2. 上海海洋大学 上海水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 农业部鱼类营养与环境生态研究中心, 上海 201306
水产养殖业的快速发展引发的水环境问题逐渐突显。据估计,生产1 kg的鱼需排放162 g有机固体颗粒物[1]。高密度养殖模式的残饵、粪便的增加,使养殖水域负荷量加大。生物絮凝技术(Bio-floc Technology,BFT)可以将养殖过程中产生的固体颗粒物转化为可被部分养殖对象重新摄食的絮团饵料,解决养殖过程中的水质净化问题,并实现蛋白质的重复利用[2]。
生物絮凝技术是利用优势生长的异养细菌,通过同化作用,将氨氮转化成有机氮,使水体中一些有机颗粒结合起来形成一种可被鱼类摄食的生物絮团。在养殖应用中,生物絮凝技术主要分为两种方式:一种是直接在养殖池塘中创造条件形成絮团,即原位式生物絮凝技术;第二种是和养殖池分开,在序批式反应器(Sequencing batch reactors, SBR)中创造条件进行生物絮凝,即序批式生物絮凝技术。然而,原位式生物絮凝技术可能会引起的水体透明度下降、溶解氧降低等问题,其对养殖对象较严格的选择性也可能会为其发展带来局限性。因此,相关学者提出采用外置式生物絮凝技术,即序批式生物絮凝技术。序批式生物絮凝技术较原位式的生物絮凝技术有可控制水体透明度,保持一定的溶氧浓度,絮团浓度易控等优点[3]。但在实际应用中,采用序批式生物絮凝技术需要将残饵粪便收集达到一定的量,这个过程通常需要一段时间,在此过程中,已经收集起来的残饵粪便应该如何保存才能更少地损坏残饵粪便原有的成分需要进一步研究。本试验分别用冷冻干燥后保存和直接4 ℃保存这两种方法处理收集的鳗鲡残饵粪便,将这两种方法处理的残饵粪便培养成生物絮团,探讨这两种不同的保存方法处理粪便对生物絮团组分的影响。
1 材料与方法 1.1 试验装置生物絮团培养装置参考鲁璐等[4]的序批式反应器(SBR),SBR反应器为有机玻璃材质、桶状,有效体积为10 L,高为100.0 cm,内径为15.0 cm,外径为15.8 cm。曝气装置采用功率为135 W、曝气量为100 L/min的空气压缩泵(ACO-008,森森有限公司,浙江,中国), 分装6个沸石曝气头以提供溶解氧和混合强度。
1.2 试验材料残饵粪便取自上海海洋大学鳗鲡循环水养殖系统。收集期间,鳗鲡养殖密度约为12.01 kg/m3,鳗鱼配合饲料由福建高农饲料有限公司生产:水分≤10.0%,粗蛋白≥48.0%,粗脂肪≥4.0%,粗纤维≤3.0%,粗灰分≤17.0%,总磷≥1.0%,赖氨酸≥2.5%。收集的鳗鲡残饵粪便随机均匀分成两等份,一份直接湿质量4 ℃保存,另一份冷冻干燥后常温干燥保存。
1.3 试验设计与运行试验在上海海洋大学水产与生命科学学院设施渔业实验室进行。共设两个试验组:分别为冻干组(即文中A组,原料为冷冻干燥后常温保存的鳗鲡残饵粪便)和新鲜组(即文中B组,原料为收集后直接4 ℃保存的鳗鲡残饵粪便),每组3个平行。试验设为间歇曝气(曝气:不曝气=1 h:1 h[5]),初始混合液悬浮固体浓度为2 500 mg/L,温度为22~26 ℃,盐度为33~38。试验期间,每日依据DOC(溶解性有机碳)/TAN(总氨态氮)>15[6]添加碳源,以葡萄糖为碳源。
残饵粪便在进入SBR反应器之前先进行预处理。取6个500 mL的锥形瓶,3个锥形瓶中放入25 g冻干的残饵粪便,另3个锥形瓶中放入换算后干质量为25 g的4 ℃保存的残饵粪便,向这6个锥形瓶中分别加入200 mL熟化的自来水连续曝气72 h。曝气后的悬浊液完全转入洁净的SBR反应器中,加水至10 L,然后放入曝气石用电磁式空气泵曝气。
1.4 试验方法 1.4.1 絮团指标测试方法絮团总固体悬浮颗粒(TSS)采用重量法测定,FV-5采用英霍夫式锥形管取1 L水样静置5 min的方法测定,粗蛋白采用元素分析仪(Elmenter ELMENTER VARIO MAX,德国)测定其氮元素含量[7],氮换算成蛋白质的平均系数为6.25[8],粗灰分的测定采用马弗炉灼烧法[9]。
脂肪酸由上海交通大学分析测试中心测试,预处理甲酯化后,上机检测。仪器:美国安捷伦公司7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS);色谱柱:DB-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样量:1 μL;进样温度:270 ℃。
氨基酸由上海交通大学分析测试中心测试,预处理后,使用氨基酸分析仪测试,氨基酸分析仪型号:Hitachi L-8900 Amino Acid Analyzer (Tokyo, Japan)。检测波长(Spectrometer):570 nm,440 nm。
