2017,
Vol. 26
2. 中国科学院植物研究所, 北京 100093;
3. 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海 200032
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)广泛存在于C3、C4、景天科(CAM)植物、真核藻、蓝藻、细菌、古生菌中，但不存在于动物和真菌中[1]。PEPC在植物碳代谢中起重要作用，在辅因子HCO3-和Mg2+协同下，可以催化PEP发生不可逆的β-羧化反应，生成无机磷酸(Pi)和草酰乙酸(OAA)[2]。2003年，对pepc基因的研究有了突破性的进展，研究者发现PEPC有两种类型，其中一种pepc基因与细菌有高度的相似性，被称为细菌型PEPC (BTPC)，另一种存在于C3，C4，CAM植物中的PEPCs被划分为植物型PEPC(PTPC)[3]。
目前为止，PEPC的研究已经进行了十几年，且大多数研究集中于高等植物，尽管从1996年开始，一些绿藻的PEPC已经被证实[4-7]，但对于绿藻PEPC的研究还较少，尤其是BTPC的研究。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞绿藻，其结构简单，易培养、生长快，且对其遗传和转化机制研究比较清楚[8]，用它来探索细菌型PEPC更具优势。自2005年以来，对莱茵衣藻PEPC(CrPEPC)的研究有了一系列有意义的发现。MAMEDOV等发现莱茵衣藻的植物型PEPC是由pepc1基因编码，而细菌型PEPC是由pepc2基因编码的，不仅如此，Crpepc2比Crpepc1结构更复杂，并且催化活性更强，对PEP有更高亲和力[9-11]。侯李君等通过抑制大肠杆菌PEPC酶的表达，获得了含油量更高的工程菌株[12]，贾晓会等用反义RNA法抑制pepc表达，获得了高产油工程蓝藻[13]，DENG等已经证明莱茵衣藻pepc基因的表达跟油脂含量呈负相关[14-15]。
已经有科学家对莱茵衣藻pepc基因的核表达进行了研究，也取得了一些结果，但外源基因导入衣藻后较难获得稳定有效的表达，外源基因会出现“基因沉默”问题，或是在基因、蛋白水平受到阻遏，所以寻找一种更好的表达方式是必要的。莱茵衣藻是至今唯一可成功进行叶绿体、线粒体和细胞核3套基因组转化的绿藻，虽然衣藻叶绿体转化起步比细胞核晚，但在构建叶绿体表达载体时，外源基因表达盒的前后分别连接着衣藻叶绿体基因组的同源片断，当载体进入叶绿体后，同源片断与受体基因组相应的片断发生同源重组，外源基因被整合到叶绿体的特定位点，随叶绿体基因复制和遗传，可以消除核转化的“位置效应”造成对基因表达的不利影响，实现高效表达。除此之外，根据叶绿体的原核性，叶绿体转化法还能够表达原核蛋白，真核蛋白，并对蛋白质进行加工[16]；根据莱茵衣藻光合作用是非必需的，在培养基中减少碳源如乙酸，可以研究光合作用缺陷突变株，或者在黑暗条件下研究非自养突变株，光照条件下混合营养突变株[17]；莱茵衣藻叶绿素合成是非光依赖性的，在黑暗条件下利用碳源也可以充分光合作用，这点可以帮助研究对光敏感的无光合活性突变株，而在陆生植物中是很难做到的[18]。大量研究表明，叶绿体基因工程生产的大多数蛋白质可完成二硫键交联、正确折叠等翻译后修饰，具有正确的空间构象和生物活性[19]。因此本实验克隆了莱茵衣藻“细菌型”保守序列Ⅰ中pepc基因的部分片段(Crpepc2)，构建了Crpepc2基因正反向叶绿体表达载体pASapⅠ-reve-Crpepc2和pASapⅠ-forw-Crpepc2，利用基因枪法转入莱茵衣藻中，获得Crpepc2基因表达上下调的藻株，一方面利用叶绿体表达的高效性调控Crpepc2表达，另一方面为筛选外源蛋白表达载体和含油量高的藻株奠定基础。
1 材料与方法 1.1 藻种和质粒实验藻种为莱茵衣藻缺壁突变株(Chlamydomonas reinhardtii，cc-400)，衣藻叶绿体表达载体为pASapⅠ，均购自衣藻资源中心(明尼苏达大学植物生物学系)，莱茵衣藻在TAP培养液中培养[17]，温度25 ℃，光照50 μmol/(m2·s)，振荡频率100 r/min。扩增质粒的感受态细胞为Top10。
1.2 莱茵衣藻pepc2基因的克隆与正反向叶绿体表达载体的构建目的基因的克隆：以本实验室之前构建的正向原核表达载体pET-28a-forw-pepc2为模板，获得目的Crpepc2部分基因。该模板中的Crpepc2基因是根据NCBI上刊登的莱茵衣藻pepc2 mRNA序列(AY517643)，设计引物P1: CGATGCTCG GTAGCCTGCTTGACG，P2: TAGGGATCCACAAC GACTGCTCCACA(下划线分别表示在上游引物中引入的一个ATG位点和在下游引物中引入一个BamH Ⅰ位点)，再以莱茵衣藻cDNA为模板，P1和P2为引物进行PCR反应获得，随后构建了正反向原核表达载体[21]。用BamH Ⅰ酶切pET-28a-forw-pepc2，会产生一条639 bp带，且该片段两头带BamH Ⅰ位点，凝胶回收该片段，送至上海生工测序。
