从20世纪70年代开始，我国近海生态系统的结构与功能发生着显著的变化，并影响到其生态服务功能^[1-2]。相关调查研究显示：自20世纪80年代以来，随着人类活动加剧和生态环境恶化，尤其近年来，大规模围填海工程、污染物入海等高强度人类活动致使近海生态环境急剧恶化，水体富营养化程度加剧也使得赤潮、绿潮频繁暴发^[3-4]。赤潮、绿潮频繁暴发改变了海洋原有生态环境，造成了生态系统紊乱，已经产生了诸如鱼类栖息地减少、碎片化或消失，湿地功能退化，仔鱼分散输运动力学基础剧烈变动，饵料基础失衡，产卵场和育幼场环境污染严重与质量退化^[5-7]等问题，影响了近海鱼类种群的繁殖发育，造成近海鱼类资源衰退，鱼类种类和数量呈现显著下降趋势，鱼类多样性也大幅下降。

由浒苔导致的绿潮主要发生在河口、内湾、泻湖以及城市密集、富营养化程度相对严重的海域，经常是多年连续暴发。根据海水污染的成分分析，海水富营养化是我国近海浒苔绿潮暴发的主要原因^[8-10]。自2009年在江苏如东县沿岸堤坝和紫菜养殖筏架上发现浒苔绿藻以来，该地区连续6年暴发了不同程度和规模的绿潮^[11-12]，为了降低浒苔绿潮给该海域环境带来的危害，当地采用了人工打捞的方式对该海域的浒苔藻类进行打捞。一般认为，暴发绿潮的生态环境并不适合鱼类生存和大量产卵繁殖。然而，2015年5月初在该地收割浒苔的过程中，我们发现了浒苔上附着了大量的黏性鱼卵，这一不寻常的现象值得关注。究竟是一种还是多种鱼类在该环境下产卵繁殖?该现象对我国近海鱼类资源恢复有何启示?

DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行快速鉴定的技术，线粒体DNA的COI基因片段拥有长度适宜、进化速率慢及富含系统发育信息等特点，且大多数鱼类的COI基因能被通用引物所扩增，因此，通常选择COI基因作为条形码进行鱼类物种鉴定^[13-14]。本研究中，首先采用DNA条形码作为分子标记，对如东海域浒苔中所获鱼卵及成鱼尸体进行遗传学分析，鉴定浒苔中产卵鱼类有哪些种类；其次，浅要探讨该现象对近海鱼类资源的启示。

1 材料与方法 1.1 实验材料

2015年5月27日于江苏如东海域(121°42′N，32°32′E)采集鱼卵及成鱼。鱼卵是在该海域浒苔暴发范围内随机取自流刺网起网时带到船甲板的海藻团中，其数量极大，鱼卵之间通过韧性强的卵膜丝相互黏连，并缠绕在海藻上进行发育(图 1)，在海藻团中还发现数条已经腐烂无法辨认的鱼类尸体以及两尾可辨认形态特征的成鱼尸体。

将两尾成鱼尸体(酒精保存)和该海域随机选取的附着大量鱼卵的海藻团编号后带回实验室，取两尾成鱼背鳍下肌肉组织分别放入离心管中用95%酒精固定；同时将附着在海藻团上的卵块小心剥离，在每个编号藻团中随机取出一部分鱼卵用95%酒精固定；由于从鱼卵中提取DNA可能质量不高，再将各剩余附着鱼卵的海藻团分别放入鱼缸中孵化(模拟该时间如东近海的盐度和温度，设置孵化条件盐度为25~30，温度为20~24 ℃)。经过一周左右鱼卵先后孵化出来，将先期孵化出来的仔鱼分缸投喂饵料饲养，但是一周内皆相继死亡，因此在每个编号鱼缸随机选取一部分仔鱼用95%酒精固定，以便后续进行DNA提取。

1.2 DNA提取

两尾成鱼经鉴定为沙氏下鱼(Hyporhamphus sajori)，用前期已取的背鳍下肌肉组织，并与上述95%酒精固定的鱼卵、仔鱼中随机挑取的20粒鱼卵和20尾仔鱼，采用标准酚/氯仿法提取全基因组DNA，置于-20 ℃冰箱备用。

