2018,
Vol. 27
2. 上海海洋大学 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室, 上海 201306;
3. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266237
滴水湖又名芦潮湖，是在上海市浦东新区尚未成陆的海滩填海造陆开挖的一座人工湖，位于东海之滨。滴水湖水源的水质较差，总体为V类[1]，因而导致滴水湖生态系统也随之较为脆弱，水体呈富营养化[2]。从2004年起，研究者围绕着滴水湖水体中的抗生素、重金属、多氯联苯以及氮、磷营养盐等污染物，浮游植物和浮游藻类等进行了大量的研究[3-7]。胡文婷等采用变性梯度凝胶电泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、Biolog EcoPlateTM检测等传统方法，研究了滴水湖湖水及其引水河道沉积物中的微生物[8]。然而，全面地反映滴水湖中微生物群落结构的研究还是未见报道。
本研究中，我们结合DGGE[9]和高通量测序[10]的方法，在宏基因组层面初步探究滴水湖中细菌的多样性，为滴水湖中全面的微生物多样性研究提供数据基础。同时，探寻滴水湖中粪便污染指示菌[11][总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希菌(Escherichia coli)]，致病菌，条件致病菌[沙门菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、粪链球菌(Enterococcus faecalis)]和水体富营养化典型菌[12][鱼腥藻属(Anabeana)、水华束丝藻(Aphanizomenon flosaquae)、微囊藻属(Microcystis)等]等的存在性和分布情况，为合理治理滴水湖，保护滴水湖提供数据和理论基础。
1 材料与方法 1.1 湖水样品的采集湖水样品于2017年7月采集于上海市浦东新区滴水湖的7个港口及桥梁下方[3, 7-8, 13](图 1)：西岛连接桥(121°55′27″ E，30°53′55″ N)、绿丽港(121°65′26″ E，30°54′15″ N)、青祥港(121°55′53″ E，30°54′39″ N)、蓝云港(121°56′31″ E，30°54′39″ N)、紫飞港(121°56′58″ E，30°54′15″ N)、赤风港(121°56′48″ E，30°52′29″ N)、橙和港(121°55′53″ E，30°53′18″ N)和黄日港(121°55′25″ E，30°53′42″ N)，分别命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8。每个采样点用水样采集器和无菌采样瓶采集水下1.5 m深湖水500 mL，现场测定水样温度等参数后置于带冰袋保温箱中带回实验室，4 ℃短暂冷藏[14](表 1)。
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图 1 滴水湖湖水样品采集点分布图
Fig. 1 Location of sampling site in Dishui Lake
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表 1 滴水湖湖水样品理化条件信息 Tab.1 Physical and chemical conditions information of water samples in Dishui Lake |
将500 mL湖水用无菌玻璃滤器(F502000, 上海生工)和真空泵(Millipore WP6122050, Germany)过滤0.22 μm滤膜(MF-Millipore GSWP04700, Germany)后将滤膜置于无菌培养皿中，于-20 ℃冰箱冻藏。提取总DNA时，利用无菌剪刀和镊子将膜剪碎置入离心管，然后采用Fast DNASpin Kit for Soil (MP Biomedicals, USA)土壤DNA提取试剂盒提取总DNA，具体操作步骤见说明书。提取到的DNA经酶标仪(BioTek, USA)测定浓度和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整程度后，置于-20 ℃冻藏备用[14]。
