2. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306
性别分化能决定生物发育成雄性或者雌性的进程。在脊椎动物,性别分化简单地分为两个阶段。在初级阶段,性腺分化成既不是精巢也不是卵巢的阶段,这个阶段不受某个关键基因的调控;在性成熟阶段,由于某个环境因素或多个基因的作用,性腺开始形成特定的性状[1]。
过去十年,斑马鱼作为多种实验的载体已经成为一种具有很高研究价值的模型[2-3],它具有一些哺乳类和无脊椎动物的优点。斑马鱼的生殖间隔很短,同时可以产生大量的后代并进行筛选工作;有着先天和适应性的免疫系统;在进化上更趋近于哺乳动物,和一些哺乳动物比如人类和小鼠具有同源基因[4]。
斑马鱼类在性别分化的过程中展现出一定的可塑性,同时有着很强的调节机制[5]。在幼鱼时期,所有单独的个体会首先发育成一种包含未成熟卵母细胞的未分化的类卵巢性腺,在20~30天时,大约一半斑马鱼个体中未成熟的卵母细胞会发育成卵巢,而剩下的个体中,未成熟的卵母细胞凋亡并且发育出精巢的形态学特性[6]。
许多文献报道了Sox9基因是脊椎动物性腺分化的关键基因[7-9], 在斑马鱼性腺分化过程中,FSH凭借第二信息因子cAMP以及多种激酶调控Sox9基因和AMH。Sox9基因表达调控使类卵巢性腺分化形成精巢和卵巢[6],Sox9有两种不同的转录本Sox9a和Sox9b。17天时,部分斑马鱼性腺中Sox9a与Cyp19a1a共同作用于类卵巢,第21~25天时Sox9a激活AMH,AMH抑制Cyp19a1a的表达,从而卵母细胞凋亡然后形成精细胞;另一部分斑马鱼性腺中Sox9b与Cyp19a1a共同作用使类卵巢性腺向成熟卵巢方向发展[10]。而Sox9a表达于斑马鱼的脑部、肌肉、精巢和鱼鳍,在成熟卵巢中不表达。
斑马鱼作为模式生物因个体太小,体内性腺用药十分困难。显微注射作为在生物研究中的一种常用的技术,尽管在斑马鱼腹部注射和鱼卵注射中广泛应用[11-12], 也比斑马鱼卵和胚胎的浸泡效果好得多[13]。但目前没有成熟的斑马鱼体内性器官给药的报道。本文试图建立一种简便的斑马鱼性腺体表投影给药途径。
1 材料与方法 1.1 实验材料和试剂与仪器AB品系为本实验室自养的成年斑马鱼(MS-222 100×麻醉剂,阿尔辛蓝染料,葡聚糖德克萨斯红荧光染料和lipohigh脂质体高效转染试剂均购置于上海生工生物技术公司)。试剂与仪器包括毛细吸管glass capillary(World Precision Instruments,美国)、显微注射仪PV830 Pneumatic PicoPumpTM(Olympus,日本)、荧光显微镜SteREO Discovery V12(Carl Zeiss, 德国)、Anti-Sox9a抗体(Abcam,HK)和anti-myc抗体(北京全式基因生物技术公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 外源基因的准备Sox9a-myc质粒由实验室制备。简言之,将Sox9a基因编码区CDS的全长序列插入到M2表达载体(pEasy-blunt M2 expression kit-CM211-01, 北京全式基因生物公司)中,PCR扩增和测序验证Sox9a为正向插入并与Myc标签蛋白编码框正确连接。
1.2.2 注射设备的准备使用拉针仪将毛细玻璃管拉成合适大小的注射针,使用镊子将针尖开口,调节注射设备的气压,使内外气压达到平衡。
1.2.3 斑马鱼解剖和雄性斑马鱼模式图绘制在解剖镜下对成年斑马鱼进行解剖,了解斑马鱼内脏结构,量取斑马鱼体长和体内器官并拍摄照片,用Photoshop测量照片中斑马鱼重要内脏的比例,并根据体长计算出各个距离的实际长度,绘制雄性斑马鱼模式图。
1.2.4 阿尔辛蓝染料显微注射对镊子、剪刀用酒精进行消毒,将装液后的针头的游离端安在连接器上,然后旋紧连接器以固定针头。在带有刻度的载玻片中央滴加一滴油滴,用镊子夹断部分针尖,将染料注射进油滴,观察单次注射量并进行相应调整,把100×MS-222与水按1:50比例混合,将待注射的斑马鱼转移至烧杯,当斑马鱼鳃翕动缓慢,身体被镊子触碰反应微弱时转移至注射台,在斑马鱼头部滴加烧杯中的麻醉剂。用有凹槽的泡沫板放置被麻醉的斑马鱼,根据模式图大致确定性腺位置,用镊子拔去该部位的鳞片,用剪刀或小刀刮开一个小口,再用镊子或剪刀将小口扩大至1~2 mm,找到性腺,注意不要用力过大以免挤压内脏影响斑马鱼注射后的存活。将针头扎入性腺,踩下踏板注射阿尔辛蓝染料1 μL。注意不要针头扎得过深以免刺破鱼鳔导致斑马鱼死亡。