1.3 引物设计、PCR和序列测定

本实验选用的标记基因为COI基因片段，用于扩增COI基因片段序列的1对引物F: 5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′，R: 5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′^[15]。PCR反应体系25 mL，包括PCR Master Mix 12.5 μL(含MgCl₂、dNTP Mix和Taq酶)、上下游引物各1.0 μL (55 ng/μL)、DNA样品1.0 μL，用ddH₂O补足25 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min，扩增35个循环(94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测样品扩增情况，将扩增出目标片段长度PCR产物送至上海生物工程公司纯化和测序。

1.4 数据分析

用DNA Baser对生物公司的测序结果进行拼接、比对、人工校正，然后将序列输入GenBank中进行BLAST搜索，寻找同源序列。

将本研究获得的序列以及从GenBank中下载的同源序列，用MEGA6软件分析基因片段序列的变异位点^[16]；序列之间的遗传距离用Kimura双参数模型进行估算，系统进化分析采用Neighbor-joining (NJ)法，置信度估算采用Kimura双参数模型，重复数为1 000次。

2 结果

用DNA Baser软件包将PCR扩增测序后获得的20条仔鱼和20个鱼卵序列进行拼接、比对后发现各序列之间碱基并无差异，故在鱼卵、仔鱼序列中分别选取1条序列和GenBank中经BLAST搜索后下载得到8条颌针鱼目的高相似度同源序列以及两尾成鱼序列用DNAstar软件包进行拼接、比对后得到分析用12条554 bp的同源序列(表 1)。

2.1 COI基因片段序列之间的遗传距离

从采用Kimura双参数模型估算的鱼卵、仔鱼、成鱼与颌针鱼目鱼类基因片段序列间的遗传距离(表 2)可以看出：鱼卵、仔鱼、成鱼与沙氏下鱼(H. sajori)基因片段序列之间没有出现核苷酸替代(Nucleotide substitution)，其遗传距离为0；鱼卵、仔鱼、成鱼与间下鱼(H. intermedius)、台湾原尾颌针鱼(Strongylura leiura)、大西洋颌针鱼(S. marina)基因片段序列之间的遗传距离分别为11.9%~12.1%、24.9%~25.2%、24.7%~25.0%。

2.2 COI基因片段序列的聚类分析结果

用Kimura双参数模型构建鱼卵、仔鱼、成鱼与颌针鱼目鱼类COI基因片段序列NJ分子系统树(图 2)。节点处的数字为1 000次Bootstrap统计分析后的自引导值，表示对该支的支持百分比。NJ分子系统树明显聚为两大支：大西洋颌针鱼(S. marina)、台湾原尾颌针鱼(S. leiura)聚为一支，支持率为100%，另一支为本实验的鱼卵、仔鱼与两条成鱼样本以及来自GenBank的沙氏下鱼(H. sajori)组成的单系群，并与间下鱼(H. intermedius)互为姐妹群，支持率为100%。

3 讨论 3.1 浒苔中产卵鱼种类

尽管实验前已经鉴定出浒苔藻团中的成鱼尸体为沙氏下鱼，但是，并不能确定其就是产卵鱼类，也不能确定产卵鱼类究竟有多少种类。用鱼卵甚至孵化出的仔稚鱼直接进行物种鉴定也很难鉴定到具体种。因此，在本研究中选用了mtDNA基因组中的COI基因作为物种鉴定的分子标记。COI基因是鱼类mtDNA 13个蛋白质编码基因之一，中度保守，既能保证足够的变异又足够保守，且很少存在插入与缺失，可用于种间及种以上阶元的遗传学分析。随机取样获得的554 bp COI基因片段的同源序列比对结果表明：鱼卵、仔鱼、成鱼与GenBank中的沙氏下鱼(H. sajori)基因片段序列之间无变异位点出现，用Kimura双参数法计算遗传距离为0，而与其他颌针鱼目鱼类序列间的遗传距离在11.9%~25.2%之间(表 2)。据其他一些动物的COI基因序列分析的结果，种内个体间的平均遗传距离一般在0~4.06%之间，差异超过6%的个体已有明显的亚种或种的分化，10%以上时就具有种的差异^[17-18]。通过Kimura双参数模型构建的NJ分子系统发生树聚类结果也显示鱼卵、仔鱼、成鱼与沙氏下鱼(H. sajori)聚为单系群，与其他颌针鱼目鱼类亲缘关系较远(图 2)。综合分析确定该海域浒苔藻团中产卵鱼类只有沙氏下鱼(H. sajori)一个种。

