2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 国家淡水水产品加工技术研发分中心, 上海 201306
螺旋藻(Spirulina)是一种分布于热带、亚热带地区淡水或盐碱性湖泊中的丝状蓝藻(blue green algae),又称蓝细菌(Cyanobacteria)[1]。螺旋藻富含蛋白质,含量高达60%~72%[2],发挥类生长因子作用的藻胆蛋白的含量约为总蛋白的1/3[3],螺旋藻所含蛋白质不仅数量多,而且消化吸收率优良[4],是优质的蛋白质供给源。螺旋藻还含有多种维生素(如Bl、B2、B3、B6、B12等)、矿物质(如钙、镁、磷、铁、钠、锰等)、多糖、酶类和肌醇[5]等。螺旋藻含有的不饱和脂肪酸中包含对人体起重要调节作用的γ-亚麻酸[6]。螺旋藻因丰富的营养成分而被誉为“21世纪最佳保健品”“明天最理想的食品”等[7]。
近年来,关于螺旋藻的研究集中在抗氧化、增强免疫、降血糖、保护肝脏和降血脂等生理功效[8]方面。
体外胃肠消化模拟是一种基于生物活体生理学特点,安全、快速、简单的方法,因此常被用来替代生物活体实验研究[9]。近年来有很多通过体外模拟胃肠道消化过程评价食物消化特征的研究。顾浩峰等[10]研究表明羊奶婴儿配方奶粉中的蛋白质在体外模拟消化过程中胃、肠消化率均显著高于牛奶配方奶粉和全脂羊奶粉。WANG等[11]对重组人乳铁蛋白的体外模拟胃肠环境中稳定性研究表明,在体外模拟人体胃肠环境中重组人乳铁蛋白易被降解消化。杜芬等[12]发现体外模拟胃肠消化过程中鳕鱼源金属螯合肽氨基酸组成不变,空间构象发生改变,钙铁离子螯合能力变化不大,具有很高的消化耐受性。因此体外模拟胃肠消化可以很好地评价食物真实的消化特征,具有良好的现实意义。
本文设计螺旋藻肠内营养制剂,通过测定螺旋藻和螺旋藻肠内营养制剂的氨基酸含量和构成,以及螺旋藻和螺旋藻肠内营养制剂的消化速率和消化程度,评价和判定其营养特征。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器螺旋藻冻干粉惠赠自上海绿鼎生物科技有限公司,胃蛋白酶(效价比1:10 000)购自Sigma-Aldrich中国,胰蛋白酶(效价比1:250)购自Genview中国,其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
主要仪器包括:L-800型氨基酸分析仪(日立仪器有限公司,中国),Mini PRESS-ⅡSF型桌上压片机(Rimek CO., India),Kjeltel2300型全自动凯氏定氮仪(FOSS CO, Danmark),UV1102紫外可见分光光度计(天美科学仪器,上海有限公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 螺旋藻营养制剂制备自制螺旋藻肠内营养(Enteral Nutrition, EN)制剂按总量100 g计算,以人体所需求的营养以及代谢特性[13],设计出糖尿病人需要用的螺旋藻营养制剂,每100 g糖尿病人EN粉剂能量≤1980 kJ,糖尿病患者的摄取能量值,按照我国健康人群也即体质量65 kg、身高170 cm,从事轻度体力劳动的健康人群所对应的每日推荐摄入量能耗值,即8 151 kJ/d,另总能量中55%~65%的能量为碳水化合物, 脂肪供能需在总能量的20%~30%,其他组分的添加参照《食品安全国家标准特殊医学用途配方食品通则》[14]。调节螺旋藻的添加量,设计出3种剂量的肠内营养制剂,分别是螺旋藻肠内营养制剂A(Spirulina enteral nutrition powder A, SENA)、螺旋藻肠内营养制剂B(Spirulina enteral nutrition powder B, SENB)、螺旋藻肠内营养制剂C(Spirulina enteral nutrition powder C, SENC)。用桌上压片机压成质量(1.0±0.1) g、中心厚度为5.0~7.0 mm的片剂。螺旋藻肠内营养制剂的组成成分见表 1。
