上海海洋大学学报  2019, Vol. 28 Issue (1): 29-36    PDF    
紫檀茋影响脂多糖诱导巨噬细胞炎症因子的变化
姚昀1, 刘克海1,2, 胡晓倩1,2     
1. 上海海洋大学 食品学院, 上海 201306;
2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306
摘要:采用脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型,评价紫檀茋的抗炎作用。在LPS刺激的RAW264.7细胞中,添加紫檀茋进行干预,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法检测细胞中炎症因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1),白细胞介素6(IL-6),白细胞介素1β(IL-1β),肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达量,Griess法检测培养基中一氧化氮(NO)的释放量,采用Western blotting方法进一步检测细胞中细胞外调节蛋白激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK),p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和核转录因子κB-p65(NF-κB p65)的蛋白磷酸化水平。结果发现:紫檀茋能够显著抑制炎症因子基因的表达和炎症介质NO的释放;紫檀茋+LPS组中ERK,p38和p65的蛋白磷酸化水平显著下降。紫檀茋能显著抑制炎症因子MCP-1IL-6IL-1βTNF-αiNOS的mRNA表达和NO的释放,其机制可能与阻断丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信号通路相关。
关键词紫檀茋    巨噬细胞    炎症因子    丝裂原活化蛋白激酶    NF-κB    

炎症是机体应对外来刺激的一种防御机制,是一种常见的病理过程[1]。然而长期的炎症反应或炎症反应过强则会诱导相关疾病的发生,如肝炎、痛风、动脉粥样硬化甚至是癌症等[2-5]。巨噬细胞是机体先天的免疫细胞,在炎症反应中起重要作用[6-7]。在LPS诱导的RAW264.7细胞中,toll-like受体4(TLR4)识别并结合LPS,进而促进炎症信号传导并诱导MAPK和NF-κB蛋白激酶的激活,导致MCP-1IL-6IL-1βTNF-α等炎症因子的转录以及NO等炎性介质的释放,最终导致炎症反应[8-9]

紫檀茋是近年来发现的一种优秀的抗氧化成分,主要存在于蓝莓、葡萄等水果中,天然来源的优势使得其在功能食品领域具有广阔的应用前景[10]。目前,关于紫檀茋的研究多集中在制备、合成和抗癌活性方面,尚未发现国内有针对紫檀茋抗炎活性的研究[11-13]。因此,本研究以LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型,观察紫檀茋对炎症介质和炎性因子生成的影响,并对其抗炎机制进行进一步的探究,为紫檀茋合理开发利用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

小鼠RAW264.7细胞株购自中国科学院上海细胞库;紫檀茋(Pterostilbene, Pte;纯度99%)购自中国杭州瑞树生化有限公司;脂多糖(L4391,0111:B4)购自美国Sigma公司;一氧化氮(NO)测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所;Trizol试剂,PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司;Faststart Essential DNA Green Master实时定量PCR试剂盒购自瑞士Roche公司;一抗:anti-ERK1/2, anti-p-ERK1/2, anti-JNK, anti-p-JNK, anti-p38, anti-p-p38, anti-NF-kB p65, anti-NF-kB p-p65,二抗:HRP -Linked antibody购自美国Cell Signaling公司。

1.2 实验方法 1.2.1 RAW264.7细胞培养

RAW264.7细胞使用含10%FBS、1%青链霉素的DMEM高糖培养基在37 ℃,5% CO2浓度中进行培养。细胞生长至80%~90%后进行传代,1~2 d换液1次、3~4 d传代1次。细胞传代3次,待细胞状态稳定后进行下一步实验。

1.2.2 RAW264.7细胞炎症模型的建立

将处于对数生长期的RAW264.7细胞以2×106个/mL接种到6孔板中,每孔2 mL,置于细胞培养箱中使细胞稳定生长,待细胞贴壁后,随机分为4组,每个处理组设3个平行,分别加入0、50、100和200 ng/mL的LPS进行刺激24 h,促使细胞产生炎症因子。采用qPCR法检测LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子MCP-1IL-6IL-1βTNF-α表达量来确定LPS诱导炎症的合适浓度。

1.2.3 细胞活力的测定

为避免加入的紫檀茋因浓度过大而导致细胞损伤,设置浓度梯度的紫檀茋,采用结晶紫染色法[14]检测紫檀茋对细胞存活率的影响,以确定最终实验浓度。将RAW264.7细胞以2×104个/mL接种到96孔板中,每孔200 μL,置于细胞培养箱中使细胞稳定生长,待细胞贴壁后,加入DMSO溶解的紫檀茋,浓度依次为0、5、10、15和20 μmol/L,每一浓度重复5孔,培养24 h后用结晶紫染色法染色,在酶联免疫检测仪(SynergyTM Mx,美国BioTek) 570 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.4 NO释放量的测定