絮团电镜拍摄:取出絮团样本先用0.1 mol/L的PBS缓冲液浸泡10 min,然后用2.5%的戊二醛固定2 h,随后,依次用浓度为50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇脱水,每种乙醇浓度脱水10 min [10]。室温放置除去残留乙醇,然后加入丙酮,采用临界点干燥机对样品进行干燥,最后将其置于扫描电子显微镜(S3400NII,日本日立公司,日本)下观察并拍照。
1.4.2 水质指标测试方法温度(T)、盐度(SAL)、溶解氧(DO)、pH、氧化还原电位(ORP)用YSI556MPS多参数水质测定仪测定。亚硝酸盐(NO2--N)、硝酸盐(NO3--N)、总氨态氮(total ammonia nitrogen,TAN)、总氮(total nitrogen,TN)、总磷(Total phosphorus,TP)测定方法参照《水和废水监测分析方法》第四版[11]和《海洋调查规范》GBT2007[12]。溶解性有机碳测定:水样经0.45 μm滤膜抽滤后,用TOC-V.CPH型有机碳分析仪测定。
1.5 数据统计分析本研究采用Microsoft Excel和IBM SPSS Statistics 22进行数据分析,以平均值±标准差(X±SD)表示,P<0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 絮团的水质变化在试验过程中,前三天氨氮浓度升高,此过程可能为氨化作用,这可能是絮团闷曝阶段未能将氨化作用进行完全。在补充碳源后,异养细菌大量生长,氨氮浓度波动较大,在第4 ~11天,氨氮浓度变化幅度分别为A组0.86~9.65 mg/L,B组0.83~6.15 mg/L,变化过程中两组变化趋势一致,A组浓度值较B组稍高。在第13天后,两组氨氮浓度均迅速下降,直至试验结束(第17天)氨氮浓度在0.08 mg/L以下,如图 1(a)所示。
亚硝氮浓度在试验的前6天变化幅度较大,A组亚硝氮浓度最高值为2.82 mg/L,B组亚硝氮最高值曾达到6.47 mg/L,在第6天后,两组亚硝氮浓度均迅速降低到0.03 mg/L及以下,如图 1(b)所示。
在整个试验过程中,硝氮的浓度有波动且呈下降趋势,在第1天A组硝氮浓度为1.34 mg/L,B组浓度为1.42 mg/L,在第17天,A组硝氮浓度降为0.04 mg/L,而B组硝氮浓度低于0.04 mg/L,如图 1(c)所示。
总磷浓度在前期有波动,第6天之后开始平稳上升,总磷有累积现象。第1天,A组总磷浓度为4.40 mg/L,B组总磷浓度为9.18 mg/L;在第17天,A组总磷浓度达到8.21 mg/L,B组总磷浓度达到11.86 mg/L,如图 1(d)所示。
2.2 絮团的部分组分指标由表 1可知,两组絮团的TSS浓度相差较大,原因是试验开始时调整的初始TSS浓度相差较大,导致试验后期两组TSS浓度仍相差较大,但整个试验过程中,两组絮团的TSS均为增加的趋势。培养初期,A组TSS浓度为(2 268.33±96.02) mg/L,B组TSS浓度为(3 257.33±101.13) mg/L,到培养末期,A组TSS浓度增加了975.34 mg/L,B组TSS浓度增加了1 190 mg/L,分别达到了(3 243.67±238.63) mg/L和(4 447.33±844.17) mg/L。两组絮团的VSS浓度均为累积趋势,在培养后期,A组VSS浓度为(3 050.27±229.90) mg/L,B组VSS浓度为(4 140.67±757.05) mg/L。两组絮团的粗灰分含量在培养后期较培养前期均有所降低,在培养后期,A组粗灰分含量为6.80%±0.00%,B组粗灰分含量为5.97%±0.01%,差异显著。在培养后期,两组絮团的粗蛋白含量均达到30%以上且差异不显著,分别为A组33.44%±7.80%,B组33.65%±3.17%。
由表 2可知,残饵粪便的游离氨基酸含量明显比两组絮团均高,并且种类数比A组多,与B组一致。必需氨基酸中,仅Glu含量为生物絮团比残饵粪便高,且B组含量最高,达到(5.15±0.08)mg/L,而Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His、Arg含量均为残饵粪便明显高。两组絮团中,A组游离氨基酸种类为16种,B组为23种,且B组的必需氨基酸含量均比A组高,其中,Thr、Val、Met、Ile、PHe、Lys、Glu、Arg差异显著,Leu、His差异不显著。
经检测,两组絮团的脂肪酸种类及含量均少于残饵粪便的脂肪酸种类及含量。其中,残饵粪便中二十二碳六烯酸(DHA)的含量为(3.18±0.69) mg/g,而在A组和B组絮团中仅分别为(0.15±0.10) mg/g和(0.07±0.13) mg/g,差异显著。检测到两组絮团的脂肪酸种类分别为A组26种,B组25种(表 3)。