1.3 16S rRNA基因V3区PCR-DGGE总DNA稀释后作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包括25 μL Taq mix, 19 μL ddH2O, 正反向引物(带GC夹子357F：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；518R：ATTACCGCGGCTGCTGG)各2 μL，DNA模板2 μL。PCR反应条件为94 ℃ 5 min, 94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃ 10 min。凝胶电泳检测PCR产物后，取20 μL PCR产物进行DGGE，反应条件：8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为40%~60%(100%的变性浓度包含7 mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺)，60 ℃变性温度，60 v电压16 h(Bio-Rad, USA)。后用20 μL的1×SYBR Green Ⅰ (Solarbio, Beijing, China)染色20 min，放入凝胶成像系统(Bio-rad，USA)成像获取胶图[15]。然后采用QuantityOne(Version4.6.2)进行指纹图谱分析了解湖水样品中细菌多样性异同[16]，初步确认滴水湖各采样点的细菌多样性特点。
1.4 16S rRNA基因V3-V4区高通量测序及分析根据DGGE指纹图谱分析的结果，选择代表性样品进行高通量测序(上海美吉生物)。样品总DNA经质量检测后，对合格的样品进行细菌16S rRNA基因V3+V4区(338F-806R)文库建立，然后在IlluminaMiseq平台测序，获取滴水湖16S rRNA基因宏基因组。MiSeq平台测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系(最小overlap长度为10 bp，overlap区允许的最大错配比率为0.2)，将成对的序列拼接成一条序列，同时对序列的质量和拼接的效果进行质控过滤(过滤序列尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的序列，去除含N碱基的序列)，并根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列(barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2)，并校正序列方向，即为优化数据。
1.5 细菌多样性分析质控后的优质序列进行可操作分类单元(Operational Taxonomic Units, OTU)聚类得到可进行后续分析的OTU。然后将OTU中代表序列与Silva等数据库比对进行分类学分析，获取滴水湖16S rRNA基因宏基因组的细菌种类、相对数量等信息。具体分析如下：先采用Qiime平台以及RDP Classifier对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列，然后按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：域(domain)，界(kingdom)，门(phylum)，纲(class)，目(order)，科(family)，属(genus)，种(species)统计各样本的群落组成。利用Muthur软件进行多样性指数(Ace, Chao, Shannon, Simpson)计算及聚类分析，用R语言工具绘制相关图表。
1.6 样品间关系分析为了获得5个样品间在不同水平上细菌的分类关系以及丰度关系，选择对相应水平上对应的序列进行进化分析，构建系统发生进化树。经过筛选后，首先使用FastTree(Version 2.1.3)软件，对科水平上的序列根据最大似然法(Maximum-Likelihood)构建进化树，然后使用R语言作图绘制进化树，使结果通过进化树与reads丰度组合图的形式呈现。
为了探究进行测序的5个样品之间的相似性和差异关系，对样品距离矩阵进行聚类分析，构建样品层级聚类树。首先通过统计学中的距离对样品间细菌的丰度分布差异程度进行量化分析，使用Bray-Curtis算法计算两两样本间距离，获得距离矩阵，用于后续进一步的beta多样性分析和可视化统计分析，然后在OTU水平采用average-linkage聚类法对距离矩阵进行层级聚类获得层次聚类树[17]。
2 结果 2.1 PCR-DGGE为了筛选出高通量测序的代表性样品，首先对8个采样点的湖水样品进行DGGE指纹图谱分析。从图 2a中可以看出，S1、S2、S3、S4、S5和S7六个样品的条带分布情况和明亮程度非常相似，表明这6个样品的优势菌多样性很大程度上相似；S6和S8两个样品的条带则与其余6个样品有区别，同时这两个样品之间的条带分布和明亮程度也有不同。从图 2b可以看出，8个样品中，以S4为标准，其他7个样品细菌多样性与S4的相似性分别为S5 92.1%，S7 88.9%，S2 88.5%，S3 88.3%，S1 79.6%，S6 74.8%，S8 72.8%。结果表明，8个样品之间的细菌多样性的相似性很高，最低的达到了72.8%。这个结果说明滴水湖周边水体样品采集点之间的细菌多样性具有较高的相似度，我们采集的这些点的水体样品中细菌多样性在一定程度上能够反映滴水湖表层水体细菌多样性在这个时间段的特点。
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图 2 滴水湖湖水样品S1-S8 16S rRNA基因V3区DGGE胶图及指纹图谱分析
Fig. 2 DGGE Gel picture and finger print of DSL water samples