叶绿体表达载体的构建：用BamH Ⅰ单酶切pASapⅠ，凝胶回收酶切片段，用碱性磷酸酶处理回收片段，防止连接实验中的自连现象。用T4连接酶连接两头带BamH Ⅰ位点的Crpepc2和单酶切后的pASapⅠ，比例20:1过夜连接，将连接后的重组质粒转化感受态细胞Top10，在含氨苄青霉素的LB培养基中38 ℃过夜筛选转化子，液体扩增转化子并提取质粒，用普通PCR方法(引物P1、P2) 和Pst Ⅰ酶切鉴定连接结果，筛选出pASapⅠ-forw-Crpepc2和pASapⅠ-reve-Crpepc2正反向表达载体。
1.3 基因枪转化莱茵衣藻及抗生素筛选受体细胞的制备：收集20 mL对数中期(OD750 0.8) 的莱茵衣藻cc-400缺壁突变株，并用500 μL TAP重新悬浮藻液，取200 μL藻液涂于TAP固体培养平板中央(直径2 cm)，置于培养箱中3~4 d[温度25 ℃，光照50 μmol/(m2·s)]。制备包裹的金粉颗粒与基因枪轰击参考文献[19]，本研究制备了3种金粉颗粒即pASapⅠ-forw-Crpepc2，pASapⅠ-reve-Crpepc2和pASapⅠ。
轰击后将平板置于培养箱中弱光培养3 d后，用新鲜TAP将细胞从培养皿中洗脱下来，重新涂于含氨苄抗生素(50 μg/mL)的培养皿中培养，并逐步提高抗生素浓度至150 μg/mL，筛选出转基因藻株，并挑取单藻落进行液体培养。
1.4 RNA提取，反转录和RT-qPCR分析Trizol(Invitrogen公司)法提取莱茵衣藻总RNA，再利用反转录试剂盒(购自天根生化科技有限公司)获得cDNA，以cDNA为模板，用荧光定量试剂SYBR Green(Kapa生物有限公司)进行RT-qPCR(FTC-3000枫岭生物技术有限公司)定量分析。根据NCBI上公布的莱茵衣藻18S rRNA(EU925397.1) 序列用Primer 5.0设计引物P2(GTTCTTAGTTGGTGGGTTG)和P3(CTGTTATCGCCTCATACTTC)。根据NCBI上莱茵衣藻pepc2 mRNA(AY517643.1) 序列设计引物P4(CTGTTATCGCCTCATACTTC)和P5(CTCGGATGCGTTCAATCTTCTT)。基因的相对表达量用2-ΔΔCt方法分析[20]。
1.5 生长曲线从接种日开始每天用血球计数板计数，并用分光光度计UV-1800(SHIMADZU公司)测量细胞密度OD750。
1.6 总脂与脂肪酸含量的测定收集野生型和3种突变藻株(OD7500.8)，12 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤两次，用冷冻干燥仪(LGJ-10C, China)制成干燥粉，称取30~50 mg干燥粉测量总脂[21]。
脂肪酸的含量的测定采用如下方法。称取15 mL藻粉，加入1 mL饱和KOH-CH3OH混匀；在75 ℃水浴皂化10 min，吸出上清液重复上述步骤2次，合并吸取液；加入约2 mL 1 mol/L HCl-CH3OH溶液，使pH≤2并振荡1 min；于75 ℃水浴酸化10 min，冷却至室温；加入500 μL正己烷萃取，吸取上层萃取液4 ℃保存；用液相色谱质谱联用机器(Agilent 19091N-133) 分析脂肪酸成分。
1.7 总蛋白收集莱茵衣藻及其突变株悬浮液(OD7500.8) 各5 mL，4 ℃, 12 000 r/min离心10 min；用磷酸缓冲液洗涤两次，加入细胞裂解液，用反复冻融法提取总蛋白；4 ℃, 12 000 r/min离心10 min上清即为总蛋白，用Bradford法测定总蛋白含量[22]，酶标仪(Bio-RadiMarkTM Microplate Reader)获得标准曲线，计算出总蛋白量。
1.8 统计学分析用软件Excel和OriginPro 8对多次重复实验结果进行分析，结果用±SD(标准偏差)校准。
2 结果 2.1 莱茵衣藻pepc2基因的克隆与正反向叶绿体表达载体的构建BamH Ⅰ酶切pET-28a-forw-pepc2后片段为639 bp(图 1)，该片段凝胶回收后送公司测序，BLAST结果显示与GenBank中Crpepc2序列的同源性达到99%，证明目的片段即为Crpepc2部分片段。
