2017,
Vol. 26
2. 北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室, 北京 100048
香气是重要的食品品质及质量评价指标，中华绒螯蟹(俗称大闸蟹)，经过传统烹调方法隔水蒸制后可产生诱人的香味。体肉(除足钳肉)，性腺(包括性腺及肝胰腺)是中华绒螯蟹的两大主要可食部位，是提供特征香气的主要组织来源。挥发性风味物质的提取及分析对于进一步研究香气物质形成机理，指导改进加工工艺，提升消费者感官体验具有理论指导意义。
在香气富集技术上，同时蒸馏萃取法(Simultaneous distillation extraction, SDE)，固相微萃取法(Solid phase microextraction，SPME)和整体材料吸附法(Monolithic material sorptive extraction，MMSE)被广泛用于河豚[1]、中华绒螯蟹[2, 3]等水产品的挥发性成分提取。但SDE法使样品长时间处于高温加热状态，极易造成挥发性风味成分失真，而SPME法和MMSE法受吸附材料的面积及极性限制，难于获得全面的样品香气信息。用于香气成分分析鉴定的气相色谱-质谱联用技术(Gas chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS)，受限于其单一色谱柱的低柱效，存在分离效果不佳导致鉴定困难的问题。
本研究首次采用微波辅助萃取法(Microwave assisted extraction, MAE)联合溶剂辅助风味蒸发法(Solvent assisted flavor evaporation, SAFE)提取中华绒螯蟹香气成分，并应用全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱(Comprehensive two-dimensional gas chromatography/high resolution-time of flight mass spectrometry, GC×GC/HR-TOFMS)进行鉴定。溶剂使用量低，操作时间短, 样品内外快速均匀受热的微波辅助萃取法，可实现热敏性样品挥发性气味成分的快速富集[4]。进一步联合溶剂辅助风味蒸发法，可将萃取液中含有的大量不挥发成分有效脱除，得到具有样品原有风味的气味富集液[5]。该方法曾被用于马铃薯小吃[6]，烧鸡[6]，牛肉[7]等的挥发性气味成分提取，而在蟹领域的相关研究则仍为空白。全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱具有高灵敏度、峰容量大等优势，含香气物质的分析物先后通过两根极性不同的色谱柱，实现香气成分的正交分离，已成功用于带鱼[8]，贝类[9]，烧鸡[10]等的复杂香气成分分离鉴定。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂中华绒螯蟹(雌蟹20只，均重150 g；雄蟹20只，均重200 g)，2015年10月采于江苏省阳澄湖明澄养殖基地。活蟹捕捞出水后立即用麻绳扎紧(防止其剧烈挣扎造成营养物消耗)，冷链保活3小时内运输至实验室。
二氯甲烷、无水硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；C7-C30正构烷烃混标：色谱级，北京化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备Ethos微波辅助萃取仪：意大利Milestone公司；SAFE装置：定制加工；XDS复合涡轮分子泵：英国Edwards公司；N-EVAP111 12位干浴氮吹仪：美国Organomation Associates公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱GC×GC/HR-TOFMS型：美国Agilent-Zoex公司。
1.3 方法 1.3.1 前处理方法流水洗去中华绒螯蟹体表污垢并用毛巾擦拭干净，用专业的剥蟹工具打开头胸甲，手工剥离其体肉(不含足钳肉)，性腺(含肝胰腺)，将性腺和肝胰腺充分混匀后，每袋30 g样品分装入密封袋内，于-20 ℃低温冰箱中贮存待用。
