可知:CW-2对各类碳源利用程度均较低，这说明该盐浓度胁迫下微生物的代谢能力较差；CW-0.5对各类碳源的利用程度好于CW-2，但明显低于CW-0和CW-1。CW-1装置内的微生物, 在适宜盐浓度胁迫下，不仅可以将C1作为碳源，同时也可以利用C2和C5来保证生长繁殖，这将更利于系统中微生物种群的优化和含氮污染物的去除[20]。
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图中表示平均吸光度显著性比较(n=3)，其中，第一个字母表示某一类型碳源不同装置的显著性差异；第二次字母表示同一装置不同类型碳源的显著性差异(P < 0.05) Results of significant difference test (n=3), the first letter in the same column means the significant difference result of each carbon source utilization in different CWs treatments; the second letter in the same column means the significant difference result of carbon source utilization in each CWs treatment (P < 0.05) 图 5 不同人工湿地微生物碳源利用情况 Fig. 5 Carbon utilization profile of microbial on BIOLOG ECO planet 72 h in stage 2 |
为了进一步研究不同盐浓度胁迫下微生物群落功能多样性的情况，对微生物碳源利用进行主成分分析(图 6)可知, 第一主成分和第二主成分可解释总方差的68.11%和27.15%，两个主成分累积方差贡献率达90%以上，基本能够反映微生物群落的生理轮廓，其中第一主成分是变异的主要来源。微生物对6种碳源的利用能力中，C1、C2、C5与第一主成分呈正相关，且相关性较近，这有可能是因为第一主成分是碳源；而CW-0.5和CW-2与第二主成分呈正相关，推测第二主成分可能是盐浓度。CW-0和CW-1均与第一/第二主成分呈正相关，CW-1装置中的微生物虽受到盐的胁迫，但其微生物对碳源的利用情况几乎与未受盐胁迫的装置相近。这说明与CW-2和CW-0.5相比，CW-1中的微生物更具有盐耐受能力，结合装置污染物的去除效果(COD和NH3-N分别为93.3 %和77.12 %)可确定当盐浓度为1 %时，CW装置可克服盐胁迫并保持较好的脱氮效果。
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C1.糖类; C2.氨基酸类; C3.多聚物类; C4.酚酸类; C5.胺类；C6.羧酸类 C1. glucose and its ramification; C2. amino acids; C3. polymer; C4. phenolic acids; C5. amines; C6. carboxylic acids 图 6 人工湿地内微生物碳源利用主成分分析 Fig. 6 PCA of the rate of AWCD over the microbe carbon utilization at 72 h in CWs in stage 2 |
采用人工湿地小试装置开展户外实验，设定不同盐胁迫浓度对高/低滨海养殖水进行处理。各装置运行状况良好，对滨海养殖水净化效果显著，出水可达地表水环境质量标准(GB 3838—2002) Ⅲ类水标准；当进水盐胁迫浓度为1 %时，人工湿地对各污染物的去除效果较高，COD和NH3-N分别为93.3 %和77.12 %；硝化/反硝化细菌对盐度有一定耐受和恢复能力，最佳盐耐受浓度为1 %；当水体中含有一定盐度时，微生物对碳源的利用类型趋于多样化。今后的研究将针对进一步提高人工湿地微生物耐受性、结合其他具有脱盐功能的水处理工艺为研究方向，进一步提高人工湿地在滨海养殖尾水的处理效果。
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2. Engineering Research Center for Water Environment Ecology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China