2. 上海申漕特种水产开发公司, 上海 201516
罗氏沼虾( Macrobrachium rosenbergii)又称马来西亚大虾、淡水长脚大虾,原产于东南亚、西太平洋岛屿[1],属于甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)长臂虾科(Palaemonidae)沼虾属( Macrobrachium),是世界上最大的淡水虾。由于其具有生长快、个体大、食性广等特点,目前已成为我国主要淡水养殖虾类之一。随着罗氏沼虾养殖业的迅速发展,人们对罗氏沼虾苗种的需求量越来越大,但近年来罗氏沼虾种质退化严重,优质苗种数量减少,阻碍了罗氏沼虾养殖业的发展,主要原因为繁殖力下降,生长缓慢以及性早熟等[2-3]。因此,高繁殖力也成为罗氏沼虾良种选育的重要方向。
近几年来,水产动物的繁殖力研究主要集中在鱼类[4-9]和对虾类[10-11],沼虾类的繁殖力相关研究也有一些报道[12-14],但鲜见罗氏沼虾的繁殖力研究报道,研究主要集中在罗氏沼虾的生长[15-16]、性腺发育[17]、抗病性[18-20]等方面。有研究表明虾卵中含有大量的卵黄蛋白原(Vitellogenin, VTG),并被组织蛋白酶D水解为卵黄磷蛋白(Lipovitellin,Lv)和卵黄高磷蛋白(Phosvitin,Pv),是胚胎和幼体早期发育的主要营养物质[21-23]。同时有学者发现组织蛋白酶D(Cathepsin D,CTSD)具有多种生物功能, 如降解细胞内外蛋白质, 激活酶原,参与水产动物免疫系统调节等,对水产动物的胚胎和幼体早期发育有着重要作用[24-26]。因此,本实验通过比较分析罗氏沼虾5个专门化选择品系的相关繁殖力指标和受精卵质量指标(如受精卵VTG含量、CTSD活性、卵径等),探讨罗氏沼虾繁殖性能,以期为罗氏沼虾选育和亲本管理提供基础数据与理论指导。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用虾的基础群体是依据马来西亚罗氏沼虾上海养殖群体的外部形态(体长、体质量、头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高)差异,并结合聚类分析结果,建立的5个专门化品系选择系。其中依据第一腹节宽与体长的比值划分出A系(0.173, 0.189)、B系(0.189, 0.232);依据第一腹节高与体长的比值划分出C系(0.174, 0.196);依据头胸甲宽与体长的比值划分出D系(0.195, 0.221) 和E系(0.221, 0.317)[27]。实验虾为尚未产过卵的5个专门化品系子五代亲本。对照组虾(Control group)为上海养殖群体尚未产过卵的亲本。实验用水为已经过充分暴气无余氯的自来水。
1.2 亲虾的饲养管理从实验虾和对照组虾各养殖池(25 m2,10尾/m2)中分别选取附肢完整、健康、个体大小一致、性腺发育良好的罗氏沼虾作为受试虾,其中雄虾平均体质量(29.87±0.43) g,平均体长(14.03±0.06) cm;雌虾平均体质量(18.42±0.59) g,平均体长(9.01±0.08) cm。每组各设3个重复,每个重复有1尾雄虾和4尾雌虾,置于LLDPE黑色圆桶(Φ=1.5 m)中,其中4尾雌虾分别用红、橙、黄、绿4种荧光材料VIF(Visible implant fluorescence)进行标记以示区别。所有重复试验桶置于同一个循环过滤系统中,期间连续充气,持续循环过滤(每只桶滤速约8 L/min),每7天换70%的同温淡水,维持水深80 cm,管道热水循环恒温(28.0±0.5) ℃。每日早7点晚8点各投喂一次野杂鱼肉,日投饵量约5%~10%,以次餐有少许剩余为准,每餐前及时清除残饵和粪便。每日早中晚观察3次,记录抱卵情况,发现抱卵虾及时采样。