1.3.2 MAE-SAFE法提取中华绒螯蟹挥发性风味成分精确称取6份5.000 g样品，装入微波辅助溶剂萃取仪的6个萃取罐中，隔水蒸制15 min，冷却至室温后每罐中加入40 mL二氯甲烷，进行微波辅助溶剂萃取，每种样品制备三组平行。萃取程序如下：4 ℃/min升至80 ℃，保持10 min，排风10 min，功率300 W。提取结束后，待罐内温度降低至室温，打开罐体合并萃取液，经过滤得到含有挥发性风味物质的液体。
将MAE法得到的滤液由滴液漏斗缓慢、均匀地经滴液漏斗滴入图 1所示的SAFE装置蒸馏瓶中以除去提取液中的非挥发性成分，控制在30 min内滴加完成，馏出液接收瓶始终浸没在液氮中保持低温。SAFE装置蒸馏头夹层循环水温度为50 ℃，系统压力保持在10.3×10-3 Pa左右。蒸馏结束后，取下接收瓶，室温下待提取液融化后，加入无水Na2SO4静置1小时除去其中水分，过滤得仅含有挥发性风味成分的澄清提取液。低温旋转蒸发至10 mL后氮吹至0.5 mL用于上机分析。
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图 1 SAFE装置示意图
Fig. 1 Schematic diagram of SAFE
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色谱条件：全二维气相色谱柱第一柱为DB-WAX (15 m×0.25 mm×0.25 μm)，第二柱为DB-5 (1.2 m× 0.1 mm×0.4 μm)，均购于安捷伦公司，两根色谱柱处于同一柱温箱中，通过毛细管柱连接器以串联方式连接。进样口温度为250 ℃，载气为He，纯度99.999%，流速1.0 mL/min，压力30 psi。升温程序如下：起始温度40 ℃，以1 ℃/min升到70 ℃，保持5 min，再以1 ℃/min升到130 ℃，保持5min后以3 ℃/min升到230 ℃，保持5 min，分流比20：1。辅助区升温程序为初始温度280 ℃，以1 ℃/min升至330 ℃。调制周期7s，冷吹时间300 ms。进样量为1 μL。
HR-TOFMS条件：电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃，质量扫描范围40~340 amu，TOFMS采集频率100 Hz，溶剂延迟6.8 min。
定性方法:待测成分由系统自带的Zoex GC-image HRMS 2.3软件进行分析，所得总离子流图经基线校正，质量轴校准，积分后由NIST11谱库进行检索。对于匹配度700~800的化合物，进一步采用精确质量数进行鉴定。
2 结果与分析 2.1 GC×GC/HR-TOFMS分析结果图 2展示了通过GC×GC/HR-TOFMS采集到的中华绒螯蟹4种样品中挥发气味物质的二维图谱。在下文中，F-A，F-G，M-A，M-G分别代表雌蟹体肉(Female crab-Abdomen meat)，雌蟹性腺(Female crab-Gonad)，雄蟹体肉(Male crab-Abdomen meat)，雄蟹性腺(Male crab-Gonad)。在二维图像中，水平坐标轴代表化合物在柱1的保留时间，化合物在该柱上基于其沸点实现分离，垂直坐标轴代表化合物在柱2的保留时间，化合物经冷冻聚焦后在该柱上基于化合物不同的极性实现再分离，图中的每一个斑点代表一种化合物，斑点颜色深浅代表化合物浓度，右侧条带为浓度颜色指示带，代表浓度随颜色沿垂直轴向上增大。显然，与一维气相色谱中的峰重叠相比，全二维气相色谱实现了更为清晰的分离效果。
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图 2 中华绒螯蟹挥发性气味物质二维图谱
Fig. 2 The 2D-image of Chinese mitten crab volatile compounds by GC ×GC-HR/TOFMS