LPS刺激RAW264.7细胞后会释放大量的NO,而NO化学性质活泼,在体内代谢很快转化为硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-),通过检测培养基中硝酸盐和亚硝酸盐含量来反映NO生成。调整细胞悬液浓度为2×105个/mL,接种于12孔培养板,待细胞长至60%~70%后,分为3组处理,分别为对照组、LPS处理组及LPS加紫檀茋组,每组设置3个平行,继续培养24 h。收集培养基,600 g离心5 min取上清,参照一氧化氮(NO)试剂盒说明操作,通过测定540 nm处吸光值来衡量培养基中NO的含量。计算公式如下:

    (1)

式中:C-为NO2-/NO3-含量, μmol/L;An为样品的测定OD值;A0为空白OD值;A为标准品的OD值;C为标准品的浓度, 100 μmol/L;n为样品测试前稀释倍数。

1.2.5 细胞总RNA提取、逆转录及Realtime-PCR

将RAW264.7细胞转入到6孔板中,每孔中的细胞个数为2×106个/mL,每孔2 mL,待细胞长至60%~70%后,分为3组处理,分别为对照组、LPS处理组及LPS加紫檀茋组,每组设置3个平行,继续培养24 h。收集细胞,采用Trizol试剂提取总RNA,通过测定吸光值OD260和OD280并计算其比值来判断RNA的纯度并测定其浓度,按照cDNA逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA;通过特异性引物进行Realtime-PCR扩增,18S作为内参,检测对应炎症因子的表达量,引物序列见表 1。此反应依照Faststart Essential DNA Green Master试剂盒进行,扩增程序:95 ℃,10 min;95 ℃,10 s;60 ℃,10 s;72 ℃,10 s;45个循环。

表 1 引物序列 Tab.1 Primer sequences
1.2.6 Western blot法检测RAW264.7细胞中MAPK和NF-κB p65蛋白表达水平

将RAW264.7细胞转入到6孔板中,每孔中的细胞个数为2×106个/mL,每孔2 mL,细胞培养48 h后,分为3组处理,分别为对照组、LPS处理组和LPS加紫檀茋组,每组设置3个平行,培养30 min后,PBS冲洗2遍,RIPA裂解液提取蛋白,收集细胞蛋白,定量,等量蛋白上样,进行SDS-PAGE电泳,半干转PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭1 h,一抗4 ℃过夜,PBST洗膜3次,HRP标记二抗30 min,PBST洗膜3次,ECL化学发光显色反应,用凝胶成像分析系统成像。

1.3 统计学处理

实验数据采用Graph Pad Prism 5.0软件进行处理,所有数值以Mean ± SEM表示,组间比较采用方差分析和t检验,P<0.05为差异显著。

2 结果 2.1 不同浓度LPS对RAW264.7细胞炎症因子表达的影响

为确定LPS诱导炎症的合适浓度,分别检测了50、100和150 ng/mL的LPS刺激RAW264.7细胞对炎症因子表达量的影响。MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF -α是免疫细胞分泌的一系列重要炎症因子。由图 1可知,3种浓度梯度的LPS在处理细胞24 h后,均能诱导RAW264.7细胞提高炎症因子 MCP-1IL-6IL-1βTNF-α基因的表达量。在100 ng/mL的LPS刺激下,对炎症因子表达上调已经达到极显著的效果(P<0.001),细胞产生明显的炎症反应,且未见细胞损伤,因此后续实验选用100 ng/mL的LPS刺激细胞产生炎症。

与空白组比较,** P < 0.01; ***P < 0.001 Compared with the blank group, ** P < 0.01; ***P < 0.001 图 1 不同浓度LPS诱导RAW264.7细胞对炎症因子基因表达的影响 Fig. 1 Effects of different concentration of LPS on gene expression of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells
2.2 紫檀茋对RAW264.7细胞活力的影响

为明确紫檀茋的无毒作用浓度,检测了不同浓度紫檀茋对RAW264.7细胞活力的影响。图 2结果显示,不同浓度的紫檀茋处理细胞24 h后,与空白组相比,低于10 μmol/L的紫檀茋处理对细胞存活率无明显作用,超过10 μmol/L浓度的紫檀茋使细胞存活率降低到80%左右,毒性作用明显(P<0.001)。因此,最终确定使用的紫檀茋浓度为5 μmol/L。

