2. 上海海洋大学 农业部鱼类营养和环境生态研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis,简称河蟹),是我国重要的淡水养殖蟹类之一,据统计2015年全国河蟹总产量高达82.3万t左右[1]。池塘养殖河蟹通常在9月底至10月初完成生殖蜕壳,此后性腺开始快速发育,至11—12月性腺发育基本达到成熟[2-3]。研究表明,河蟹雌雄个体的性腺发育规律及生殖系统组成存在较大差异[4-5],其中,雄蟹的生殖系统相对较为复杂,主要由精巢、输精管和副性腺组成[6-7]。先前有研究表明,河蟹雄体精巢、输精管和副性腺在精子发生和交配过程中起着不同的生理功能[7-8],推测这些部位的生化组成也可能存在一定的差异以行使不同的功能,迄今为止仅王群等[9]在这方面进行了部分报道,尚未见这方面全面系统的研究报道。
甲壳动物成体生殖系统的发育状况及其生化组成对甲壳动物的交配和生殖具有重要作用[10-12]。雄体生殖系统的生化组成是评价亲本质量的重要指标之一[13],先前研究表明河蟹雄体生殖系统中主要为蛋白和脂肪,碳水化合物含量相对较低[14],但是均没有将精巢、输精管和副性腺分开测定,这不利于进一步研究和理解河蟹雄体亲本营养生理学。此外,河蟹副性腺是雄性生殖系统最大的组成部分,也是最主要的可食组织,因此研究雄体生殖系统各部位的生化组成可为河蟹雄体的营养价值评价提供基础资料[15-16]。鉴于此,本文测定和比较了成熟河蟹雄体生殖系统各组成部分指数、常规生化成分、脂肪酸和氨基酸组成,以期为河蟹雄体亲本营养学研究、亲本培育、亲本饲料开发和营养价值评价提供参考信息。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用成熟雄蟹取自上海海洋大学崇明养殖基地,池塘面积为2 000 m2左右,为隐蔽河蟹在池塘内种植伊乐藻;3月中旬每个池塘放养平均规格为7 g左右的扣蟹,放养密度为10 000只/hm2,雌雄比例为1:1。养殖期间,每天定时投喂配合饲料,观察食台残饵和水温情况来调整投喂量。随着伊乐藻的生长,逐渐加深水位,8月份水位维持在1~1.2 m,保持塘内伊乐藻的合理密度,定期检查水体温度、pH、溶氧、氨氮和亚硝酸盐含量,水质指标控制在安全范围内。定期换水,每隔15 d使用聚维酮碘消毒1次;养殖时间从3月份持续至12月份。于2015年11月25日,捕捞成熟雄蟹30只(体质量为110 ~130 g),活体运输到上海海洋大学营养繁殖实验室用于后续实验。
样品采集过程中,首先用吸水纸擦干河蟹体表水分,用电子天平称体质量(精确度= 0.01 g);解剖取出肝胰腺和完整生殖系统,数码相机拍照后准确称总体质量,用于计算雄体生殖系统指数(reproductive system index,RSI)。然后从生殖系统解剖取出精巢、输精管和副性腺,所有样品分装于自封袋后于-40 ℃冰箱中保存备用。RSI、精巢指数(testis index,TI)、输精管指数(vas deferens index,VDI)和副性腺指数(accessory gland index,AGI)的计算公式如下:
式中:RSI 为生殖系统指数;TI为精巢指数;VDI为输精管指数;AGI为副性腺指数;W1, W2, W3, W4和W分别为生殖系统、精巢、输精管、副性腺质量和总体质量。
1.2 实验方法 1.2.1 常规生化成分分析样品分析前,随机将10只成熟雄蟹的精巢、输精管和副性腺分别合并,因此雄蟹生殖系统每个部位均有3个重复样品。采用冷冻干燥法将样品冻干并测定其水分含量,然后根据AOAC[17]的标准方法测定雄蟹各组成部分粗蛋白(凯氏定氮法);按FOLCH等[18]的方法,采用V(氯仿):V(甲醇)= 2:1提取总脂并测定其含量;采用苯酚-硫酸法测定碳水化合物含量,标样为葡萄糖[19]。
1.2.2 脂肪酸分析脂肪酸分析依据WU等[13]的方法。采用14%的三氟化硼-甲醇溶液甲酯化处理总脂,旋转蒸发后进行脂肪酸分析。使用Agilent-6890气相色谱,毛细管柱型号为Omegawax320(30.0 m×0.25 mm,USA),进样口和FID检测器的温度均为260 ℃,起始柱温为140 ℃,程序升温到240 ℃,直到所有脂肪酸全部出峰。脂肪酸含量的计算采用面积百分比法。每组样品均重复测定3次。