由电镜扫描图版可见,在培养后期采用扫描电子显微镜对两组絮团进行观察。分别在300倍和2 000倍的条件下用电镜扫描絮团表面结构图,发现两组絮团致密程度存在一定差别,A组结构较松散,表面凹凸不规则,致密性较差,B组结构较紧凑,表面较平整,致密性较好。
养殖水体中的氨氮含量、亚硝氮含量等是评价水质好坏的重要指标。生物絮凝技术是微生物的无机氮同化过程[13]。因其能够有效控制水体中的氮含量,受到越来越多研究者的关注。研究表明[14]在生物絮凝过程中,异养细菌可快速降解氨氮,同时还能结合水体中的有机碳源转化为自身蛋白质,提高生物絮团的蛋白含量。潘云峰等[15]研究发现,生物絮凝技术可将水体氨氮的浓度从104.25 mg/L在5 d之内迅速降低到1 mg/L以下。唐华钟等[16]研究絮团对半咸水养殖水体的处理效果发现,氨氮浓度最大值达到10.75 mg/L,呈现“下降—上升—下降”的波动趋势。本试验中,两组絮团的水质中氨氮的变化趋势是“上升—下降—波动—迅速下降—平稳”。整个过程中两组絮团的氨氮浓度均在10 mg/L以内,分别为A组0.05~9.65 mg/L,B组0.05~6.15 mg/L。亚硝氮的变化趋势和氨氮基本相同。表明在絮团的形成过程中异氧菌利用水体中的氨氮和亚硝氮合成自身的细菌蛋白,并大量繁殖成为优势菌属,使氨氮迅速降解。研究结果表明两种保存方法处理粪便,均可培养絮团,达到较好的净化水质效果。
3.2 生物絮团的营养成分生物絮团的粗蛋白含量一般在38.5%~57.4%,粗脂肪在20%~35%,灰分 < 20%,能量在20~25 kJ/g[17]。实际应用中,絮团的粗蛋白含量与所用原料有关。EKASARI等[18]利用虾塘粪便培养生物絮团,结果发现絮团粗蛋白含量最高组为27.8%,且与絮团粒径有关,陈家捷[19]利用新吉富罗非鱼的粪便培养絮团,在絮团的形成过程中检测絮团的粗蛋白含量,结果发现絮团粗蛋白含量最高为26.37%,本试验利用鳗鲡粪便培养生物絮团,试验中,两组絮团的粗蛋白含量为: A组33.44%±7.80%,B组33.65%±3.17%,差异不显著。且两组絮团的粗灰分含量均在10%以下,能够达到作为某些养殖对象饵料的要求。
氨基酸是构成动物蛋白质的基本单位,同时也是养殖动物营养需求的必要因素。本试验中,残饵粪便的游离氨基酸含量明显比两组絮团高,必需氨基酸中,仅Glu含量为絮团比残饵粪便高,而Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His、Arg含量均为残饵粪便明显高。出现此现象的可能原因是:鳗鲡饲料营养价值较高,残饵粪便中残饵所带来的氨基酸含量仍较高。残饵粪便经过培养形成生物絮团,在此过程中,大量异氧细菌繁殖代谢,可能会消耗分解残饵粪便中的游离氨基酸,导致残饵粪便中游离氨基酸比由此培养形成的生物絮团的游离氨基酸含量高。两组絮团中,A组游离氨基酸种类为16种,B组为23种,且B组的必需氨基酸含量均比A组高。A组的粪便采用-40 ℃的真空干燥,在此过程中原料失去水分,对氨基酸的种类结构变化可能产生了影响,而B组采用直接4 ℃保存,对絮团氨基酸的种类组成影响相对较小。并且B组的必需氨基酸含量均比A组高。可知,絮团原料的保存方法不同对所形成的生物絮团的氨基酸种类及含量存在一定的影响。
EKASARI[18]研究了不同碳源和盐度条件下的絮团的脂肪酸含量,发现絮团的必须脂肪酸中二十二碳六烯酸(DHA)的含量为0.06~0.18 mg/g,本试验中两组絮团的DHA含量为A组:0.15 mg/g,B组:0.06 mg/g,与EKASARI的研究结果相符合。而本试验中残饵粪便中二十二碳六烯酸(DHA)的含量为(3.18±0.69)mg/g,显著高于生物絮团的DHA含量。出现此现象的可能原因为:鳗鲡饲料营养价值较高,残饵粪便中残饵所带来的脂肪酸含量仍较高,而残饵粪便经过培养形成生物絮团,在此过程中,大量异养细菌繁殖代谢,可能会消耗分解残饵粪便中的脂肪酸,絮团与残饵粪便组分发生了变化,导致残饵粪便中脂肪酸比由此培养形成的生物絮团的脂肪酸含量高。检测到两组絮团的脂肪酸种类分别为A组26种,B组25种。含量则各有优势,其中DHA含量为A组显著高于B组。
3.3 小结综合试验结果可知,若对絮团脂肪酸要求较高,可考虑冷冻干燥絮体原材料。若综合考虑成本、工序以及必需氨基酸等营养价值,可选择将絮团原材料直接湿重保存于4 ℃环境中即可。
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2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306, China;
3. Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition(CREEFN) of the Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China