二代高通量测序技术(Next-generation sequencing)的产生，加速了后基因组学的发展，基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等“组学”研究在这10多年间快速发展，在生物学的各个研究领域都取得了巨大成果^[1]。其中，随着高通量测序成本的逐年降低和可视化生物信息学软件的大量开发，转录组测序已成为进行相关物种功能基因组学研究的不二选择^[2-11]。当前，转录组测序已成为商业化的产品，各生物测序公司均采取模式化的方式进行测序，相对而言，参考转录组的拼接具备一定的灵活性，需各实验室独立进行。目前转录组的拼接方法主要包含两种策略，第一种为序列比对优先策略，相应开发的软件有Scripture，Cufflinks等^[12-13]，主要是基于有完整参考基因组的物种，将测序的原始数据比对到参考基因组上，然后根据比对的重叠区域拼接序列，获得参考转录组。另一种策略为从头拼接策略，主要的相关软件有ABySS^[14]、SOAPdenovo^[15]、Velvet^[16]、Trinity^[17]等，主要是根据de Bruijn图的算法，利用测序获得的序列进行直接组装，无需参考基因组序列。

鲤(Cyprinus carpio)是全世界分布最为广泛的鱼类之一，也是世界重要的水产养殖对象。鲤在长期的自然选择和人工选择过程中，形成了许多不同的品种/品系，不同的鲤鱼品种/品系产生了明显的表型和遗传差异^[18-21]。如作为食用鱼和观赏鱼在全世界范围内广泛养殖的镜鲤、黄河鲤、建鲤、松浦鲤、兴国红鲤、荷包红鲤、玻璃红鲤和瓯江彩鲤^{[18, 22-27]}。鲤的基因组序列已经发表，相关的基因组序列可以在生物数据库中下载，为鲤的功能基因组学研究、进化研究奠定了基础，为不同品种/品系鲤鱼的“组学”研究提供了参考基因组序列。近年来，在很多不同品种/品系的鲤中广泛开展的转录组研究主要采用的是从头拼接的策略^{[8, 10, 28]}。由于不同鲤品种/品系间显著的表型和遗传差异，基于松浦鲤的鲤参考基因组序列是否适合于每个鲤品种/品系的转录组拼接尚不得而知。

瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var. color)是浙江省西南部龙泉、青田等县市广泛养殖的地方性鲤群体，因具有全红、大花、麻花、粉玉、粉花等多种体色，色彩绚丽鲜艳，是一种兼具食用和观赏价值的经济鱼类^[29]。由于长期的自然和人工选择，瓯江彩鲤已产生了明显的适应性进化，在表型和基因型上均与其它鲤群体存在较大差异^[30]。本实验室在瓯江彩鲤的人工选育和体色进化研究过程中，已积累了大量的转录组数据，为序列的拼接和组装提供了多样化素材。本文以瓯江彩鲤为研究对象，研究两种转录组拼接方法的适用性，同时为其它鱼类的转录组研究提供参考和依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本文进行瓯江彩鲤转录组拼接所用到的原始测序数据来自于本实验室前期进行的“全红”(WR)和“粉玉”(WW)两种体色瓯江彩鲤的皮肤转录组测序研究，基于Illumina Hiseq2500测序平台，进行2×150 bp的双末端测序，获得“全红” 9.7×10⁹ bp和“粉玉”1.27×10¹⁰ bp的测序数据(数据未显示)，为本文进行转录组拼接的原始数据。