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根据DGGE结果，我们从8个样品中选出了5个进行高通量测序，获得滴水湖水体样品16S rRNA基因的宏基因组序列，从宏基因组角度研究滴水湖中细菌的多样性特点。如表 2所示，总共得到了170 028×2条序列，总碱基数为102 356 856 bp。经过序列拼接和质控后得到了170 028条优化序列，优化碱基数为74 208 002 bp，优化序列平均长度为436 bp。S1、S5、S6和S7四个样品都得到了3万多条优质序列，而S8则得到了4万多条优质序列，测序量达到了实验设计目标。同时，各个样品的序列平均长度均为430 bp左右，序列的长度区间在300至500 bp，说明测序的质量是可靠的。经统计，质量控制后得到的优质序列有99.98%的序列长度分布在420至460 bp区间内，这与V3-V4区产物长度460 bp接近，说明测序的长度比较完整。
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表 2 滴水湖湖水样品16S rRNA基因V3-V4区高通量测序数据统计 Tab.2 Sequencing data of 16S rRNA gene V3-V4 from DSL water samples |
如表 3所示，自纲以下，虽然5个样品在同等级分类水平上的物种丰富度呈S5最多、S6最少，其他3个样品相差不多的趋势，但各个样品的OTU数量在相同分类水平上相差不大。这个结果初步说明，虽然5个样品中的物种丰富度有一定差别，但整体上还是一致的。图 3显示，5个样品的OTU分别都有300~400种，其中有266种为5个样品共有，80种为4个样品共有，3个样品共有的则有47种，2个样品共有的有27种，单独在1个样品中存在的只有8种。说明在OTU水平上，5个样品之间有62%的OTU是共有。若算上4个样品之间共有的OTU，共有的OTU则达到了81%，进一步说明了5个样品在物种丰富度上存在着一致性。
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表 3 滴水湖湖水样品16S rRNA基因宏基因组优质序列OTU聚类结果 Tab.3 Information of DSL 16S rRNA gene metagenome OUT clustering |
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图 3 滴水湖湖水样品16S rRNA基因宏基因组OTU共有情况韦恩图
Fig. 3 Venn diagram of OUT shared between different samples
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香农曲线图中，S1、S5、S6、S7、S8这5个样品所代表的曲线在约3 000条序列处趋平(图 4a)，说明本次的测序中，各个样品的测序量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。稀释性曲线图中，S7和S1在20 000条序列处接近趋平，S5和S6在25 000处接近趋平，S8在30 000条序列处接近趋平，说明30 000条测序量合理，更多的测序量只会产生少量的物种(图 4b)。这表明，本次测序数据量足够大，满足本次的研究需求。泛物种分析发现，随着样品数的增加，总OTU数先是增加较快，后渐渐趋平，最后达到428这个总数(图 4c)，说明这5个样品里所包含的细菌可以代表滴水湖中绝大部分的细菌，同时在种的水平上滴水湖中的细菌是很丰富的。核心物种分析证实，随着样品数的增加，代表核心物种的OTU数量在降低，占总数的四分之一左右(图 4d)，说明这5个采样点的湖水中细菌的丰度有一定的区别。
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图 4 滴水湖湖水样品16S rRNA基因宏基因组多样性分析：香农曲线(a)，稀释性曲线(b)，泛物种分析曲线(c)和核心物种分析曲线(d)
Fig. 4 Shannon-winner curve (a), Rarefaction curve (b), Pan analysis (c) and Core analysis (d) of high throughput sequencing results
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如表 4所示，5个样品的文库覆盖率在99.7%以上，说明获得的OTU能反映所研究的滴水湖湖水样品的细菌群落组成。Ace等指数显示，5个样品之间的物种丰富度和多样性有一定的差异但并不明显：物种种类S5>S7>S8>S1>S6，多样性S8>S1>S7>S6>S5。这表明，这些样品可以代表滴水湖的细菌多样性特点。
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表 4 滴水湖湖水样品中细菌多样性指数 Tab.4 The diversity index of bacteria in DSL water samples |