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体肉和性腺样品中共有122种挥发性气味物质经NIST11谱库和精确质量数测定后被鉴定。其中含有醛类16种，酮类18种，含氮化合物8种，含硫化合物4种，醇类28种。匹配度高于800的化合物可以被谱库检索直接鉴定，部分匹配因子高于700但低于800的挥发性物质则通过精确质量数测定进一步鉴定，精确度为±2 amu。性腺样品中，雌蟹共检出84种，雄蟹共检出94种化合物，多于体肉样品中雌蟹和雄蟹均为61种的检出量，可见性别对于的中华绒螯蟹性腺风味有所影响，而这一点在体肉中并不明显。研究表明，除水分以外，体肉中19%左右为蛋白质，而性腺则含有高达20%的脂肪[11]，这种成分的差异是导致两部分具有不同风味特征的主要原因，性腺因富含的脂质成分在加热熟制过程中生成更为丰富的香气物质。有38种化合物在中4个样品均有检出，对中华绒螯蟹整体基本气味轮廓的构成可能起重要作用。
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图 3 中华绒螯蟹挥发性气味物质分类汇总图
Fig. 3 Summary of Chinese mitten crab volatile compounds
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本节将重点讨论醛类、酮类及含硫含氮类化合物。醛类化合物(表 1)可通过脂类过氧化、美拉德反应和氨基酸的Strecker降解反应而形成，因其香气阈值较低，是水产品香气的重要贡献物质[12]。戊醛，己醛，庚醛，3-甲基-2-丁烯醛，壬醛，苯甲醛为四样品所共有的醛类。其中，甲基丙烯醛，(E)-2-戊烯醛，(E)-2-己烯醛，辛醛，(Z)-2-庚烯醛，(E)-2-辛烯醛，(E, E)-2, 4-庚二烯醛和(E, Z)-2, 6-壬二烯醛, 苯乙醛仅在性腺中被检出, 可能对形成熟制性腺的脂样香气有所贡献。研究表明，饱和的直连醛，烯醛，二烯醛多由多不饱和脂肪酸氧化而成，常常带有有令人不愉悦的刺激性气味，是食品中氧化风味的重要来源。(E, Z)-2, 6-壬二稀醛可能是由ω-3脂肪酸通过酶降解而产生，(E, E)-2, 4-庚二烯醛通常被认为是n-3多不饱和脂肪酸的降解产物[13]，可提供脂肪香气，被广泛应用于肉味香精[14]，但其阈值高于(E, Z)-2, 6-壬二稀醛，对香气的贡献程度可能相对较小，性腺中丰富的脂肪含量为这些化合物的形成提供了前体。与此同时，戊醛、己醛、庚醛和壬醛等给新鲜的海鲜提供了另人舒适的绿色植物般的青香和甜甜的花香[1]，也被认为是淡水鱼类土腥味的重要成分[15]，性腺中该类化合物的含量显著高于体肉，其较低的阈值使其成为贡献性腺整体香气的重要物质。苯甲醛具有焙烤坚果的香气，曾被鉴定为是消毒蟹肉里重要的风味挥发物[16]，其在性腺中具有更高的含量百分比。(Z)-2-庚烯醛在蟹类水产品中鲜有报道，但吉思茹[17]的研究中表明其能在GC-O频率嗅闻法中以极高的检测频率(7/8) 被感官员嗅闻到，其阈值较低，是雄蟹性腺独有嗅感物质。2-甲基-2-丁烯醛曾在熟制大闸蟹钳肉和足肉中被检出[3]，具巧克力味, 但阈值较高，对香气贡献有限，本研究中在雌性体肉中被检出。
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表 1 中华绒螯蟹可食部位醛类挥发性气味物质 Tab.1 Aldehyde volatiles in Chinese mitten crab edible parts |
酮类化合物(表 2)一般具有青香气味或奶油味、果香味，其中不饱和酮是动物特征味和植物油脂味的来源[18]，阈值较醛类化合物一般较高。在检出的20种酮类化合物中，3-甲基-3-丁烯-2-酮，3-羟基丁酮，1-羟基-2-丙酮及苯乙酮, 2(5H)-呋喃酮为四种样品所共有, 2, 3-戊二酮，2-庚酮，1-辛烯-3-酮，(E, E)-3, 5-辛二烯-2-酮，2(5H)-5-乙基呋喃酮，麦芽酚为性腺独有。检出的酮类主要为支链化合物，2-庚酮等甲基酮类化合物风味强度较高，不饱和脂肪酸在加工过程中发生的氧化反应是甲基酮的主要来源[13]。烯酮类化合物，如(E, E)-3, 5-辛二烯-2-酮等有植物芳香的气味特征，曾在3个产地的大闸蟹(松江，崇明，阳澄湖)体肉中均有检出[15]，但本研究仅在性腺中检出。而烷基二酮，如2, 3-戊二酮，2, 3-辛二酮，赋予样品强烈的奶油香和宜人的香味[1]，2, 3-戊二酮的阈值较低，且含量百分比较高，可能对性腺的脂质样香气有一定贡献。