1.2 转录组拼接

原始测序数据利用Trimmomatic过滤后，获得无污染的、高质量的测序数据，然后将过滤后的“全红”和“粉玉”测序数据合并，用于瓯江彩鲤转录组拼接的输入数据^[31]。本文采用了两种常规的拼接策略进行瓯江彩鲤的转录组拼接。第一种方法采用了Tophat-Cufflinks流程(比对优先策略)，基于序列比对的原理进行拼接，利用已发表的鲤全基因组序列为参考序列。其步骤是首先利用Tophat软件将过滤后的“全红”和“粉玉”的测序序列分别比对到鲤鱼的基因组上，采用Tophat软件默认的最佳参数设置，获得“全红”和“粉玉”转录组测序序列在基因组上的比对信息，储存于BAM文件中^[13]；其次将生成的包含比对信息的BAM文件导入Cufflinks软件，基于比对信息中的基因组位置信息进行拼接，分别获得“全红”和“粉玉”的转录组序列^[13]；最后，利用Cuffmerge软件将上一步完成的“全红”和“粉玉”的转录组序列进行合并，获得完整的瓯江彩鲤的参考转录组序列^[13]。第二种方法采用了基于de Bruijn图算法的de novo拼接(从头拼接策略)，此方法不需要用到鲤鱼的基因组序列，完全依赖于测序获得的瓯江彩鲤的序列信息。其步骤是首先将“全红”和“粉玉”过滤后的序列全部合并，然后利用Trinity软件基于双末端的模式进行拼接，设置的参数如下：16线程的CPU，120 Gb的内存，过滤掉拼接长度小于300 bp的转录本序列^[17]。

1.3 转录组的功能注释

采用两种方法拼接获得的转录组后，利用NCBI Blastx软件进行拼接转录本的功能注释，将拼接所获得的转录本与蛋白序列的公共数据库NCBI-NR(非冗余蛋白数据库)，Uniprot蛋白数据(http://www.uniprot.org/downloads)，斑马鱼蛋白数据(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/fasta/danio_rerio/pep/)以及鲤蛋白数据(http://www.carpbase.org/download_home.php)^[32]作比对，E值的阈值设置为 < 1e-5。利用BLAST2GO软件进行Gene Ontology和KEGG代谢通路的注释。利用TransDecoder软件进行蛋白编码序列(CDS)的预测。

2 结果 2.1 转录组拼接比较

基于Tophat-Cufflinks软件和Trinity软件拼接的两个瓯江彩鲤转录组分别获得了98 906和153 291条转录本序列(表 1)。利用Tophat软件将近60%的“全红”和“粉玉”的转录组序列比对到鲤鱼的基因组上(表 2, 图 1)。利用Trinity软件拼接获得的转录本的平均长度和N50长度较利用Cufflinks软件拼接过的转录本长度短(表 1，图 2a)。虽然两种方法拼接的转录本数目不同，但拼接的转录组大小是基本一致的(约1.5×10⁸ bp，表 1)。

2.2 转录组功能注释比较

利用不同的蛋白数据库对拼接完成的两个转录组进行注释，注释结果表明，在Trinity版本的转录组中能注释的转录本数目在62 372到76 989之间。而Cufflinks版本的转录组中能注释的转录本数目在70 728到77 601之间。以鲤的蛋白数据库为参照，Cufflinks和Trinity版本的转录组分别注释了77 416和76 989个转录本，分别对应了27 169和22 450个鲤的蛋白编码基因(表 1)。其中18 886个基因在两个转录组中共有，Cufflinks版本转录组中拼接获得了8 283个特异的基因序列，而Trinity版本转录组中拼接获得了3 564个特异的基因序列。利用GO数据库，Cufflinks和Trinity版本转录组中分别注释了36 476和32 581个转录本序列。基于KEGG蛋白数据库，Cufflinks和Trinity版本转录组中29 854和26 822条转录本序列分别被注释。整体而言，Cufflinks版本中能注释的转录本数目大于Trinity版本中能注释的转录本数目(表 1，图 2b)。

