2. 上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
随着集约化水产养殖的规模不断扩大,水产养殖带来的环境压力也越来越大,因此需要一种可持续健康养殖技术替代传统换水养殖技术,生物絮凝技术(biofloc technology, BFT)是一种健康可持续的脱氮技术,不仅可以净化水质还可以给养殖对象提供饵料[1]。生物絮凝技术应用于工厂化养殖为主,工厂化生物絮凝养殖大多为避光型菌相系统,分为以异养细菌为主的异养型生物絮凝系统和以硝化细菌为主的硝化型生物絮凝系统[2-3]。透光温棚和生物絮凝技术相结合的阳光工厂化生物絮凝养殖,即阳光型生物絮凝养殖系统是一种藻菌共生的养殖模式,不仅在白天节约了曝气充氧成本,微藻的生长也给养殖对象提供了更加丰富的饵料[4]。因此,阳光型生物絮凝养殖需要构建一个稳定的菌藻共生系统。为了研究出最佳的人工调控手段来维持一个稳定的菌藻共生系统,需了解此养殖模式下微食物环中各个环节之间的关系。
本文运用实验生态学的方法,以阳光型生物絮凝养殖前期水为实验材料,分别探究去细菌捕食者(原生动物等)、带虾序批添加葡萄糖和一次性添加葡萄糖对养殖水微食物环中细菌及浮游生物的影响,这也对应着下行效应、上行下行双重效应和上行效应对此养殖水环境的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用水和实验用虾都取自上海市崇明县某凡纳滨对虾养殖场的生物絮凝跑道式养殖池,该池放养密度为200尾/m3,养殖第15天,用40目网筛去除杂质和大型捕食者后作为最终实验用水。该生物絮凝跑道式养殖池理化指标和浮游生物分析列于表 1。该养殖池共检测到浮游动物6种(轮虫2种,原生动物2种,枝角类1种,桡足类1种),浮游植物3门11属11种。葡萄糖选自该场养殖生产上所用的食品级一水葡萄糖(西王药业有限公司邹平分公司,山东滨州),有机碳含量为33.6%。放线菌酮(Cycloheximide, C15H23NO4)纯度≥95%,且有抑制真核生物生长的作用,对细菌无明显抑制作用。
实验采用12个1 000 mL的锥形瓶,分别装入900 mL实验用水。实验设有3个实验组(AC组、GS组、G组)和1个对照组,各3个平行。其中:AC组加入50 mg/L放线菌酮(Actidione)杀死真核生物,包括细菌捕食者、部分微藻等;GS组分别放入3只2 cm左右的凡纳滨对虾(Shrimp),并模拟取水养殖场生产上的碳源添加量,从0 h起每24 h添加1.68 mg·C/L的葡萄糖(Glucose);G组分别一次性添加8.4 mg·C/L的葡萄糖,是GS实验过程中序批添加量的总和,且G组一次性添加量仍在碳氮比的理论添加值内;对照组不做任何处理。将所有锥形瓶放入全自动恒温摇床(New Brunswick Innova 43,eppendorf公司,美国)。摇床顶部均匀放置6个LED光源模组(36 W,子弹头电器有限公司,中山)提供实验光照,光暗比是12 h:12 h,补充光照强度(定时器设定为每天7:00开灯,晚19:00关灯)。摇床设置温度28 ℃,转速180 r/min。
1.3 实验方法实验周期共120 h,实验前48 h每12 h取样1次,实验后72 h每24 h取样1次,具体取样时间见表 2。浮游生物的取样时间为第1天19点、第3天19点、第6天19点。
水样经0.45 μm混合纤维微孔滤膜(上海兴亚)抽滤后,测定溶解性有机碳(dissolved organic carbon, DOC)、溶解性有机氮(dissolved total nitrogen, DTN)、磷酸盐(phosphate, PO43+)、叶绿素a(chlorophyl-a, Chl.a)[5-6]。DOC采用专用分析仪(型号Multi N/C 2100,德国耶拿)测定,DTN测定采用碱性过硫酸钾消解分光光度法,PO43+测定采用钼锑抗分光光度法,Chl.a采用丙酮分光光度法。