与空白组比较,*** P < 0.001 Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 2 紫檀茋对RAW264.7细胞活力的影响 Fig. 2 Effects of Pte on cell viability in RAW264.7 cells
2.3 紫檀茋对RAW264.7细胞炎症因子基因表达的影响

图 3可知,与空白组对比,100 ng/mL LPS刺激细胞后,极大提高了MCP-1IL-6IL-1βTNF-α这4种炎症因子的mRNA表达水平,说明LPS刺激可以造成巨噬细胞炎症因子转录水平的显著上升,这与模型建立的结果一致。与LPS组相比,紫檀茋对上述炎症因子均有抑制作用,且效果显著(P < 0.001)。

与control组比较,### P < 0.001;与LPS组比较,*** P < 0.001 Compared with the control group, ### P < 0.001; Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 3 紫檀茋对LPS刺激的RAW264.7细胞 MCP-1IL-6IL-1βTNF-α表达量的影响 Fig. 3 Effects of Pte on expression of MCP-1, IL-6, IL-1β and TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells
2.4 紫檀茋对NO释放量及iNOS基因表达的影响

NO是一种重要的炎性介质,参与宿主的免疫防御和调节过程。由图 4可知,紫檀茋能显著抑制细胞NO的释放,经紫檀茋处理,培养基中的NO浓度恢复至空白对照水平(P=0.001)。iNOS作为NO生成的关键限速酶,其基因表达水平是调控NO释放的重要因素,通过检测iNOS mRNA水平的表达,发现LPS可显著上调iNOS表达,而紫檀茋能够显著降低LPS诱导的iNOS表达量(P<0.001)。

与control组比较,### P < 0.001;与LPS组比较,*** P < 0.001 Compared with the control group, ### P < 0.001; Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 4 紫檀茋对LPS刺激的RAW264.7细胞NO释放量及iNOS基因表达的影响 Fig. 4 Effects of Pte on NO production and gene expression of iNOS in LPS-induced RAW 264.7 cells
2.5 紫檀茋对RAW264.7细胞中MAPK和NF-κB p65蛋白磷酸化的影响

MAPK包括ERK、JNK和p38,是参与炎症相关信号通路的重要酶。因此,通过Western blot法检测了紫檀茋对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中MAPK途径的影响。结果显示,紫檀茋对ERK和p38的磷酸化均有抑制作用,但对JNK没有抑制作用。另外,NF-κB在调节炎症因子中起重要作用。活化的NF-κB易位至细胞核以结合特异性DNA,进而调节各种炎性细胞因子的表达。因此,进一步检测了紫檀茋对LPS诱导的巨噬细胞中NF-κB p65磷酸化的影响,结果显示紫檀茋显著降低了p65的蛋白磷酸化水平。以上结果表明紫檀茋通过抑制MAPK和NF-κB途径抑制炎症因子基因的表达。

与control组比较,### P < 0.001;与LPS组比较,*** P < 0.001 Compared with the control group, ### P < 0.001; Compared with the blank group, ***P < 0.001 图 5 紫檀茋对LPS刺激的RAW264.7细胞MAPK和NF-κB p65蛋白表达的影响 Fig. 5 Effects of Pte on protein expression of MAPK and NF-κB p65 in LPS-induced RAW264.7 cells
3 讨论

紫檀茋是一种存在于蓝莓、树莓中的多酚物质。尽管其抗炎作用少有报道,其结构类似物白藜芦醇,则被公认为具有优良的抗炎效果[15-16]。鉴于其与白藜芦醇结构类似,推测紫檀茋很有可能具有抑制炎症的作用。探究了紫檀茋在LPS刺激的RAW264.7细胞中的抗炎作用,发现紫檀茋能够显著抑制促炎因子MCP-1IL-6IL-1βTNF-α在mRNA水平的表达,并能通过抑制iNOS表达来抑制LPS诱导的NO的产生。此外,还发现紫檀茋可能是通过阻断MAPK和NF-κB通路来抑制炎症反应。