2.3 基因结构预测和比较

基于18 886个在两个版本转录组中共同注释的功能基因，统计两个版本转录组中每个基因对应的平均选择性剪切的转录本数目。对于Trinity转录组，每个基因平均含有4个转录本数目，而对于Cufflinks版本转录组，每个基因平均含有3个转录本(P < 0.001, t-test)。尽管Trinity版本的转录组预测了更多的选择性剪切的转录本，但Cufflinks版本转录组预测的基因结构较Trinity版本更加准确。例如，slc9a3r1 (ENSDARG00000000068) 基因在两个版本的转录组中均预测获得了3条转录本序列，在Trinity版本转录组中3条slc9a3r1转录本序列为TR183826|c7_g1_i1、TR183826|c7_g1_i2和TR183826|c7_g1_i3，基因结构预测表明该3条序列为slc9a3r1基因的3条选择性剪切的转录本，属于同一个基因。而在Cufflinks版本转录组中3条slc9a3r1转录本序列为TCONS_00004298、TCONS_00004299和TCONS_00004867，基因结构预测的结构表明3条序列来自于两条旁系同源的slc9a3r1基因，TCONS_00004298和TCONS_00004299是鲤鱼基因组scaffold 000000268上slc9a3r1基因的2条选择性剪切的转录本。而TCONS_00004867与TR183826|c7_g1_i3序列的相似度很高(>95%)，来自于鲤鱼基因组scaffold 000000306上的另一个slc9a3r1旁系同源基因(图 3)。

3 讨论

基于序列比对优先策略的Cufflinks软件和基于从头拼接策略的Trinity软件都是目前转录组拼接常用的两个软件^{[13, 17]}。基于序列比对优先策略开发的Cufflinks软件承诺序列比对时最大程度的灵敏性，但是需要利用物种特异的或者近缘的基因组序列^[13]。通常情况下，对于模式动植物或具有完整基因组序列的物种，转录组拼接往往采用的是Tophat-Cufflinks的拼接流程。然而在本实验中，“全红”和“粉玉”的转录组序列中仅有约60%左右的序列比对到基因组上(表 2)，低于Tophat软件要求的70%以上，一般情况下，若序列比对的比例低于70%，往往会造成一定程度的转录组组装的错误^[13]。对本实验而言，低比例的序列比对率可能由以下原因造成：(1) 目前拼接的鲤鱼的基因组序列仍不完善，拼接的基因组框架序列存在一定的缺口^[32]；(2) 由于瓯江彩鲤是我国主要分布于浙江瓯江流域的特色鲤鱼品系，长期的自然选择和适应性进化造成了其与普通鲤鱼产生了一定的遗传变异，进而造成低比例的序列比对率^{[30, 33-34]}；(3) 鲤鱼一直以来被认为是古老的异源四倍体鱼类，基因组复制，多拷贝基因的现象也会造成序列比对率下降，进而影响转录组的拼接^{[32, 35]}。而基于从头拼接策略的Trinity软件在转录组拼接过程中不需要依靠鲤鱼的基因组序列，完全依赖于瓯江彩鲤自身的测序序列，拼接的转录组序列将是瓯江彩鲤特异的基因序列，而且可能会拼接出普通鲤鱼中不存在的新基因序列^[17]。但基于Trinity软件拼接的转录组序列由于没有基因组序列作为参考，往往会出现序列长度短，片段化严重，基因序列不完整的现象，在多个物种中都有类似的报道^[36]，本文的研究结果也能很好地证明这一点。

由于鲤一直以来被认为是异源四倍体鱼类，基因复制的现象在鲤中非常常见，因而会造成大量的旁系同源基因的出现，这对于准确地预测基因的结构是个挑战^[32]。本研究利用两种方法拼接的转录组结果表明利用Cufflinks软件拼接的转录组能够更加准确地预测瓯江彩鲤基因结构和选择性剪切情况^[37]。本研究中，利用Cufflinks拼接的转录组序列长度更长，注释地基因数目更多，基因结构和选择性剪切预测得更加准确，更加适用于进行后续的瓯江彩鲤基因表达量和差异基因表达的研究。相反，基于Trinity软件拼接的转录组序列为瓯江彩鲤特异的转录本序列，对瓯江彩鲤的研究也具有重要的意义，对后续需要利用特异的瓯江彩鲤基因序列的分子进化相关研究是非常有必要的。

本研究以瓯江彩鲤为研究对象，探讨了两种常见的转录组拼接方法在瓯江彩鲤转录组学研究上的适用性。就目前而言，两种拼接方法均对瓯江彩鲤的转录组学研究具有重要意义，需要根据不同的研究目的，选用合理的拼接方法。同时本研究也为其他鱼类的转录组学研究提供了参考和方向。