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图 1 PCR扩增产物电泳图
Fig. 1 PCR amplification of Crpepc2 fragment
Marker:DL15 000(TaKaRa) |
Crpepc2基因正反向叶绿体表达载体(pASapⅠ-forw-Crpepc2和pASapⅠ-reve-Crpepc2) 的构建图谱见图 2。
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图 2 Crpepc2基因正反向叶绿体表达载体(pASapⅠ-forw-Crpepc2和pASapⅠ-reve-Crpepc2) 构建图谱
Fig. 2 Construction of the forward and reverse recombinant vectors pASapⅠ-forw-Crpepc2 and pASapⅠ-reve-Crpepc2
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获得重组质粒后，先用普通PCR(图 3a)鉴定；再用Pst Ⅰ酶切鉴定基因的插入及插入方向(图 3b)。用BamH Ⅰ单酶切并连接后会出现正反向连接两种情况，正向连接载体pASapⅠ-forw-Crpepc2和反向连接载体pASapⅠ-reve-Crpepc2，所以将PCR产物为阳性的载体通过Pst Ⅰ酶切鉴定插入方向，正向pASapⅠ-forw-Crpepc2的酶切产物为：33, 60, 80和7 120 bp四条带；反向pASapⅠ-reve-Crpepc2的酶切产物为：60, 33, 520, 6 680 bp四条带。
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图 3 载体pASapⅠ-forw-Crpepc2和pASapⅠ-reve-Crpepc2的PCR扩增和酶切鉴定
Fig. 3 PCR identification and restriction identification of pASapⅠ-forw-Crpepc2 and pASapⅠ-reve-Crpepc2
(a) Crpepc2基因的PCR鉴定结果，M为DL15 000; (b) Pst Ⅰ酶切结果(反向：pASapI-reve-Crpepc2;正向: pASapⅠ-forw-Crpepc2); M为Wide-Range DNA Ladder (TaKaRa) (a) PCR result of Crpepc2 gene, Marker: DL15 000; (b) Result of Pst Ⅰ restriction enzyme digesting (reverse:pASapⅠ-reve-Crpepc2; forward: pASapⅠ-forw-Crpepc2); Marker: Wide-Range DNA Ladder (TaKaRa) |
利用基因枪法分别将pASapⅠ(空质粒)，pASapⅠ-forw-Crpepc2和pASapⅠ-reve-Crpepc2转化莱茵衣藻cc-400，用含氨苄青霉素的固体培养基筛选阳性转化藻株，每种转化株均有3个平板作为平行。转化株培养基中抗生素浓度从50 μg/mL增加至150 μg/mL该过程中野生型藻株不具有抗性会被杀死，经过50 μg/mL，100 μg/mL，150 μg/mL依次递增的抗生素固体培养基初步筛选转化株，随后还需用液体培养再次筛选，从抗生素浓度为150 μg/mL的平板中，挑取单藻落于50 mL锥形瓶中液体培养，每种转化株均挑取3个平板，每个平板随机挑取10个单藻落。培养5 d后共筛选到18株空质粒型，20株正向型和19株反向型阳性转化藻株，将这些纯种转化株重新涂平板保存(图版)。野生型不具有抗生素抗性，藻体逐步死亡，平板涂布培养的野生型在抗生素浓度为50 μg/mL时可生长；当抗生素浓度至100 μg/mL时野生型藻落第3天开始泛黄，第5天泛白并死亡。当抗生素浓度提高至150 μg/mL时，划线培养的野生型藻株无法生长。
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图版 基因枪轰击后，固体培养基筛选突变体莱茵衣藻 Plate After particle bombardment, the screening of mutants in solid medium 1.正向型突变株氨苄青霉素浓度(150 μg/mL)；2.空质粒型突变株氨苄青霉素浓度(150 μg/mL)；3.反向型突变株氨苄青霉素浓度(150 μg/mL)；4.野生型氨苄青霉素浓度(150 μg/mL) 1. Forward mutant concentration of ampicillin (150 μg/mL); 2. Blank type concentration of ampicillin (150 μg/mL); 3. Reverse mutant concentration of ampicillin (150 μg/mL); 4. Wild type concentration of ampicillin (150 μg/mL) |