MCP-1已经被证实是负责招募巨噬细胞的主要趋化因子,广泛参与了类风湿关节炎、心血管疾病和动脉粥样硬化等多种炎性疾病的发生[17]。IL-6是目前发现在慢性炎症疾病中作用最突出的细胞因子。同样,IL-1β和TNF -α能够增强巨噬细胞的敏感性,结合相应的受体,然后继续作为刺激信号激活更多的巨噬细胞,促进炎症的发展[18-19]。上述炎症因子被广泛用于指示炎症反应强度。本研究通过检测RAW264.7巨噬细胞中上述炎症因子的基因表达,证实了紫檀茋显著降低了LPS诱导的炎症因子,可以抑制炎症发生,这与白藜芦醇的抗炎作用类似。彭洁等[20]通过培养外周血单个核细胞,结果发现白藜芦醇能够有效抑制促炎因子IL-1βIL-6MCP-1表达。ZONG等[21]发现白藜芦醇同样能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞 IL-1βTNF-α的表达。此外,我们发现紫檀茋除了抑制MCP-1IL-6IL-1βTNF-α 等炎症因子的表达,同时抑制了炎性介质NO的产生,具有多靶点抑制炎症反应的特性。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化产生,高浓度NO有一定杀菌作用,但可作为促炎介质引起全身炎症反应,在炎症相关发病过程中起关键作用[22-23]。NOS有3种亚型结构,其中诱导型一氧化氮合酶被认为是巨噬细胞中NO合成的主要限速酶。本研究表明紫檀茋通过下调iNOS的表达起到抑制NO生成的效果,这与白藜芦醇的作用途径一致[24]

MAPK家族主要包括3种信号通路的转导,分别为ERK、JNK和p38,这3条途径在炎症反应中起重要作用[25]。ZONG等[21]研究发现白藜芦醇能够通过抑制ERK、JNK和p38的蛋白磷酸化水平来下调炎症因子的表达。与白藜芦醇不同的是,本实验结果显示紫檀茋能够有效抑制ERK和p38的磷酸化水平,而对JNK无明显抑制作用。因此,紫檀茋的抗炎作用与ERK和p38通路相关,主要通过抑制ERK和p38的磷酸化水平来下调炎症因子的表达。这可能由于两种多酚结构的不同,苯环上的羟基被甲氧基所取代,从而导致作用的途径不同。NF-κB是调节参与炎症的各种基因转录的关键核转录因子。一般而言,NF-κB以异二聚体结合ⅠκB的形式位于细胞质中。当细胞受到刺激后,ⅠκB-α被磷酸化并迅速降解,促进NF-κB p65的激活和磷酸化。活化的NF-κB易位至细胞核以结合目标DNA并诱导其下游炎性细胞因子如MCP-1IL-6IL-1βTNF-α的过度表达,并最终诱导炎症反应的发生[26-27]。因此,NF-κB p65的含量和形式的变化是NF-κB途径活化的重要标志。本实验进一步探究了紫檀茋对NF-κB p65蛋白表达的影响,结果显示紫檀茋能够显著降低NF-κB p65的蛋白磷酸化水平,这表明紫檀茋对炎症因子的抑制作用部分是通过对NF-κB p65的抑制而实现的。因此,紫檀茋还可通过阻断NF-κB途径来发挥抗炎作用。

4 结论

总之,紫檀茋能够显著抑制多种炎症因子的mRNA表达以及炎性介质的释放,表现出显著的改善炎症效果。对其抗炎机制的分析提示,紫檀茋可能是通过阻断MAPK和NF-κB途径的激活来抑制炎症因子的转录和表达,从而发挥抗炎的功效。因此,紫檀茋作为一种天然的多酚化合物,表现出多靶点抑制炎症反应的特性,在开发新型有效的功能性食品方面将具有很大优势。

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Effects of pterostilbene on lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in macrophages
YAO Yun1, LIU Kehai1,2, HU Xiaoqian1,2     
1. Food Science and Technology College, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Shanghai 201306, China
Abstract: To evaluate the anti-inflammation effect of pterostilbene on RAW264.7 macrophages, an inflammation model in vitro was established by lipopolysaccharide (LPS) stimulation. After exposing RAW264.7 cells to pterostilbene and LPS, the mRNA expression of inflammatory cytokines including monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, interleukin (IL)-6 and IL-1β, tumor necrosis factor (TNF)-α, and inducible nitric oxide synthase (iNOS) were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Nitric oxide (NO) production in supernatant was analyzed using Griess method. The protein expression of extracellular regulated protein kinases (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) and Nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) were detected by Western blot analysis. The results showed that pterostilbene significantly inhibited the gene expression of inflammatory cytokines and the production of NO. Pterostilbene significantly suppressed LPS-induced ERK, p38 and p65 phosphorylation. Data showed that pterostilbene could inhibit the mRNA expression of LPS-induced inflammatory cytokines including MCP-1, IL-6, IL-1β, TNF-α and iNOS, and the release of NO, and its mechanism may be related to blocking the mitogen-activated protein kinase (MAPK) and NF-κB pathway.
Key words: pterostilbene     macrophage     inflammatory cytokine     MAPK     NF-κB