苯乙酮在大闸蟹[19]，三文鱼[20]中均被报道过，具有蘑菇样的植物气味特征，因具有较高的气味强度值为中华绒螯蟹重要的嗅感物质[17]。6种呋喃酮类及吡喃酮类物质在本研究中检出，该类化合物均可由美拉德反应生成，具有焦糖样或焙烤样香气[21]。2(3H)-4-羟基-二氢呋喃酮是含量占比最高的一种化合物，考虑其阈值无从查证，其对香气的贡仍有待研究。其中值得注意的是，本研究首次在中华绒螯蟹中检出麦芽酚及其前体物质4H-2, 3-二氢-3, 5-二羟基-6-甲基吡喃-4-酮，该前体物质脱一分子水即可转化生成麦芽酚，麦芽酚在性腺样品均有检出，而其前体物质则仅在雌蟹性腺中检出，推测可能由于不同性别的性腺样品中前体物质转化形成麦芽酚程度不同导致，麦芽酚作为醛类化合物具有较低的阈值，在性腺中含量较高，大量麦芽酚的存在为性腺样品提供了醇厚的香气。
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表 2 中华绒螯蟹可食部位酮类挥发性气味物质 Tab.2 Ketone volatiles in Chinese mitten crab edible parts |
含氮化合物(表 3)是中华绒螯蟹体肉肉香的重要贡献者，由于气味阈值极低(5~10 mg/kg)，对整体风味的贡献很大[22]。本研究共有7种含氮化合物检出，除两种酰胺类化合物之外，均为杂环类含氮化合物。杂环类含氮化合物，如吡嗪、呋喃、吡咯等来自于高温热加工过程中氨基酸和还原糖之间的美拉德反应、氨基酸的热解及硫胺素热降解，多数贡献烤肉样的焦香味。由于本研究加热条件为温和蒸煮模式，故产生的焦香样气味并不强烈。三甲基吡嗪为体肉中独有的风味成分，具有烤土豆味，是体肉中含量最高的含氮化合物，因其阈值较低，可以为熟制体肉提供丰富的肉香，常用于肉味香精调制[14]。吡嗪类化合物在烤虾中含量较高，对蒸煮螃蟹风味有一定贡献，通常提供以烤肉样，坚果样的香气[15]。2-甲基呋喃仅在性腺样品中检测到，它是亚油酸的氧化产物，阈值较低，具有泥土及蔬菜样香气，作为脂质氧化的指标物可能对性腺的风味作用巨大。两种酰胺类物质中，甲酰胺为首次在中华绒螯蟹的性腺中检出，可能来自于脂肪、氨基酸的降解或微生物的生长代谢[23]，有研究表明它是N, N-二甲基甲酰胺的微生物降解产物[24]，由于其具有氨味、鱼腥味[25]，是四样品唯一共有的含氮化合物，体肉中含量相对较高，广泛存在于其他蟹类中，此次检出对于研究中华绒螯蟹腥味物质来源及降解途径有重要意义。本实验采用的样品为鲜活状态下熟制而成，三甲胺含量较低，在本研究中未检出。此外吡啶因具有的鱼腥味，氨味特征，也在一定程度上赋予了性腺样品的海鲜样风味。
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表 3 中华绒螯蟹可食部位含氮含硫类挥发性气味物质 Tab.3 Nitrogen-containing and sulfur-containing volatiles in Chinese mitten crab edible parts |
含硫化合物(表 3)常见于各类甲壳类动物肉的挥发性成分，通常具有极低的阈值，在水产品肉香味形成过程中起至关重要的作用, 多来自于含硫氨基酸及核苷酸的热反应。本研究共检出4种含硫化合物，二甲基二硫，甲硫基丙醛，2-乙酰基噻唑，二甲基砜，在四种样品中均有所检出。二甲基二硫被认为具有类似洋葱或白菜的香气，是乙硫醇的氧化产物或蛋氨酸的细菌降解产物[19]。甲硫基丙醛在四种样品中含量最高，阈值极低，对气味贡献最大，具有烤土豆味，曾被鉴定为雄蟹性腺的独有嗅感物质[17]。2-乙酰基噻唑具有坚果香和爆玉米花般的香气，被大量报道存在于其它蟹和水产品中[1]，其在体肉样品中的百分含量高于性腺，对体肉的风味贡献有一定作用。二甲基砜存在于动物各组织中，在肉类中含量高且挥发性强，对肉香风味有一定贡献[26]。