以莱茵衣藻18S为内参基因，利用RT-qPCR检测野生型和突变体莱茵衣藻pepc2基因的相对表达量(图 4a)，正向型Crpepc2的表达量最高，为野生型的301.16%(P < 0.01)；反向型Crpepc2的表达量最低，仅为野生型的10.03%(P < 0.01)，空质粒型与野生型相差不大为98.21%(P>0.05)。
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图 4 调控莱茵衣藻pepc2基因表达后，pepc基因的相对表达量
Fig. 4 After regulating the pepc2 expression of Chlamydomonas reinhardtii cc-400, the Crpepc expression of wild type and mutants determined by RT-qPCR
误差棒是根据3次重复实验得出平均值(±SD)，图 5-7同 The bar graphs represented the mean data of relative gene expressions and standard deviations of three biological replicates (±SD), the same in fig. 5-7 |
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图 5 调控莱茵衣藻pepc2基因表达后，4种藻株的生长状况
Fig. 5 After regulating the pepc2 expression of Chlamydomonas reinhardtii cc-400, the growth of wild type and mutants
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图 6 调控莱茵衣藻pepc2基因表达后，4种藻株总蛋白含量
Fig. 6 After regulating the pepc2 expression of Chlamydomonas reinhardtii cc-400, the total protein of wild type and mutants
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图 7 调控莱茵衣藻pepc2基因表达后，4种藻株的油脂含量与脂肪酸含量
Fig. 7 After regulating the pepc2 expression of Chlamydomonas reinhardtii cc-400, the lipid content of wild type and mutants
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调控Crpepc2基因表达后，对Crpepc1基因的影响见图 4b，4种藻株Crpepc1的相对表达量相差不大，说明本次调控Crpepc2基因表达对Crpepc1基因没有太大影响。
2.4 生长曲线调控莱茵衣藻pepc2基因的表达后，其生长状况见图 5。细胞计数法可以直观地反映出藻株的生长状况。起始接种浓度OD750 0.03，第4天进入对数生长期，细胞数目在7天左右达到峰值(图 5a)。对比调控Crpepc2基因表达后莱茵衣藻野生型和突变株生长状况发现，3种突变体的生长状况并没有被抑制，反向型生物量最高，第7天可以达24 750 ind/mL。OD750细胞浓度也有相同的趋势，第4天进入对数生长期，第7天之后OD750的值开始趋于稳定。
2.5 总蛋白质图 6是莱茵衣藻总蛋白含量，野生型的总蛋白为441.82 μg/mL；空质粒型总蛋白含量为432.73 μg/mL；空质粒型的蛋白质含量与野生型并无显著性差异(P>0.05)；正向型含量为605.45 μg/mL，比野生型增加了37.03%(P < 0.01)；反向型含量为314.55 μg/mL，比野生型减少了28.81%(P < 0.01)。