1.3.2 细菌计数方法细菌计数采用AODC法,先取1 mL水样用0.9%生理盐水分别稀释10倍、100倍、1 000倍,再取稀释好的1 mL经0.2 μm聚碳酸酯滤膜(φ25 mm,Nuclepore公司)过滤后,将滤膜用1 g/L吖啶橙溶液(经0.2 μm无菌滤器过滤)染色5 min,制成切片后直接在落射荧光显微镜(BX50,日本奥林巴斯)计数[7-8]。水样细菌总数按下列公式计算:
式中7样品中细菌含量,个/mL;x为各计数视野细菌总数的平均值,个;S1为滤膜的有效面积,mm2;S2为显微镜油镜视野面积,mm2;V为取样体积,mL;T为稀释倍数。
1.3.3 浮游生物计数和鉴定方法浮游植物:取10 mL水样直接经鲁哥氏碘液和4%的甲醛固定,用倒置显微镜法(即Utermöhl计数法),选择10 mL沉淀杯,静置沉淀3 h,通过静置沉淀浓缩后,移去沉降管及上清液,将浓缩在计数框底座载玻片上的浮游植物在倒置显微镜下进行计数[9],种类鉴定参照《中国淡水藻类:系统、分类及生态》[10]。浮游动物:取10 mL水样直接用4%甲醛固定,轮虫与原生动物计数方法同浮游植物,种类鉴定参照《中国淡水生物图谱》[11]和《中国动物志》[12];枝角类和桡足类不进行计数和鉴定。浮游生物密度计算公式:
式中:N为水样的浮游植物或浮游动物密度,个/mL;V为沉降水样的体积,mL;D为载玻片直径,mm;d为计数镜头直径,mm;n为计数镜头数, 个;C为计数个体数,个。浮游植物、原生动物和轮虫生物量按体积法统计[13-14]。
1.3.4 数据分析方法使用SPSS 17.0软件对相关结果进行分析,采用单因素方差分析(One-way ANOVA),并对各样本平均数进行Duncan氏多重比较,显著水平取P<0.05。
2 结果 2.1 细菌总数和叶绿素a的变化由图 1a可知,实验过程中对照组和实验组细菌总数都大于5×105个/mL。其中:对照组细菌总数呈先减少后增多的变化趋势,且在第36小时降到最低,第60小时后趋于稳定,总体细菌总数保持稳定;3个实验组细菌总数呈波动变化且变化趋势基本一致。AC组的细菌总数峰值最高,反映了去除细菌捕食者和部分微藻之后,降低了对细菌的捕食压力和藻菌的竞争压力;第72小时后,AC组和GS组的细菌总数都低于G组和对照组,可能和下行效应有关,因为AC组是去细菌捕食者(浮游动物等),GS组是添加了大型捕食者(凡纳滨对虾),浮游动物被杀死或被捕食对细菌下行压力的减少会使细菌总数在前期偏高,而后期(72 h后)偏低有可能与微食物环的稳定性有关。
由图 1b可知,在实验末期GS组的叶绿素a含量显著高于其他实验组和对照组(P<0.05),而AC组、G组和对照组无显著性差异(P>0.05),说明了牧食链的大型捕食者对于微藻生长有明显的促进作用;G组的叶绿素a含量变化趋势与对照组基本一致,说明葡萄糖的添加对于微藻无明显影响;第36小时后,AC组和GS组的叶绿素a含量都高于G组和对照组,可能与微藻直接被捕食压力降低有关,这也和72 h后细菌总数的变化趋势一同体现了菌藻竞争机制。总体上,各组叶绿素a含量前48 h变化幅度较小,48 h后变化幅度较大,这可能与水中营养盐变化有关。