1.3 抱卵量及卵径的测定用消毒镊子快速小心剥离抱卵虾腹部卵,吸水纸包裹1 min吸干表面后用分析天平(0.001 g)称质量,后采用电子天平称取雌虾体质量(0.01 g),游标卡尺(0.02 mm)测定其体长,并迅速将雌虾放养于原桶中。镜检受精状况,从受精卵块中随机挑取一小块卵块称重并全部计数,按比例换算出该雌虾所抱受精卵总粒数,即为抱卵亲虾的绝对抱卵量;同时再随机挑取30粒受精卵,在生物显微镜下目测微尺(0.01 mm)测定其卵径。剩余卵保存于-40 ℃冰箱中。
1.4 CTSD活性及VTG含量的测定样品预处理:解冻-40 ℃保存的虾卵,分别准确称取1 g置于玻璃匀浆器中,加入9倍的预冷生理盐水,冰浴研磨,匀浆液在4 ℃, 10 000 r/min条件下离心10 min,取上清液于1.5 mL离心管中, 置于4 ℃冰箱中待测。
受精卵中CTSD活性和VTG含量测定:参照酶联免疫吸附方法[28],分别采用购自上海酶联生物科技有限公司的组织蛋白酶D (CTSD)ELISA试剂盒和鱼卵黄蛋白原(VTG)ELISA试剂盒,并在ST-360酶标仪(上海科华实验系统有限公司)450 nm波长下测定各自吸光度(OD值),由标准曲线计算出各样品中CTSD活性和VTG含量。具体操作按试剂盒说明进行。
1.5 数据处理Excel 2007整理分析实验数据,SPSS 17.0进行单因素方差分析和Person相关分析,Duncan氏法均值多重比较,P<0.05表示差异显著。单位体质量抱卵量、卵巢发育周期和卵径的计算式如下:
式中:FW为单位体质量抱卵量(粒/g);F为每尾雌虾的绝对抱卵量(粒);W为该雌虾体质量(g);DE为卵径(nm);DL为受精卵的长径(nm);DW为受精卵的短径(nm);CO为卵巢发育周期(d);Ti+1为该雌虾第i+1次抱卵初始时间(日期);Ti为该雌虾第i次抱卵初始时间(日期)。
2 结果与分析 2.1 抱卵量、组织蛋白酶D活性及卵黄蛋白原含量的比较如表 1所示,在连续3次抱卵过程中,试验罗氏沼虾雌虾单尾抱卵量F平均为4.52×104粒/尾,FW平均为2.11×103粒/g,雌体体质量最大的两个选择系B、D的F值最大,均显著大于C、E选择系和对照组(P<0.05),FW值也显著大于E选择系和对照组(P<0.05),而B、D选择系与A选择系间无显著差异(P>0.05);C、E选择系和对照组的F、FW也均无显著差异(P>0.05),对照组虾最小。
相关分析试验虾BL、BW、F、FW间的相关系数(表 3),发现F与BW呈极显著正相关(P<0.01)。FW与BW呈显著正相关(P<0.05),与F呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.803。表明各选择系罗氏沼虾的体质量越大,绝对抱卵量和单位体质量抱卵量就越大,反之则小。
而从表 1又知,试验雌虾的受精卵的CTSD平均活力为292.7 U/g,VTG平均含量为3.87 μg/g,且B选择系的VTG含量最高为5.80 μg/g,显著高于A、C、E选择系和对照组(P<0.05),D的VTG含量次之;D选择系的CTSD活性最高为320.82 U/g,显著大于A、C、E选择系和对照组(P<0.05),B的CTSD活性次之,B和D选择系的VTG含量、CTSD活性没有因F、FW最高而降低,且两者间无显著差异(P>0.05)。
2.2 卵巢发育周期和卵径大小比较如表 2所示,试验虾卵巢发育周期CO1平均为19.3 d,CO2平均为23.6 d,各选择系罗氏沼虾CO1大小顺序为D<C<E<B<A,CO2大小顺序为C<D<B<A<E,D选择系卵巢发育周期均值最小,为18.8 d,其次为B和C选择系;且各选择系的CO2值均大于CO1值,可见各选择系后一次抱卵均比前一次抱卵时间长。图 1表明各选择系罗氏沼虾连续3次抱卵卵径大小均无显著差异(P>0.05),其中A、B、D选择系在3次抱卵过程中卵径大小较稳定,而C、E选择系卵径有变小的趋势。
如图 2、3所示,连续3次抱卵过程中,各选择系的F、FW均呈递增的趋势。其中,A、B、C、D选择系第二、三次抱卵的F均显著大于各自选择系第一次抱卵F值(P<0.05)。C选择系第三次和D选择系第二次抱卵的FW均显著大于第一次抱卵,其他选择系3次抱卵间均无显著差异(P>0.05)。相关分析各选择系罗氏沼虾后一次抱卵的F、FW与前两次抱卵的F、FW(表 4)可知,连续3次抱卵中后一次抱卵的F与前一次抱卵的F、FW均呈极显著相关(P<0.01),第三次抱卵的FW与第二次抱卵的F、FW均呈极显著相关(P<0.01),第二次和第三次抱卵的FW均与第一次抱卵的F、FW呈显著相关(P<0.05)。