此外，芳香族化合物的来源可能与蟹所处的生活环境相关，二甲基苯和苯酚具有某种药味[27]，对其风味有负面的影响，萘具有樟脑球的气味，在龙虾中也有检出[15]。乙基苯具有坚果香气，因在气味强度实验中具有较高的气味强度值对整体风味具有一定贡献[28]，对甲基苯酚仅在雄蟹蟹肉中被检出，具有烧烤味，是构成咖啡、葡萄酒香气的重要成分[13]。烃类，醇类，酯类和酸类化合物香味阈值较高，对于香气特征贡献有限。其中十一烷可以通过烷基自由基的脂质自氧化或类胡萝卜素分解生成，曾在小龙虾中被检出，在吉思茹的研究中首次被鉴定为大闸蟹性腺的嗅感物质[24]，具有清香味和奶香味，在体肉中含量丰富。十二烷在大闸蟹中曾被报道为对香气有贡献作用的挥发性物质[1]，具有较弱的坚果味和烤肉味。具有甲基支链的化合物是重要的肉品风味化合物[29]，具有清甜香味的长支链烷烃2, 6, 10, 14-四甲基十五烷多次在中华绒螯蟹，小龙虾及其加工废弃物的样品中检出[15]。1-戊烯-3-醇，1-戊醇，1-辛烯-3-醇是醇类检出化合物中阈值较低的三种。可见，相比而言，不饱和醇的风味阈值较低，对风味贡献较大。1-辛烯-3-醇是一种亚油酸的氢过氧化物的降解产物，本研究中仅在性腺中检出，多次在前人研究中检出具有蘑菇样的香气，广泛存在于淡水及海水鱼类中[15, 30]。
3 讨论本研究耦合利用了MAE与SAFE法对中华绒螯蟹两大可食部位的挥发性香气成分进行提取，利用全二维气相色谱-飞行时间质谱进行了香气成分的分析鉴定。结果表明，本研究建立的方法较传统方法获得的香气成分更为全面，鉴定效果更为理想。从数量来看，本研究从两大可食部位共分析获得122种化合物，显著多于前人的研究结果。于慧子[16]采用SDE-GC-MS法在中华绒螯蟹蟹肉中鉴定出59种挥发性化合物，包括醛类化合物18种、酮类化合物8种、醇类化合物8种、含硫化合物7种、含氮化合物6种，未见酸类检出，顾赛麒[31]采用MMSE-GC-MS法从崇明雄性中华绒螯蟹可食部位(体肉，钳肉，足肉，性腺)得到71种挥发性化合物，其中醛类21种, 酮类9种, 醇类5种, 呋喃类6种, 含氮化合物10种，运用HS-SPME-GC-MS法从松江雌性中华绒螯蟹可食部位(体肉，钳肉，足肉，性腺)中共鉴定得到48种化合物，其中醛类21种、酮类5种、醇类3种、呋喃类5种、含氮类2种[3]。从物质分类来看，本方法得到醛类18种，酮类20种，醇类27种，含氮类7种，含硫类4种，芳香族类14种，烃类14种，酸类9种，酯类9种，对酮类，醇类，含氮含硫类等一些挥发性低、极性大、热敏性化合物富集效果较传统方法更优，张逸君等人采用MAE-SAFE-GC-MS法对道口烧鸡的香气研究中得出相似结论：MAE法对于极性化合物有更高的萃取效率，SAFE法对低挥发性和极性较高的香气组分萃取更有效[32]。因醛酮类及含氮含硫化合物对风味贡献较大，故本研究采用的方法适于复杂水产品品基质中进行极性热敏挥发性成分的萃取。
在分离鉴定效果方面，全二维气相色谱质谱联用将两种不同性质的色谱柱串联起来，使样品中所有组分在二维平面达到正交分离，本研究中成功实现了同分异构体的鉴定，极性相近的同分异构体(E)-2-戊烯-1-醇与(Z)-2-戊烯-1-醇具有相近的第二维保留时间(1.807 2 s和1.807 1 s), 但在一维柱上根据其沸点高低实现完全分离(28.890 6 min和29.311 8 min)。全二维气相色谱较好的解决了一维气相色谱中峰重叠的问题，使得鉴定效果更准确可信。同时，GC×GC/HR-TOFMS所使用的精确质量数鉴定法，对于弥补NIST谱库检索正反匹配度较低时鉴定准确度低有一定效果，其根据鉴定化合物的特征分子离子峰实现再次定性，有60种物质经过精确质量数鉴定，定性效果更为可靠。
与此同时，在技术操作方面MAE-SAFE法在在进行香气富集操作时克服了传统液体萃取SDE法对原料长时间高温萃取的缺点，借助微波的辅助加热，使原料快速均匀受热，实现了高效快速的香气成分富集，同时SAFE法的耦合有效地去除非挥发成分对气相色谱检测的干扰，对水产品类复杂基质的原料有很好的适应性。全二维气相色谱高分辨飞行时间质谱具有高分辨率，高峰容量的特点，适合于中华绒螯蟹样品中复杂香气的分析，至此，本研究获得了较为全面真实的中华绒螯蟹挥发性成分信息，建立起一套适于水产品类复杂基质的香气分析方法。
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2. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China