参考BARTOVA等[15]的方法并稍有改动。蛋白质水解方法:称取螺旋藻和SENA、SENB、SENC样品各1 g,放于安瓿瓶中,并分别加入4 mL 6 mol / L的盐酸溶液,将安瓿瓶置于0 ℃冷冻3~5 min后取出,抽成真空后填满氮气并密封,每个样品密封3 min后取出,置于110 ℃的恒温干燥箱内水解22 h,将样品取出冷却至室温后过滤,滤液放在80 ℃水浴中蒸发,所得干物质用去离子水溶解并定容至10 mL,用0.54 μm的微孔滤膜过滤,得到样品液用氨基酸分析仪测定。
1.2.3 氨基酸评分和化学评分的方法采用FAO/WHO氨基酸评分(Amino acid score, AAS)标准模式[16]和中国预防医学科学营养与食品卫生研究所提出的全鸡蛋蛋白模式[17]进行评分,AAS和化学评分(Chemical score, CS)按以下公式计算:
式中:AAS为采用FAO/WHO氨基酸评分;ms为受试蛋白质中某氨基酸的含量;mFW为FAO/WHO评分模式下参考蛋白质中同种氨基酸的含量。
式中:CS为采用FAO/WHO化学评分;ms为受试蛋白质中某氨基酸的含量;me为参考蛋白质(全鸡蛋)中同种氨基酸的含量。
1.2.4 体外模拟胃肠消化方法根据JOVANÍ等[18]和陈佳捷等[19]的方法,分别称取3 g螺旋藻和SENA、SENB、SENC悬浮于300 mL pH 2.5的HC1溶液(0.5 mo1/L)形成10 g/L的溶液,置于37℃水浴预热处理3~5 min; 然后以酶:底物为1:50加入胃蛋白酶,缓慢振动,在不同的时间(0 min、15 min、30 min、60 min、120 min、180 min)取样,所取的样品用1 mol/LNaOH调节至pH 7.0以中止消化反应。将上述消化液调节pH至中性,加入适量胰蛋白酶,以酶:底物为1:50,再分别在不同消化时间(0 min、15 min、30 min、60 min、120 min、180 min)取样分析。每次取10 mL不同消化液,5 000 r/min离心10 min后,倒出上清液,用于氨基酸分析。
1.2.5 氮释放量的测定(TCA-NSI法)参考GEA等[20]方法在不同消化时间(0 min、15 min、30 min、60 min、120 min、180 min)分别取10 mL的不同消化液加入10 mL的10%TCA,于8 000 r/min离心30 min后,倒出上清液。沉淀部分用10 mL的10%TCA洗涤,同条件下离心,得TCA不溶组分。用凯氏定氮法测样品总氮和TCA不溶性氮含量。消化过程氮释放量(%)由下式计算而得:
式中:N为氮释放量(%),Nt为消化t时的TCA不溶性氮(mg);N0为样品中的TCA不溶性氮(mg);Ntot为样品的总氮量(mg)。
以上实验均重复测定3次,取平均值分析。
2 结果 2.1 螺旋藻和螺旋藻肠内营养制剂的氨基酸组成分析螺旋藻和SENA、SENB、SENC 4种样品的氨基酸组成分析结果列入表 2。
表 2显示,螺旋藻含有18种氨基酸,其中亮氨酸Leu、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu含量较多,而色氨酸Trp、半胱氨酸Cys、组氨酸His的含量较少。必需氨基酸甲硫氨酸Met、赖氨酸Lys、亮氨酸Leu、缬氨酸Val、异亮氨酸Ile、苏氨酸Thr、苯丙氨酸Phe和色氨酸Trp分别占螺旋藻的1.62%、3.13%、5.52%、3.97%、3.54%、3.14%、2.80%和0.84%,总必需氨基酸含量为24.53%。
螺旋藻粉、SENA、SENB、SENC中必需氨基酸分别占总氨基酸含量的40.26 %、38.79%、38.59%和38.30%,合乎WHO /FAO必需氨基酸占总氨基酸比例40%左右为优的标准。螺旋藻粉、SENA、SENB、SENC必需氨基酸与非必需氨基酸质量之比分别是67.40%、63.38%、62.86%和62.09%,超过了WHO/FAO提出的参考蛋白模式中必需氨基酸与非必需氨基酸之比为0.6的模式。螺旋藻粉、SENA、SENB、SENC的氨基酸分数优于FAO/WHO的标准蛋白模式。