图 4中,A、B、E选择系3次连续抱卵的CTSD值均无显著变化(P>0.05),而C、D选择系第三次抱卵的CTSD值均显著大于第一、二次抱卵(P<0.05)。图 5中A、B、D选择系第三次抱卵的VTG值均显著大于第一、二次抱卵(P<0.05),而C、E选择系及对照组三次抱卵的VTG值均无显著变化(P>0.05)。
3 讨论不同品系间繁殖力差异性分析是筛选繁殖性能优异品系的重要方法,表现繁殖力大小的指标常采用单位体质量产卵量、卵巢发育周期、受精卵卵径与卵黄蛋白含量,以及组织蛋白酶D活性大小[10-14, 26, 30]。杨彦豪等[10]通过对不同凡纳滨对虾家系间产卵量、卵径大小及连续产卵的时间间隔进行测定比较,分析了不同家系间繁殖力的差异性。何绪刚等[12]通过测定日本沼虾的绝对繁殖力、相对体长繁殖力和相对体质量繁殖力对其繁殖力差异进行了比较分析。范忠刚等[13]通过对原种罗氏沼虾杂交后代的怀卵量、相对体质量繁殖力、受精率及受精卵规格的比较研究,分析了其杂交后代繁殖力的差异性,并发现更大的卵粒会发育成更大的幼体,有助于提高种群的生存能力。甲壳动物卵黄蛋白原是大型脂质转运蛋白超家族的成员,它是一种大分子磷脂糖蛋白,是非哺乳类卵生动物中卵黄蛋白的前体[29],卵黄蛋白原含量较少,供胚胎和幼体早期发育的营养物质就少。雌虾的卵巢发育周期的长短反映了其卵巢再次成熟的能力,卵巢发育周期越短则卵巢再次成熟的能力就越强[30]。张志林等[26]认为组织蛋白酶D具有多种生物功能, 如降解细胞内外蛋白质, 激活酶原与生长因子, 参与水产动物免疫系统调节等。水燕等[22]认为甲壳动物卵黄蛋白原在卵母细胞内被组织蛋白酶D酶切修饰后,加工成卵黄磷蛋白和卵黄高磷蛋白,为胚胎发育提供氨基酸和脂类等营养物质。
本实验通过测定5个选择系间罗氏沼虾F、FW、CTSD活性、VTG含量、DE和CO值的大小,对其繁殖力的差异性进行比较分析。结果发现3次连续抱卵中B和D选择系的F、FW最大,可反映受精卵质量的CTSD活性、VTG含量及DE并没有因抱卵量大而减小,相反均大于其他选择系,且CO也相对较短,说明卵巢再次成熟的能力强于其他选择系,因此可认为B、D选择系的繁殖力最大,A选择系次之,C、E选择系的繁殖力相对较低。同时,影响罗氏沼虾抱卵量大小的因素较多,有研究发现罗氏沼虾的产卵量因其性腺发育情况不同而异[31],温度、水质以及投喂饲料的不同也会引起抱卵量的差异。本试验雌虾的平均怀卵量范围为38 000~51 300粒,相对体质量繁殖力最大为2 300粒/g,与李增崇[31]测定的结果相似,但大于范忠刚等[13]研究的1 200粒/g。引起这种差异的原因可能是由于实验用虾来源和规格不同,本实验所用罗氏沼虾是已人工选育的子五代亲虾,有别于范忠刚等研究的从孟加拉和越南引进的罗氏沼虾亲虾。同时本次实验虾规格一致,水温、雌虾比例、饲料密度、换水等饲养和管理条件基本相同,引起各选择系间繁殖力差异的主要原因可能是各选择系种质不同而导致的,但是否与其亲虾的生长速度有关,还需要进一步的研究。
另外试验发现各选择系罗氏沼虾雌虾体质量与绝对抱卵量、单位体质量抱卵量均呈显著相关,这与以往研究结果相一致[11, 14, 32],且连续3次抱卵中后一次抱卵的绝对抱卵量、单位体质量抱卵量均与前一次抱卵的绝对抱卵量、相对体质量抱卵量呈显著正相关,表明各选择系罗氏沼虾亲虾后一次抱卵的繁殖力大小均受前一次抱卵亲虾繁殖力大小的影响,前一次抱卵量大,则后一次抱卵量就大,反之则小。而不同选择系罗氏沼虾的两次抱卵间的CTSD活性、VTG含量和卵径大小无显著相关。因此在在亲虾培育过程中,挑选体质量大、且第一次抱卵较大者雌虾进行育苗,有利于提高繁殖力和苗种生产能力。
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