3.2 浒苔中鱼类产卵繁殖的原因及意义

鱼类繁殖包括亲鱼性腺发育、成熟、产卵、精卵结合孵出仔鱼^[29]。鱼类繁殖所需要的生态条件和鱼类性腺发育成熟、产卵、卵的特性、受精和初孵仔鱼发育所要求的条件是一致的。产黏性卵的鱼类性腺发育成熟需要充足的溶氧，产卵需要适当的水流速度刺激，但流速不宜过大，流速过大会影响黏着沉性鱼卵的受精和附着，同时鱼类繁殖也需要优良的水质条件和充足的饵料^[19-21]。

如东近岸海域大面积养殖条斑紫菜(Pyropia yezoensis)，养殖筏架成为浒苔微观繁殖体附着和快速生长的温床^[22-23]。在每年3—4月紫菜收割阶段，大量的浒苔藻体从紫菜养殖筏架和苗绳上脱落，成为早期漂浮浒苔的主要来源之一。近年来近岸海域水质富营养化程度很高，为浒苔绿潮最初形成和快速生长提供了物质基础。浒苔绿潮一般在紫菜收割结束后四、五月份开始繁殖形成规模，一直持续到8月份。

一般认为由浒苔导致的绿潮会对海洋生态环境造成负面影响，影响近海鱼类种群的繁殖发育，导致近海鱼类资源衰退。但是，近年的一些研究发现，在繁殖初期(4月下旬至6月中下旬)，浒苔生长区水质会得到一定的改善，浒苔光合作用产生的氧气会增加水中溶氧，有浒苔等水生植物的地方不乏浮游动物存在，且水清流缓^[24-26]。沙氏下鱼亲鱼在溶氧充足水质良好的环境中性腺发育成熟，并且由适当的流速刺激产卵(产卵时间通常是5月中旬至6月中下旬)，这也很好地解释了开篇提到的在浒苔藻团中附着大量黏性鱼卵的现象。沙氏下鱼鱼卵为黏着性卵^[27]，在水清流缓的环境中完成受精，黏着性的受精卵黏附在浒苔上生长发育，水质清澈，水流缓慢为受精卵提供了一个良好的生长发育环境，大量浮游动物的存在，为仔鱼的生长发育提供了丰富的饵料。通过本研究推断如东地区浒苔繁殖的前中期可以为某些产黏性卵鱼类(如沙氏下鱼)的繁殖发育提供有利条件。众所周知，近海鱼类资源衰退的主要原因之一是产卵育幼场的退化。因此，可以尝试选择一些近岸海域水体被污染的区域，人工种植一些附着可控的藻类或者沉水植物，附着藻类和沉水植物是重要的初级生产者，为浮游动物提供食物来源，这样就可以为鱼类提供充足的饵料；沉水植物和附着藻类光合作用产生氧气可以提高水体中溶氧量，为鱼类性腺发育成熟提供了足够的溶解氧；沉水植物和附着藻类对水体中的营养盐和重金属元素有很强的吸附作用，从而起到净化水质的效果；附着藻类和沉水植物能够改变水流速度刺激鱼类产卵受精；沉水植物和附着藻类又能为产黏着性卵的鱼类如扁颌针鱼(Ablennes anastomella)、燕鳐鱼(Cypselurus agoo)等提供附着载体，形成天然有利的产卵育幼场^[28-32]。综上所述，人工种植附着藻类或者沉水植物对产卵育幼场的恢复具有重要意义，或许能为我国近海鱼类资源恢复提供一个新思路。