1.2.5 外源基因注射将浓度为450 ng/μL质粒Sox9a与葡聚糖德克萨斯红染料和lipohigh脂质体转染试剂按照2:1:2的比例混匀,按照上述方法分别注入2 μL到成年雌鱼与雄鱼的体内,根据斑马鱼细胞转染质粒后在48 h后蛋白表达量最高,因此尝试2 d后解剖斑马鱼,并使用荧光显微镜对性腺部分拍照观察。
解剖注射2 d后的斑马鱼性腺,提取蛋白,并进行Western Blot实验验证蛋白表达[14-15]。
2 结果 2.1 雄性斑马鱼模式图对10条成年斑马鱼进行解剖,并对体长和体内主要器官,特别是性腺大小进行测量,计算平均值并确定性腺的相对位置。因为卵巢体积较大,精巢则相对偏小,因此主要对精巢的位置进行分析计算。雄性斑马鱼平均体长(3.87±0.10) cm,宽(0.76±0.05) cm。经过解剖观察,性腺位于斑马鱼体侧皮肤下中间位置,为图 1中T所标注器官,平均长度为(0.82±0.06) cm,宽(0.15±0.02) cm。注射位点的体表投影位置应位于胸鳍上端水平线与腹鳍前端竖直线交叉处(红色虚线)上方约0.1 cm处,图 1中红点标注体外投影显微注射进针位置,相比细小精巢,卵巢体积大,采用精巢注射途径也十分有效。
为了证明注射试剂能够作用整个性腺,按照解剖实验结果对雌性成年斑马鱼进行染料注射,蓝色物质为阿尔新蓝染料。如图 2,48 h后解剖观察,结果发现在注射位点周围聚集有部分阿尔新蓝染料,多数已经扩散并包围整个卵巢。精巢不同于卵巢,因为体积较小,阿尔新蓝渗透到精巢和鱼鳔。说明注射试剂会随着时间弥散至整个性腺。
为了确认混合试剂进入性腺,在外源基因注射后观察斑马鱼性腺中葡聚糖德克萨斯红荧光标记的细胞。图版所示在外源基因注射48 h后,在卵巢和精巢的注射位点都出现了红色荧光,并且在精巢下部和卵巢间隙也出现红色荧光,证明混合试剂已经扩散至整个性腺。精巢因为体积较小的缘故,荧光部分标记了性腺四周部分器官。
相对未注射实验组,Sox9a蛋白在成熟卵巢中不表达。Myc蛋白为所构建M2表达载体上的标签蛋白,结果显示抗Myc抗体识别Sox9a-Myc融合蛋白(大小为110 ku),而抗Sox9a抗体识别Sox9a-Myc(110 ku)。未注射卵巢在110 ku位置并不显示表达Sox9a-MYC蛋白,可以证明外源基因注射的卵巢同时表达Sox9a-Myc蛋白(图 3)。
体外注射一直被运用进行多种实验,有文章报道成功使用体外注射Cas9/gRNA到斑马鱼卵的方法来进行基因编辑[16]和注射TALEN mRNA到有爪蟾蜍卵母细胞进行基因敲降[17]的实验。有研究显示,相比浸泡实验斑马鱼胚胎在迟钝爱德华菌病原体浸泡实验中感染率在25%~75%之间,而注射实验感染率为100%,因此浸泡实验具有局限性,注射实验则相比更具有优势[18]。
本实验是为了研究斑马鱼活体外源基因性腺注射方法的可行性。不同于以上体外注射实验,此实验首先检验了外源基因能否准确注射进入并作用整个斑马鱼性腺,其次验证了外源基因能否在斑马鱼性腺内顺利表达。为了建立斑马鱼体外性腺定点注射方法,首先采用解剖的方法获取斑马鱼相应器官的位置和比例,然后绘制草图与成年斑马鱼按照比例进行比对,确定性腺定点注射的位置位于胸鳍上端水平线与腹鳍前端竖直线交叉处上方约0.1 cm处。体外注射斑马鱼外源基因混合物,荧光结果表明注射位置正确,并大部分位于相应器官内,然后采取Western Blot的方法验证外源基因的表达。如果进行多点注射,则以图 1所示位置为中心,水平线向右旋转15°前后0.1 cm位置进行注射。
虽然此方法还有许多改进地方,体外注射的效果因实验者熟练程度与手法而有差异,但可以为斑马鱼体外给药途径,同时也为体内研究斑马鱼性腺转化过程中基因调控提供了方便。
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