与小球藻相比较,螺旋藻中总氨基含量略高于小球藻,必需氨基酸含量与小球藻接近。一些重要氨基酸明显高于小球藻。由此可得,螺旋藻中所含有的氨基酸种类齐全,必需氨基酸含量成比例,是较理想的优质蛋白质源,螺旋藻的3种肠内营养制剂氨基酸构成合理,符合FAO/WHO模式,可以作为优质的营养供给来源。
2.2 螺旋藻粉和SENA、SENB、SENC的AAS,CS分析螺旋藻粉和SENA、SENB、SENC的AAS值计算结果列入表 3,螺旋藻粉中苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、蛋氨酸+赖氨酸、色氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸含量均高于FAO/WHO的标准模式; SENA、SENB、SENC中亮氨酸、蛋氨酸+赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、色氨酸、缬氨酸以及苏氨酸均低于FAO/WHO的标准模式。
螺旋藻粉和SENA、SENB、SENC的CS值列入表 4。与全鸡蛋蛋白质的标准模式相比,螺旋藻粉中异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸+赖氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、苏氨酸以及缬氨酸含量均高于其模式。与FAO/WHO的标准模式相比,SENA、SENB、SENC中异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸+赖氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、色氨酸、苏氨酸以及缬氨酸均低于其模式。
当以FAO / WHO的氨基酸评分标准模式AAS为参考量时,螺旋藻的第一限制氨基酸为赖氨酸,第二限制氨基酸为亮氨酸,SENA、SENB、SENC的第一限制氨基酸均为色氨酸,第二限制氨基酸为缬氨酸。当以化学评分CS为参考标准时,螺旋藻的第一限制氨基酸为赖氨酸,第二限制氨基酸为色氨酸。SENA、SENB、SENC的第一限制氨基酸均为色氨酸,第二限制氨基酸为缬氨酸。两种评分模式下,螺旋藻的第一限制氨基酸均为赖氨酸,SENA、SENB、SENC的第一限制氨基酸均为色氨酸。
2.3 体外模拟胃肠消化特性和氮释放量曲线模拟胃肠液消化是根据人体胃肠消化液的主要成分及消化环境,在体外建立模拟胃肠消化体系。螺旋藻和螺旋藻肠内营养制剂在37 ℃,0.5 mol/L HCl溶液中,分别使用胃蛋白酶和胰蛋白酶分两阶段各消化3 h,得到消化特性曲线如图 1。
图 1可以看出前3 h的胃蛋白酶消化阶段,在螺旋藻粉、SENA、SENB、SENC的消化液中,随着消化时间的增加8种必需氨基酸检出数量都缓慢上升,在3 h时达到最大值分别为207.6、66.8、62.4和64.2 mg/100 mL,分别占初始原料中总必需氨基酸含量的84%、94%、89%和92%;其中必需氨基酸总数的检出量螺旋藻粉高于3种肠内营养制剂,而3种肠内营养制剂之间的必需氨基酸总数差异不大。在进入胰蛋白酶消化阶段螺旋藻粉及3种肠内营养制剂的8种必需氨基酸检出量数值无较大波动,均趋于平缓。但是,3种SENA、SENB、SENC必需氨基酸相对数量在模拟胃肠消化阶段都显著(P<0.05,数据未显示)高于螺旋藻粉的必需氨基酸相对数量。结果显示,SENA、SENB、SENC的必需氨基酸水解效率高于螺旋藻粉。
螺旋藻粉、SENA、SENB、SENC在体外模拟消化过程中的氮释放量变化如图 2所示,由图 2可知在消化过程的初期,3种肠内营养制剂的消化速度上升很快高于螺旋藻粉,并且3种制剂的氮释放量差别不大;在之后的胰蛋白酶消化阶段4者都趋于平缓并且都能达到90%左右,螺旋藻及其肠内营养制剂均能被很好地消化吸收,而肠内营养制剂又显著优于螺旋藻粉(P<0.05)。与大豆乳清蛋白的体外模拟消化相比[22],螺旋藻粉、SENA、SENB、SENC等4种样品都明显高于大豆乳清蛋白(50%)。
