菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)主要分布于我国东海海域和黄渤海海域,具有重要的经济、养殖和药用价值[1-2]。近年来,菊黄东方鲀自然种质资源由于生存环境的恶化而日趋枯竭[3],同时养殖生产过程中存在的成活率低、大小规格差异显著等问题严重制约了其养殖产业的可持续发展,亟需利用分子标记技术加速其良种的选育进程。截至目前,不同学者利用微卫星(SSR)分子标记技术解析了红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)和暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)等不同群体或家系间的遗传差异,并对分子标记辅助东方鲀的良种选育进行了初步的研究探讨[4-8],而菊黄东方鲀良种选育研究相对较少[9-11]。本研究利用SSR和ISSR两种分子标记技术对本单位的菊黄东方鲀第4代选育群体进行了遗传评估,以保证其良种选育工作的顺利进行。
1 材料与方法 1.1 材料试验所用的菊黄东方鲀选育群体(以下简称SH),是以捕获于我国东海海域的野生群体为基础群体,生长速度为选育指标,历经12年4代的群体选育,平均每代按照雌雄配组比1:1.5选择繁育亲本(总选择率为3%~8%)50组,于2015年在上海市水产研究所奉贤科研基地获得第4代选育群体。野生群体(以下简称YS)则是于2015年捕获于浙江省舟山市嵊泗县黄龙岛和徐公岛的周边水域,亦是后续放流群体的储备繁育亲本。从菊黄东方鲀选育群体和野生群体中各随机选取30尾健康的菊黄东方鲀,剪取部分尾鳍保存于95%的乙醇溶液中,分别编号后置于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2 基因组DNA的提取基因组DNA的提取参照常规的酚-氯仿抽提程序进行,并利用琼脂糖凝胶电泳和NanoVuePlus紫外可见分光光度计检测DNA的质量和浓度。样本DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测,显示无拖尾降解现象、条带清晰,且OD260nm/OD280nm的值在1.8~2.0的DNA样品,稀释到50 ng/μL后,保存于-20 ℃冰箱中备用。
1.3 SSR-PCR和ISSR-PCR反应体系、反应条件及PCR产物检测参考已报道的暗纹东方鲀和红鳍东方鲀的微卫星序列和引物[8, 12]及ISSR通用引物,分别选取30对SSR引物和100条ISSR引物交由上海生物工程技术服务有限公司合成。经梯度PCR扩增和PCR反应条件优化后,选取在菊黄东方鲀中扩增效果较好且多态性较高的14对SSR引物和23条ISSR引物(表 1)用于后续实验。
SSR-PCR扩增反应总体积为25 μL,内含约50 ng基因组DNA、12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix(1.25 U Taq聚合酶、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol/L KCl和3 mmol/L MgCl2)、正反向引物各1 μmol/L、ddH2O补充总体积至25 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min,94 ℃ 30 s,50 ~ 65 ℃(根据各引物的最适退火温度进行调整) 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环后,72 ℃延伸10 min,4 ℃终止反应。PCR扩增产物利用QIAxcel全自动实时毛细管电泳系统进行基因分型检测,电泳结果利用QIAxcelScreenGel 1.0.0软件进行片段大小的评估并输入到Excel中备用。