1.2.3 氨基酸分析总氨基酸参考CHEN等[20]的方法进行测定。取0.05 g左右冻干后的样品,采用6 mol/L盐酸,在110 ℃下水解24 h,过滤后取200 μL水解产物到试管,采用氮气吹干,样品加入3 mL 0.02 mol/L盐酸振荡,溶解。取1 μL溶解液用于氨基酸分析,使用德国赛卡姆公司S-433D氨基酸自动分析仪进行测定。用氢氧化钠水解法进行色氨酸测定[含有5% SnCl2 (w/V)]在110 ℃条件下水解20 h,详细水解步骤和测定方法参考CHEN等[20]的报道。参考SPINDLER等[21]方法,采用过蛋氧化水解法测定蛋氨酸和半胱氨酸含量。
1.3 数据分析及统计采用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计分析,所有数据均以平均值±标准误差表示。采用Levene法对所有数据进行方差齐性检验,当不满足齐性方差时对百分比数据进行反正弦或平方根处理。采用ANOVA对实验数据进行方差分析,用Duncan氏法进行多重比较,取P<0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 河蟹成熟雄体的生殖系统组成本实验中,成熟雄体的生殖系统指数(RSI)为2.62%±0.12%,其生殖系统组成如图 1所示,主要由精巢(T)、输精管(VD)和副性腺(AG)组成。生殖系统各部分指数见图 2,副性腺指数(AGI)显著高于精巢指数(TI)和输精管指数(VDI)P<0.05,而TI与VDI之间差异不显著(P>0.05),其中AGI、TI和VDI分别为1.81%、0.36%和0.45%。
河蟹雄体生殖系统中的常规生化成分如表 1所示。精巢中的水分、总脂和总碳水化合物含量均显著高于输精管和副性腺(P<0.05),而输精管与副性腺间的水分和总碳水化合物含量均无显著性差异(P>0.05),输精管中总脂含量显著高于副性腺(P<0.05)。粗蛋白含量以副性腺最高,输精管次之,精巢最低(P<0.05)。
雄蟹生殖系统中的脂肪酸组成见表 2。就饱和脂肪酸(SFA)而言,生殖系统的3个组成部分中的SFA主要为C16:0和C18:0,除C15: 0和C17: 0外,大部分SFA和总饱和脂肪酸(ΣSFA)含量均无显著差异(P>0.05),含量均在19%~21%之间。就单不饱和脂肪酸(MUFA)而言,C16:1n7和总单不饱和脂肪酸(∑MUFA)含量均以输精管最高,副性腺次之,精巢最低,而C18:1n7含量则以副性腺最高(P<0.05),各部分中的其余MUFA含量均无显著差异(P>0.05)。就多不饱和脂肪酸(PUFA)组成而言,除了C20:3n3、C20:4n6、C22:6n3、总多不饱和脂肪酸(∑PUFA)、∑n-6PUFA和总高度不饱和脂肪酸(∑HUFA)含量均以精巢最高外(P<0.05),各部分中的其余PUFA、∑n-3PUFA和n-3/n-6比例均无显著差异(P>0.05)。
雄蟹生殖系统的氨基酸组成如表 3所示,除蛋氨酸(Met)和精氨酸(Arg)以外,各部分中的其余氨基酸含量均有显著性差异(P<0.05);其中异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)和总氨基酸(TAA)含量均以副性腺最高,输精管次之,精巢最低(P<0.05),而赖氨酸(Lys)、缬氨酸(Val)和组氨酸(His)含量则以输精管最高,副性腺次之,精巢最低(P<0.05)。
成熟雄蟹的生殖系统构成相对复杂,主要由精巢、输精管和副性腺3部分组成,通常所说的河蟹雄体生殖系统指数是指这3个组成部分的总质量占体质量的百分比[5, 22]。本研究中,11月下旬成熟雄体的副性腺指数(AGI=1.81%)显著高于精巢指数(TI=0.36%)和输精管指数(VDI=0.45%)。河蟹雄体的生殖系统发育具有明显的季节性变化,通常在生殖蜕壳前(6—8月),池塘养殖雄蟹精巢和输精管的发育速度较快同时伴随着精子的发生,但副性腺较小,8月底副性腺增长已经非常明显,AGI约为0.5%左右,副性腺体积的显著增加主要发生在生殖蜕壳后(9—11月)[3];副性腺体积的显著增加可能是为了满足大量精荚的存储和此阶段的生理功能,如副性腺蛋白参与了精荚破壁、精子获能和顶体反应等[23];因此在11月下旬成熟河蟹雄体的副性腺指数显著高于精巢指数和输精管指数。
