2. 上海水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306;
3. 水产动物遗传育种上海市协同创新中心, 上海 201306
生物絮凝养殖系统因具有水处理效果好,蛋白质利用效率高,能提高养殖对象的免疫力等特点,已成为国内外研究的热点[1-2]。目前,国内应用生物絮凝技术养殖南美白对虾的研究开始由实验阶段过渡到中试规模的养殖试验[3-4],这种养殖系统的运行需要满足定期添加碳源,充分的搅拌混合和充足的溶氧等条件,以保证异养细菌的稳定繁殖和生物絮体悬浮[5]。
1999年,AVNIMELECH[6]首次将C/N在水产养殖中的应用量化, 通过饲料蛋白的溶失率、微生物同化效率和碳源的含C量等计算出投喂1 kg饲料(30%~45%CP)需要添加465.0~697.5 g碳源(含C量50%), 氨氮(TAN)才能被微生物有效地同化成为微生物蛋白。EBELING等[7]通过化学计量工程分析的方式得出异养细菌代谢1 kg饲料(30%~45%CP)中的氨氮需要添加380.0~710.0 g C6H12O6(含C量40%)。在高密度的养殖系统中,若按以上公式计算每日投糖量,在养殖后期,每日需要投入大量的碳源,且需要不间断地补充纯氧和定期去除悬浮固体才能保持养殖水体充足的溶氧。这大大增加了工作量和养殖成本。RAY等[8]研究发现自养系统的总悬浮固体物(Total suspended solids,TSS)含量明显要比异养系统的低,而且整个养殖过程不需要添加碳源,耗氧量也少。目前,COHEN等[9]研究已证实生物絮凝养殖过程中不仅发生了异养细菌的同化作用,也发生了自养细菌的硝化作用,这两种途径均能有效地把有毒性的TAN转化,使得养殖水质环境安全可控。但在系统构建前期,异养同化作用发生的时间远比自养硝化作用要早。因此,通过调整投糖量,在养殖前期建立以异养同化为主,中期转换成以自养硝化为主的水处理途径,应用在高密度养殖南美白对虾(Litopenaeus vannamei)的生物絮凝系统中具有重要意义。
本实验在养殖前期通过添加碳源,提升系统的生物絮体含量,养殖中期降低碳源添加量至零,驯化异养型生物絮体转化成硝化型生物絮体,探索整个养殖过程系统的水质变化、生物絮体的细菌群落结构变化和南美白对虾的生长情况,为硝化型生物絮体在对虾养殖系统的应用提供了技术参考。
1 材料与方法 1.1 实验地点及设施实验于2015年10月—2016年1月(100 d)在江苏省南通市启东市王鲍镇畴丰农业有限公司的室内养殖场进行,跑道式养殖系统由上海海洋大学设施与渔业实验室设计(图 1)。系统主要由跑道式混凝土养殖池(图 1-2)、生物滤池(图 1-11)和气液混合装置3部分组成(图 1-12)。养殖池主体尺寸为18 m ×2.5 m ×1.3 m,两端各有一个直径为2.5 m的半圆区,池子中间的隔墙(图 1-3)厚度为0.18 m,高1.3 m,池底两边各有两个斜板集污槽(图 1-4),集污槽中间有排污口(图 1-5),池子水深1 m,有效养殖水体体积为39 m3。每个跑道水池配置一台叶轮(功率为0.37 kW/h,转速为30 r/min,图 1-1),以推动水体沿跑道循环流动。
养虾池一侧配有一套外置水处理设备。外置水处理设备经水泵(功率0.18 kW/h;流速10 T/h,图 1-9)、进水管(图 1-8)和出水管(图 1-7)与养殖池相连,构成循环跑道式系统。外置水处理设备规格为长2.5 m ×1.40 m ×1.65 m,由4个依次底部连通的生物滤池(总工作体积3 m3,图 1-11)、一个低压气液混合装置(工作体积50 L,流量:3 L/min,图 1-12)和一个生物絮体驯化槽(工作体积30 L,图 1-10)构成。