OTU水平样品关系层级聚类树分析表明，虽然5个样品可以被分为S1、S5，S6和S7、S8三个组，但是5个样品间的距离实际上都很小，最大不超过0.22(图 5)。结果说明了5个样品之间多样性虽存在差异但非常小，这也说明5个样品之间的细菌多样性是基本一致的，可以代表滴水湖的细菌多样性。
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图 5 OTU水平样品关系层级聚类树
Fig. 5 Hierarchical clustering tree on OTU level
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表 5中包含了5个样品中相对丰度排名前十的各个属的分布信息。可以看出，这些属的细菌在湖水样品中的占比达到了61%~82%，在丰度上属于优势菌属。同时可以观察到十个属水平的分类中，只有聚球藻属(Synechococcus), 黄杆菌属(Flavobacterium), 变性菌属(Limnohabitans)和土壤杆菌属(Sediminibacterium)的分类信息是精确的，而其他的则是没有精确分类信息的，这使得分析过程无法准确描述这些结果，所以本文中主要在门和科的分类水平分析湖水样品中细菌的分类特点，种和属的水平则主要讨论了我们关注的一些分类。分析表明，样品间细菌在科的水平上多样性相似。虽然物种的均匀度有一定差异，但是各个科的细菌的相对丰度变化非常小(图 6)，说明了虽然是位于滴水湖5个不同的采样点，但微生物的物种多样性基本一致。5个样品中的细菌在科的水平主要是鱼孢菌科(Sporichthyaceae)、酸微菌科(Acidimicrobiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、蟑螂杆状体科(Cryomorphaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)以及蓝细菌门(Cyanobacteria)下两个未分级的科，占OTU总数的70.08%~87.11%，虽然在丰度上存在着一定差异，但差异性较小，说明这些科的细菌是滴水湖中的主要细菌种群。
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表 5 各湖水样品中相对丰度前十的细菌属的情况信息 Tab.5 Information of Top10 genus in each water samples |
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图 6 系统发生进化树和各样品在科水平的序列丰富度
Fig. 6 Phylogenetic tree and number of reads on the family level
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我们采集了滴水湖2017年7月8个点的湖水样品进行研究，结果表明DGGE可以作为高通量测序结合宏基因组方法研究细菌多样性的方法的预实验，进行了采样和高通量测序的5个采样点的水体中细菌多样性可以代表滴水湖表层水体在采样期间的细菌多样性。限于采样量以及采样时间上的问题，我们的结果说明了采样期间的细菌多样性在空间上的分布特点，但不足以说明滴水湖细菌多样性随时间变化的特点，所以我们的研究在于结合PCR-DGGE初步探究滴水湖表层水体细菌在一个时间段内的多样性特点，为全面、精确研究滴水湖细菌多样性做一个初步的探索：确认采样点、确立研究流程以及探寻研究过程中应该注意的问题等，还有为研究水体中其他微生物例如噬菌体等的多样性积累数据。全面的滴水湖水体细菌多样性可以在本文的基础上加大采样量以及跨时间跨季度采样来进行研究来获得。
在采集水样的时候，根据文献资料和滴水湖具体情况，我们选取了8个采样点，在进行了变性梯度凝胶电泳以及DGGE指纹图谱分析后，我们发现S1、S2、S3、S4、S5、S7六个样品的优势菌群相似性较高，而S6、S8与其他样品的相似性则稍小。为了减少在初步探究研究中的成本，在选择样品进行高通量测序时可以减少细菌多样性相似度较高的样品的数量，所以我们选取了相似度较低的全部样品(S6、S8)和部分相似度较高的样品(S1、S5、S7)，总共5个样品(S1、S5、S6、S7、S8)。而后面进行的高通量测序及后续宏基因组学分析时，发现这5个样品的关系很近，细菌的多样性一致。这个结果证明了5个湖水样品的细菌多样性能够说明研究采样期间滴水湖表层水体的细菌多样性特点，同时也证明了DGGE被用来作为高通量测序选样预实验的可行性。