3.2 河蟹成熟雄体生殖系统中常规生化成分常规生化成分组成及其含量可在一定程度上反映甲壳动物性腺发育程度和营养物质的储备情况[24]。在本研究中,成熟雄蟹精巢中的总脂含量显著高于输精管和副性腺,其原因可能是由于11月下旬河蟹精巢中的脂类随配子的不断形成而大量积累有关[25, 27]。此外甲壳动物的精子发生和形成过程都是在精巢内产生和进行的,大量研究证实,脂类物质是甲壳动物生殖过程中的主要能量物质,同时也是能量贮存的主要形式[10],精巢可能需要大量的脂类以保证其正常的生理功能。此外,脂类(如胆固醇)也是甲壳动物性激素的生物合成前体物质,而性腺快速发育期是性激素形成的高峰期[26],因此在精巢中积累大量的总脂可能也是为了保证性腺发育和生殖行为的顺利完成[27]。就生殖系统粗蛋白含量而言,副性腺和输精管中粗蛋白含量最高,精巢中含量最低,这与王群等[9]对河蟹生殖系统生化组成的研究结果相似。副性腺是雄蟹生殖系统中不可分割的重要部分,成熟河蟹的副性腺非常发达。有研究表明,雄蟹的副性腺分泌蛋白对精荚具有溶解作用,在河蟹受精过程中精荚经过副性腺时与精液和副性腺分泌蛋白一起由射精管注入到雌蟹的纳精囊内,精荚经过副性腺蛋白的作用很快破裂释放出精子,同时雌蟹的卵巢收到刺激产生卵子与释放出的精子结合完成受精[23, 28]。此外副性腺蛋白对精子活力、精子获能和受精能力均具有显著影响[29-30],这暗示了成熟雄蟹副性腺中储备高含量的蛋白可能是为了适应其生理功能。此外,在输精管中含有大量精浆和精荚,而精荚壁的主要成分是黏多糖蛋白,说明输精管中较高的蛋白含量可能是为了确保精荚结构的完整性和正常的生理功能。本研究中,总碳水化合物含量以精巢最高,输精管次之,副性腺最低。先前的研究表明碳水化合物作为甲壳动物精子代谢的主要能量物质之一[31-32],精巢在快速发育阶段总碳水化合物含量明显升高,说明该时期对糖类物质的需求较高,这也进一步证实了糖类物质对雄性生殖系统发育的重要性。
3.3 河蟹成熟雄体生殖系统中的脂肪酸和氨基酸组成生殖系统中的脂肪酸组成可作为甲壳动物生殖性能优劣的评价指标之一[33-34]。本研究结果显示,C18:1n7和∑MUFA均以副性腺最高,精巢最低,其余MUFA均无显著差异,而C20:3n3、C20:4n6 (ARA)、C22:6n3 (DHA)、∑PUFA、∑n-3PUFA,∑n-6PUFA和∑HUFA则以精巢最高,副性腺最低。精巢中高含量的ARA、EPA等HUFA可能是用于转化增加前列腺素水平来促进精子的生成和维持精子活力[35-36]。此外,有研究发现甲壳动物精巢中HUFA(主要是C20:5n3和C22:5n3)含量的显著增加可能与精子的流动性增强相关[37-38]。性腺中的ARA、EPA和DHA 3种脂肪酸对成体雄蟹生殖性能具有重要的影响[39],可能对精巢的生理作用更为突出。MUFA在副性腺中含量最高,精巢中含量最低,这可能因为MUFA用于供能优先于PUFA消耗导致精巢中MUFA含量较低[40-41],而副性腺中含量较高可能与MUFA在副性腺中的特定功能有关,其原因有待于进一步分析验证。
氨基酸是生物机体合成肽类激素、酶、性腺组织和配子等蛋白物质的重要原料[11],在水生动物的生殖性能方面起着重要作用[42]。本研究中,除蛋氨酸(Met)和精氨酸(Arg)以外,副性腺中的大部分氨基酸含量及氨基酸总含量显著高于精巢和输精管,这与其粗蛋白含量较高的结果相一致。这可能与副性腺的多种生理功能有关,先前的研究表明,副性腺蛋白在精荚破裂、精子获得和精子顶体反应等方面发挥着重要作用[8, 29],因此副性腺中储存较多的氨基酸可能为蛋白等分泌物的合成做储备。此外,在本研究中值得关注的是副性腺中脯氨酸含量明显高于其他氨基酸,有研究表明给凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)外源提供脯氨酸,可提高其免疫反应和抗氧化能力[42],因此副性腺中高含量的脯氨酸储备可为其生理功能正常发挥提供有力保障。目前关于雄蟹副性腺中的氨基酸的研究相对较少,特定氨基酸对应雄蟹生殖系统中的生物功能还有待于进一步研究。
综上,11月下旬池塘养殖成熟河蟹雄体副性腺指数(1.81%)显著高于精巢指数(0.36%)和输精管指数(0.45%);精巢中主要积累脂肪、碳水化合物、PUFA和HUFA,而副性腺中粗蛋白和大部分氨基酸含量较高。
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2. Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition of the Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
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