ISSR-PCR扩增反应总体积为25 μL,内含约25 ng基因组DNA、12.5 μL 2 ×Taq PCR MasterMix(1.25 U Taq聚合酶、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol/L KCl和3 mmol/L MgCl2)、正反向引物各0.5 μmol/L、ddH2O补充总体积至25 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min,94 ℃ 45 s,45 ~ 65 ℃(根据各引物的最适退火温度进行调整) 45 s,72 ℃ 2 min,40个循环后,72 ℃延伸10 min,4 ℃终止反应。PCR产物经由2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后,用Syngene凝胶成像系统进行拍照记录,并利用Gene Tool软件进行电泳条带的统计。
1.4 数据分析SSR数据主要基于各等位基因条带的大小进行统计,ISSR数据基于0/1矩阵(有条带记为1,无条带记为0)进行统计分析。两种分子标记的统计结果,均利用GenAlEx 6.5软件[13]计算各位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Nei’s遗传多样性指数(H)、Shannon多样性指数(I)等遗传参数,并基于NEI[14]遗传多样性参数计算群体间的遗传距离。利用ARLEQUIN 2.000软件[15],计算群体遗传分化指数FST,估计群体间的遗传分化程度,分析群体内和群体间的分子方差(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)。
参照BOSTEIN等的计算公式计算多态信息含量(PIC):
式中:CPI为多态信息含量;Pi、Pj分别为群体中第i、j个等位基因频率,n为等位基因数。
2 结果 2.1 SSR和ISSR引物的筛选本研究从30对微卫星引物和100条ISSR引物中分别筛选出重复性好、多态性高的14对SSR引物和23条ISSR引物(表 1)用于菊黄东方鲀不同群体的遗传变异分析,图 1和图 2分别为SSR引物Fms32和ISSR引物UBC834在菊黄东方鲀部分个体中的PCR扩增电泳图谱。
有效等位基因数、期望杂合度和多态信息含量往往能够反映出群体间的遗传差异。本研究中,14个微卫星位点总共检测到146个等位基因,其中在菊黄东方鲀选育群体中共检测到118个等位基因,在野生群体中检测到137个等位基因。选育群体和野生群体的平均有效等位基因数(Ne)、平均期望杂合度(He)和平均多态信息含量(PIC)分别为4.361 7和6.694 2,0.730 0和0.832 3,0.705 1和0.813 6(表 2)。其中:14个微卫星位点中,选育群体有2个位点为中度多态(0.25 < PIC < 0.5),12个位点为高度多态(PIC>0.5);野生群体中全部位点均为高度多态(PIC>0.5)。
23条ISSR引物在选育群体和野生群体中分别检测到169和174条多态性位点,多态位点百分数分别为84.08%和86.57%。选育群体的平均有效等位基因数(Ne)为1.447 1,比野生群体低1.981 8%;Nei’s基因多样性指数(H)为0.267 2,比野生群体低5.35%;Shannon’s信息指数(I)为0.407 2,比野生群体低4.32%(表 3)。
基于等位基因频率计算所获得的遗传距离能够准确反映出群体间的遗传变异程度,遗传距离越大,表明群体间遗传关系越远,遗传变异程度越大。本研究中,两种分子标记检测到的菊黄东方鲀选育群体和野生群体间的遗传距离分别为0.297 5(SSR)和0.050 9(ISSR),而遗传分化指数分别为0.061 9 (SSR)和0.061 5(ISSR)(表 4),表明两种分子标记所获得的菊黄东方鲀选育群体和野生群体间遗传距离差异较大,但是遗传分化程度的结果基本相似。此外,分子方差分析(AMOVA)显示,两个群体间的遗传变异有6.19%来自于群体间,35.71%来自于群体间个体间,58.11%来自于群体内个体间,表明两个群体的遗传变异主要来源于群体不同个体间的遗传差别(表 5)。