在0~360 min的胃消化阶段和肠消化阶段,螺旋藻粉、SENA、SENB、SENC处理间存在差异显著(P<0.05),这种差异显著性,随着胃消化或肠消化的进行,SENA、SENB、SENC 3者趋于一致,在360 min体现出螺旋藻粉与SENA、SENB、SENC的差异显著性(P<0.05)。
3 讨论螺旋藻作为优良的普通食品,被认为是地球上发现的营养最均衡、最丰富的天然食品,世界卫生组织和联合国粮农组织推荐螺旋藻为21世纪人类最理想食品和最佳保健品[2]。基于螺旋藻的蛋白质含量,设计成功了3种类型糖尿病特殊医学用途配方食品(Food of the Special medical purpose for Diabetes Mellitus Patients,FSDMP),通过能量计算,每100 g螺旋藻糖尿病FSDMP的能量大于295 kJ且小于1 980 kJ,其中60%的能量来自碳水化合物,28%的能量来自脂肪,血糖指数低于55,膳食纤维的含量超过0.2 g/100 kJ,能达到《食品安全国家标准特殊医学用途配方食品通则》[14]关于糖尿病特殊医学用途配方食品的要求,所以螺旋藻能作为特殊医学用途配方食品的组件或构成成分,特别是螺旋藻含有的多种功效成分,标志着它是特殊医学用途配方食品的优良组件。
将螺旋藻与肠内营养制剂或特殊医学用途配方食品的其他蛋白质配合,能调整各种必需氨基酸的比例,制备获得螺旋藻肠内营养制剂A、B、C,分别是SENA、SENB、SENC。在模拟胃消化过程,螺旋藻粉有比SENA、SENB、SENC更高的必需氨基酸含量(mg/mL),例如胃消化60 min,SENA、SENB、SENC的必需氨基酸含量为25~32 mg/mL,螺旋藻粉为80 mg/mL。螺旋藻粉必需氨基酸含量是SENA、SENB、SENC的2.5~3.2倍。螺旋藻粉加入到SENA、SENB、SENC,有利于其胃消化。在肠消化阶段,螺旋藻粉也有比SENA、SENB、SENC更高的必需氨基酸含量(mg/mL),例如胃消化结束后进入肠消化60 min,SENA、SENB、SENC的必需氨基酸含量是55~60 mg/mL,螺旋藻粉是182 mg/mL。螺旋藻粉必需氨基酸含量是SENA、SENB、SENC的3.0~3.3倍。螺旋藻粉加入到SENA、SENB、SENC,有利于其肠消化和吸收。研究结果清楚地表明,螺旋藻作为肠内营养制剂或特殊医学用途配方食品的优良组件,在体外模拟胃肠消化体系,以必需氨基酸含量为标志,螺旋藻提高了SENA、SENB、SENC的胃消化、肠消化与吸收。
SENA、SENB、SENC 3种特殊医学用途配方食品的氮释放量为88.09% ~ 92.24%。胃消化阶段,螺旋藻粉的氮释放量低于SENA、SENB、SENC,例如,同样是胃消化60 min,螺旋藻粉的氮释放量是25%,SENA、SENB、SENC的氮释放量是59%~65%;胃消化结束后进入肠消化60 min,螺旋藻粉的氮释放量85%接近于SENA、SENB、SENC的90%~95%。蛋白质从螺旋藻藻体和SENA、SENB、SENC被胃蛋白酶(胃消化体系)或胰蛋白酶(胰蛋白体系)持续地溶解出来,体现于氮释放量的高或低。研究结果表明,在体外模拟胃肠消化体系,以氮释放量为标志,螺旋藻提高了SENA、SENB、SENC的胃、肠消化速率(见表 5)。
目前我国的肠内营养制剂有:①氨基酸型、短肽型;②整蛋白型;③组件式肠内营养剂。螺旋藻肠内营养制剂属于整蛋白型肠内营养制剂,该类肠内营养制剂以整蛋白或蛋白质游离物为氮源,渗透压接近等渗,口感较好,适于口服,亦可管饲,适于胃肠功能正常的患者[23]。研究结果显示,螺旋藻作为肠内营养制剂的辅助氮和其他成分的供给源,能制备合乎营养需求和满足产品质量标准的特殊医学用途配方食品和全营养配方食品。
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2. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Shanghai 201306, China;
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