2.6 油脂和脂肪酸含量4种藻株的油脂含量见图 7a。野生型油脂含量为20.62%；空质粒型油脂含量为24.5%，比野生型增加了18.82%(P>0.05)；正向型油脂含量为18.98%，比野生型减少了7.95%(P>0.05)；反向型油脂含量为35.12%，比野生型增加了70.32%(P < 0.01)。脂肪酸含量变化见图 7b，反向型脂肪酸含量明显增加，其中C16:0增加了43.34%(P < 0.01)；C16:1增加了46.53%(P < 0.01)；C16:2增加了38.53%(P < 0.01)；C18:1增加了61.08%(P < 0.01)；C18:2增加了63.97%(P < 0.01)；C18:3增加了70.19%(P < 0.01)；正向型突变株C16:1减少了59.10%(P < 0.01)。
3 讨论PEPC位于C代谢的关键位置，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成草酰乙酸(OAA)，随后进入三羧酸循环(TCA)，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸代谢中的限速酶，ACCase与PEPC竞争相同的底物PEP，以此来决定碳代谢[28]。虽然PEPC并非是脂质代谢中的直接关联酶，但是根据陈锦清等提出的“底物竞争说”[29]，丙酮酸是PEPC和ACCase酶共同竞争底物，如果抑制PEPCase的表达，则有利于碳代谢合成脂肪酸。目前已经有学者发现PEPC表达量与油脂含量呈反比，DENG等在2011年和2014年用基因敲除法抑制Crpepc1与Crpepc2基因的表达，结果均发现油脂含量提高，但基因敲除方法太强烈，基因敲除后对莱茵衣藻的生长影响未见报道[14-15]。本实验室在陈锦清等[29-30]的启发下用正反向载体法在蓝藻[13]、衣藻[22]中探究pepc基因表达与其代谢产物的关系，该方法已经相对成熟，故本研究用正反向载体法调控Crpepc2基因表达，克隆了莱茵衣藻pepc2部分片段639 bp，该片段位于莱茵衣藻“细菌型”PEPC的保守序列Ⅰ，该区域可催化草酰乙酸的合成，且包含一个活性位点(H)[9]。构建了正反向和空质粒型叶绿体表达载体，探究PEPC表达对莱茵衣藻蛋白质油脂代谢产物的影响。
莱茵衣藻基因工程中外源基因的转化以叶绿体转化效率最高，利用叶绿体的原核性，使得转入的外源基因通过母系遗传直接传递给子代, 转化子能稳定遗传[26]。叶绿体表达有很多优点，但用叶绿体表达法调控PEPC的表达国内外均未报道，因此本研究用莱茵衣藻叶绿体表达质粒pASapⅠ，启动子atp A，上下游同源片段psb H，构建了叶绿体表达载体pASapⅠ-forw-Crpepc2和pASapⅠ-reve-Crpepc2并转化莱茵衣藻cc-400，对比Crpepc2基因过表达突变株(正向)，抑制表达突变株(反向)与野生型、空质粒型在生理生化方面的异同，结果发现，除PEPCase活性表达和生长特性外，还有两个特点：反向型油脂含量提高了；正向型蛋白质含量提高。
本实验发现莱茵衣藻Crpepc2基因的表达量被调控，PEPC酶活性也被调控，但并没有影响转基因藻株的正常生长，也证明了正反向表达载体法的可行性。正向突变株有较高的PEPCase活性，促进了蛋白质的积累，在高等植物中也有这样的先例，表达了谷氨酸棒状杆菌PEPC的转基因种子中，PEPC催化PEP补缺反应的增强导致光合产物糖和淀粉流向游离氨基酸的合成，导致转基因种子中蛋白质含量提高了20%[31]，但在莱茵衣藻中是首次被证明。反向突变株PEPCase活性被抑制促进了油脂的生物合成，用反义基因法抑制欧洲油菜的PEPCase活性，导致共同底物PEP流向脂质积累[32]，DENG等抑制Crpepc2基因
表达后油脂含量增加了14%~28%[14]，本研究反向突变株油脂含量增加了70.32%。不仅如此反向突变株的脂肪酸含量也增加了，尤其是C16-C18的不饱和脂肪酸，C16-C18脂肪酸也是生物柴油的主要成分, 目前生物柴油的难点是在生长和含油率中找到平衡点，而反向突变株油脂含量提高且生长迅速，今后可为高产油工程藻做贡献。首先本实验成功构建了莱茵衣藻pepc2基因的正反向叶绿体表达载体，并通过荧光定量PCR方法检测了Crpepc2的相对表达量，目前还未发现Crpepc2基因叶绿体表达的相关报道。其次，PEPC可以调控光合产物的分配，过表达的PEPC促进蛋白质的合成，抑制PEPC的表达促进脂质的合成，且调控PEPC表达，对突变株的生长影响不大。综上所述，莱茵衣藻“细菌型”PEPC可以调控蛋白质和脂肪酸含量，且不影响藻的生长，反向型突变株脂质含量的提高对构建高产油工程藻是一个突破。
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