2.2 浮游植物和浮游动物生物量的变化由图 2a可知,各实验组与对照组相比,只有GS组在第120小时总浮游植物生物量显著高于对照组(P<0.05),这和图 1b的叶绿素a含量变化相符合。对照组的总浮游植物生物量先升高后降低,而细菌总数先降低后升高,这可能和菌藻竞争关系有关。AC组和GS组的总浮游植物生物量都呈升高趋势,说明微藻直接被捕食压力的降低有利于微藻的生长,而GS组总浮游植物生物量在第120小时最高可能是因为大型捕食者排泄溶解性有机物(dissolved organic matter, DOM)提供了微藻生长所需要的营养盐元素。G组的总浮游植物生物量呈下降趋势且在48~120 h期间下降幅度较大,总体上这也和G组的细菌总数变化呈负相关。
由图 2b可知,在第48小时,AC组的轮虫生物量分别显著低于对照组的轮虫生物量(P<0.05),由此可见放线菌酮抑制轮虫生长效果显著。G组轮虫生物量的变化趋势相似于对照组,且数量上无显著性差异(P>0.05),说明一次性添加葡萄糖对于轮虫生物量影响不显著。GS组轮虫生物量在48~120 h期间增长迅速,且在第120小时极显著高于对照组和其他实验组(P<0.01),与同样添加葡萄糖的G组比较可见,凡纳滨对虾的添加对于轮虫的生长有促进作用。
由图 2c可知,实验过程中各实验组的原生动物生物量与对照组无显著性差异(P>0.05)。实验组和对照组原生动物生物量的变化趋势总体上都呈升高趋势,但从数量关系上看,AC组和GS组在实验开始后的原生动物生物量略低于对照组和G组,只是无显著性差异(P>0.05),所以放线菌酮对原生动物生长有抑制作用但不明显,南美白对虾作为大型捕食者的捕食压力对原生动物生物量也有抑制作用但不明显。
2.3 水质变化由图 3可知,除AC组外,GS组、G组和对照组DOC、DTN、PO43-浓度变化趋势基本一致。AC组、GS组、G组和对照组的溶解性有机碳浓度变化范围分别为57~63 mg/L、25~31 mg/L、27~33 mg/L和20~35 mg/L(图 3a),由此可见AC组的溶解性有机碳浓度始终高于对照组和其他实验组,这和放线菌酮杀死部分细菌捕食者(浮游动物)和部分微藻从而释放溶解性有机碳有关。同样,由图 3b可知,AC组的溶解性总氮浓度在实验过程中总体上高于对照组和实验组(AC组3~6 mg/L、GS组1.0~1.5 mg/L、G组1.0~3.4 mg/L、对照组1.2~5 mg/L),这也和放线菌酮的作用有关。由图 3c可知,实验组和对照组的磷酸盐浓度总体上呈下降趋势,为微藻生长提供了必要的营养盐。
3 讨论目前,基于生物絮凝技术的水产养殖模式主要以有机碳源为原料进行人工操控来影响养殖水体中的同化反应和硝化反应,从而达到净化水质的目的[15]。本文中GS组和G组添加葡萄糖就是通过上行效应进行有机碳源人工操控,AC组添加放线菌酮、GS组添加大型捕食者凡纳滨对虾就是抑制浮游动物生长通过下行效应来进行生物操纵。
碳、氮、磷都是影响细菌与微藻生长的关键营养元素,对于异养细菌的生长来说,溶解性有机物尤其重要[16],葡萄糖作为优质的溶解性有机碳源通过上行效应对细菌生长起到很好的促进作用,从而影响整个微食物环。
G组一次性添加的葡萄糖量相当于GS组序批式添加的葡萄糖量的总和。G组的总浮游植物生物量、轮虫生物量、原生动物生物量和对照组并无显著性差异(P>0.05);实验前36 h,G组的细菌总数高于对照组,尤其是在前12 h,G组细菌总数增长较其他组快,但在实验后期,G组的细菌总数及叶绿素a含量的变化趋势与对照组基本一致。因此,一次性添加葡萄糖在初期可以促进细菌生长,但在整个实验过程中对微食物环无明显影响。