ZWART等通过随机克隆的方法对从不同淡水环境(湖泊和河流)中得到的689个细菌和75个质体的16S rDNA序列进行研究，发现典型的淡水细菌大都隶属于α-、β-、γ-变形菌亚门(Proteobacteria)，蓝细菌门(Cyanobacteria)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)[18]。NEWTON等结合前人的研究和最新的研究成果发现，湖泊生态系统变温层中共有21个典型的淡水细菌门类。除ZWART等已报道的5个优势门类外, 其他的16个细菌门类仅约占所收集到的全部序列的2.6%，包括：酸杆菌门(Acidobacteria), 绿菌门(Chlorobi), 绿弯菌门(Chloroflexi), 纤维杆菌门(Fibrobacteres), 厚壁菌门(Firmicutes), 梭杆菌门(Fusobacteria), 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes), 黏胶球形菌门(Lentisphaerae), 硝化螺菌门(Nitrospira), 浮霉菌门(Planctomycetes), 螺旋体门(Spirochaetes), BRC1, OD1, OP10, SR1和TM7[19]。
WU等通过对克隆的16S rRNA基因进行测序研究太湖湖水2004年3月、5月、7月、9月的细菌多样性[20]。结果发现7月份的湖水中细菌群落组成最为多样，以放线菌门(Actinobacteria)，变形菌门(Proteobacteria)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，浮霉菌门(Planctomycetes)，硝化螺菌门(Nitrospira)，厚壁菌门(Firmicutes)，酸杆菌门(Acidobacteria)，绿弯菌门(Chloroflexi)，绿菌门(Chlorobi) (后5个门的丰度相对较低)。结合4个月的结果分析表明，主要以放线菌门(Actinobacteri)、变形菌门(Proteobacteria)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，浮霉菌门(Planctomycetes)，疣微菌门(Verrucomicrobia)为主要菌门，占细菌总数的88%~100%，这个结果与ZWART、NEWTON等的研究结果相符。而我们的结果分析发现，在滴水湖中S1、S6、S8中放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势门，占微生物总数的97%左右，在S5中，放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)为优势门，占微生物总数的97.55%，而在S7中，放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)为优势门，占微生物总数的97.71%。与太湖细菌多样性相比，可以发现在门的分类水平上两者主要细菌的类型相似，为放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)；区别在于滴水湖的优势门中有蓝细菌门而且占比还不小，而太湖中没有，原因是作者主要分析太湖中异养细菌所以去掉了蓝细菌门的信息。总的来说，本文的研究结果与ZWART、NEWTON等的研究结果趋同，表明虽然滴水湖是一座人工湖，但湖水中细菌多样性与常见淡水湖泊中典型细菌多样性特点类似，说明了滴水湖微生物群落较为成熟和稳定。
在滴水湖中没有观测到粪大肠菌群、大肠埃希氏菌(E. coli)等水体污染指示菌的序列。对于一般的致病菌和条件致病菌，在属的水平没有观测到沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcus)的序列，只观测到了极少量的志贺氏菌属(Shigella)序列(0.1%)。这说明了在宏基因组学研究水平，滴水湖湖水基本没有受到水体污染菌污染。在滴水湖中没有发现粪便污染指示菌和常见致病菌以及条件致病菌，但发现了少量的其他的可能性致病菌，比如军团杆菌属(Legionella)[21]占总OTU数的0.20%；奈瑟氏菌属(Neisseria)[22]占总OTU数的0.11%；立克次氏体(Rickettsia)[23]占总OTU数的1.99%。说明在滴水湖中存在着致病菌致病的风险，这可能对于在滴水湖周边的游客特别是参与水上项目的游客存在着潜在的威胁。当然，基于16S rDNA的数据没有准确预测滴水湖中致病菌的具体情况，但是这些研究结果可以在更大范围内给出预警。后续的研究，比如用致病菌特异性引物筛查、qPCR等技术，可以更精确的获取滴水湖中致病菌的分布等信息，为这些致病菌的风险评估，做出相应措施预防等工作奠定基础。在分析滴水湖中蓝藻多样性的时候，发现宏基因组中蓝藻的序列主要为聚球藻属(Synechococcus)序列(19.3%~58.9%以及无法分类的蓝藻序列(33.6%~58.8%)，没有发现与水华相关的一些藻类的序列，比如鱼腥藻属(Anabaena)、水华束丝藻(Aphanizomenon flosaquae)、微囊藻属(Microcystis)等。说明，目前滴水湖没有蓝藻导致的水华的倾向和先兆。
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2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage & Preservation, Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, Shandong, China