人工选育群体由于受到奠基者效应、人工选择以及遗传漂变等因素的影响,其遗传变异程度相对于野生群体往往会有不同程度的降低,这是水产动物种质资源保护和利用的核心问题。因此,在水产动物遗传改良的过程中,利用种质创新对养殖性状和遗传纯度给予改良和提高的同时,还要降低瓶颈效应和近交衰退的发生概率,这就需要及时地从分子水平上检测繁育亲本的遗传变异程度,以保证繁育亲本具有优良生长性状的同时,保持丰富的遗传变异。鉴于SSR和ISSR两种标记交替分布于动物基因组DNA中,且具有丰富的等位基因变异,本研究利用这两种分子标记技术联合分析菊黄东方鲀选育和野生群体的遗传变异情况,以期能够更加准确地解析这两个群体的分子遗传差异。
等位基因、杂合度和多态信息含量等遗传参数是评估群体遗传变异程度的重要参考指标。本研究中,SSR分子标记的研究结果显示菊黄东方鲀选育群体的Ne、He和PIC分别为4.361 7、0.730 0和0.705 1,显著低于野生群体(P < 0.05);ISSR分子标记的结果显示,菊黄东方鲀选育群体的H和I分别为0.267 2和0.282 3,分别比野生群体低5.35%和4.32%。两种分子标记对于菊黄东方鲀选育和野生群体遗传变异的检测结果表明,SSR标记所检测到遗传变异程度要大于ISSR标记,这可能与毛细管电泳(SSR)和琼脂糖凝胶电泳(ISSR)两种检测方法灵敏度以及两种分子标记本身的遗传特性(SSR为共显性遗传,ISSR为显性遗传)有关。此外,两个群体的Na > Ne且Ho < He,表明两个群体的等位基因分布不均匀,且存在不同程度的杂合子缺失,这一现象在草鱼[16]、暗纹东方鲀[8]、罗非鱼[17]及鲤鱼[18]等养殖群体中亦有所发现,这可能与不同群体所面临的选择压力、繁育亲本的近交效应和稀有等位基因的缺失等因素有关,特别是选育群体,往往会伴随着人工选育的进程而日趋纯化。依据BOTSTEIN等提出的多态信息含量的判断标准,当PIC < 0.25、0.25 < PIC < 0.5、PIC>0.5时,分别代表该位点具有低度、中度、高度多态性[19]。本研究中,菊黄东方鲀选育群体中只有两个位点为中度多态性(0.25 < PIC < 0.5),其余位点均为高度多态性(PIC>0.5),野生群体的所有位点均为高度多态(PIC>0.5),表明菊黄东方鲀选育群体和野生群体均具有丰富的遗传变异。菊黄东方鲀选育群体,历经4代的人工选育,仍然具有相对较高的遗传变异,一方面是由于本单位具有较大的繁育亲本数量(每代繁育亲本500尾左右)和选择强度(3%~8%),在进行菊黄东方鲀群体选育时,能够选取较多生长性状优良的繁育亲本,有效地降低了近亲交配的发生概率和繁育子代遗传多样性降低的风险;另一方面,菊黄东方鲀繁育周期长,选育世代数较少以及野生群体繁育亲本来源地和来源时间的差异亦是两个群体产生遗传差异和分化的主要影响因素。
选择往往能够诱导等位基因的变异,从而使选育群体能够产生遗传上的分化,而这个遗传上的分化程度常常利用遗传分化指数(FST)度量。基于WRIGHT等的分类标准,群体遗传分化指数(FST)在0~0.05、0.05~0.15、0.15~0.25时,分别表示群体间遗传分化微弱、遗传分化中等、遗传分化较大[20]。在本研究中,SSR和ISSR两种分子标记所获得的菊黄东方鲀野生和选育群体的遗传分化系数分别为0.061 9和0.061 5,表明两个群体间已经产生了中等程度的遗传分化,人工选择导致选育群体出现了一定程度的遗传趋异。而基因流(Nm)能够在一定程度上防止遗传漂变所引起的遗传分化,根据公式:Nm = [(1/FST)-1]/4,可知菊黄东方鲀选育和野生群体的基因流为3.79,表明两个群体在遗传上存在一定程度的基因流,主要是由于本单位菊黄东方鲀最初的基础群体来源于东海海域的野生群体,而基因流不仅能够代表不同群体间的实际基因交换情况,还代表过去群体间产生的基因交流,因此这部分基因流主要来源于选育群体的基础群体。此外,AMOVA分析结果亦表明,有6.19%的遗传变异来源于野生和选育群体间,而大部分(93.81%)遗传差异主要来源于群体个体间的遗传差异。以上结果表明,菊黄东方鲀选育群体经过4代的人为定向选育,与其野生群体在等位基因构成和遗传结构上产生了不同程度的遗传离异,遗传多样性亦有所降低,这就需要我们在菊黄东方鲀的后续选育过程中,制定科学、有效的育种策略,并适时地对繁育子代进行遗传监测,以保证繁育子代在生长性状改良的同时,仍具有丰富的遗传变异。
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