孙欢等[17]通过13C标记外源性葡萄糖,发现溶解性有机碳首先被细菌利用,而后经过微食物环被浮游动物所利用;黄邦钦等[18]通过初步研究台湾海峡初级生产的碳流动途径,发现微食物环在有机碳转换过程中,起到了至关重要的作用,即通过异养细菌进入微食物环。由此可见,有机碳源可以促进微食物环的物质流动,最直接的影响就是促进细菌生长。G组一次性添加葡萄糖后只在前期短时间内促进了细菌生长,但整个实验过程中对浮游生物的生物量并无明显影响,这可能和有机碳源添加量或其他碳源策略有关。细菌从外界吸收碳源和氮源的比例主要取决于菌体自身的C、N组成比例[19];王娇等[20]通过在不同盐度养殖水体中每天添加葡萄糖(即序批式添加)发现这显著地增加了生物絮团体积,并有效提高了卤虫生物量。因此,一次性添加较多的葡萄糖提高水中C/N并不能长期促进细菌的生长,水中C/N只要达到符合细菌自身C、N组成比例就可以促进细菌生长,从而将碳源通过微食物环流向浮游生物。也就是说,序批式添加合适的葡萄糖可以不断促进细菌生长,从而通过上行效应促进浮游动物的生长。序批式添加葡萄糖的GS组最终的轮虫、浮游植物生物量都显著高于对照组(P<0.05),这与王娇等[20]研究序批式添加葡萄糖对卤虫的生长影响相符合;其中浮游植物生物量和叶绿素a浓度的提高是因为藻菌的共生关系相互促进,再者大型捕食者凡纳滨对虾又不断代谢后排泄营养盐,给微藻生长提供营养源,浮游动物对微藻的摄食有大小的选择[21],因此体型较大的微藻可不断生长不受抑制。
3.2 下行效应对阳光型生物絮凝养殖水中微食物环的影响AC组抑制细菌捕食者(原生动物等)和部分真核藻类生长后对细菌生长的影响即下行效应,GS组添加大型捕食者(凡纳滨对虾)后对浮游生物和细菌的影响也为下行效应。放线菌酮对轮虫的抑制作用非常明显,AC组之所以保持较高水平的C、N含量,是因为放线菌酮的作用杀死部分真核生物而释放大量溶解性有机物,但没有显示一个持续的利用效率(即溶解性有机碳和溶解性有机氮没有呈明显下降趋势);AC组细菌总数出现较高峰值是由于原生动物捕食压力降低的下行效应。GS组的大型捕食者并没有通过捕食压力有效地抑制浮游生物的生长,因此GS组的微食物环中上行效应导致的浮游生物生物量积累大于下行效应导致的浮游生物生物量减少,也就是说在阳光型生物絮团对虾养殖中避免不了微食物环各级生物量的积累。
谢萍等[22]通过研究得出以下结论:当轮虫潜在捕食者密度较低时,在调控湖泊轮虫群落结构上,“上行效应”占主导因素;而当轮虫潜在捕食者密度较高时,则“下行效应”主导着湖泊轮虫群落结构。黄丹青[23]研究发现,“上行效应”和“下行效应”同时调控着微食物环,细菌和硅藻的多样性同时受螺类捕食和营养输入影响,且上行效应的影响程度大于下行效应,而底栖微藻的密度和生物量在螺类捕食作用中,上行效应占据主导地位。林涛等[24]研究发现能有效抑制水蚤孳生的鲢、鳙放养生物量比为7:3,这是通过鲢鳙捕食的下行效应控制水蚤孳生,说明今后生物操纵的研究还要更加量化。结合本文研究结果可知,微食物环各营养级受上行效应和下行效应共同影响,两者效应谁占优势取决于上行动力和下行压力的平衡点。
4 结论(1) 葡萄糖的添加可以促进细菌生长,一次性添加较多葡萄糖只能短时间促进细菌生长,序批式添加葡萄糖可以不断促进细菌生长,促进浮游动物生物量的积累和微藻的生长;(2)去细菌捕食者有利于细菌生长,单一的下行压力一定会有明显的下行效应,即合理抑制细菌捕食者生长,才能对细菌生长产生有利作用,进而更好地净化水质;(3)序批式添加葡萄糖产生的上行效应影响大于添加凡纳滨对虾产生的下行效应影响。
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2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Agriculture, Shanghai 201306, China;
3. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306, China