本次实验采用3套跑道式养殖系统,每个养殖池底部布置12个纳米曝气盘,连接一台罗茨鼓风机(功率2.2 kW/h),用于养殖池水体和生物滤池的增氧,同时配置一个锅炉,沿跑道池底一圈铺有加热管道(图 1-13),水管连接锅炉水,用于水体加温。
1.2 实验用水预处理养殖池放进少量的井水后,按20 mg/L的浓度泼洒漂白粉,全池消毒12 h后,排干。海水(盐度25) 经100目网袋过滤后进入蓄水池,经消毒-曝气-沉淀处理后转移到3个养殖池中,每个养殖池进海水约16 m3,然后补充自来水淡化盐度至10。每池接种20 L的驯化成熟的浓缩絮体(上海海洋大学循环水养殖系统研发平台提供),每三天补充100 g粉料/池,每日添加50 g C6H12O6/池,运行两周后,开始放苗。
1.3 实验的设计和养殖管理不带特定病原的虾苗购自海南省的育苗场,2015年10月28号晚上放苗,虾苗规格为(0.8±0.1) cm,每池放养密度为685尾/m3。放苗前一小时停止叶轮运行,第二天后再开启。以后每次投喂饲料前,停叶轮1.5 h后再开启。放苗后第二天开始投喂第一顿,养殖所用的饲料购自正大饲料有限公司(CP≥42%, 南美白对虾配合饲料)。
每天分5次投喂饵料,分别在6:00、10:00、14:00、18:00、24:00。体长小于1 cm时,投饵量占体质量的10%~15%;体长1~3 cm时,投饵量占体质量的7.0%~10.0%;体长3~7 cm时,投饵量占体质量的3.0%~4.5%;体长7~10 cm时,投饵量占体质量3%~4.5%,体长大于10 cm时,投饵量占体质量的2.0%~3.0%。为了准确掌握投饵量,每个养殖池放2个食台,1.5 h后查看料台。
养殖过程所用的碳源是一水葡萄糖(C6H12O6·H2O,纯度≥99%,含C量36.0%,呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司生产),用小苏打(NaHCO3,总碱度:99.0%~100.5%,桐柏博源新型化工有限公司生产)调节pH和碱度。葡萄糖添加时间为每天11:00和16:00,日投糖量参考AVNIMELEMCH[6]和EBELING等[7]总结的碳源添加量计算公式并结合水质情况调整(表 1)。当投糖量较多时,投糖前补充纯氧。当pH低于7.8时,补充NaHCO3, 慢慢调节pH至8.0。每3天补充一次微量元素。整个养殖期间不换水也不去除部分TSS,每隔两周添加一次自来水,补充蒸发掉的水分。
每天上午7:00用WTW便携式多参数水质分析仪(Multi 3430,德国)测池水pH、溶解氧(DO)、温度(T)、盐度(Salinity)。每5天上午8:00取水样,经0.45 μm滤膜过滤后测定总氨氮(TAN),亚硝酸盐氮(NO2--N)、硝酸盐氮(NO3--N)、正磷酸盐(PO43--P)和碱度(Alkalinity)。每5天测量一次总悬浮颗粒物(Total Suspended Solids,TSS)和絮体体积(Floc Volume,FV)。TAN含量的测定采用水杨酸-次氯酸盐光度法(752S紫外可见分光光度计,上海棱光技术有限公司生产,下同),NO2--N含量的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法,NO3--N含量的测定采用紫外分光光度法,PO43--P含量的测定采用钼锑抗光度法,碱度的测定采用酸碱指示剂滴定法,TSS含量的测定采用称重法[10]。FV的测定参考AVNIMELEMCH和KOCHBA[11]使用的方法,用英霍夫管取1 000 mL水样, 静置30 min后,悬浮物的沉积量即为FV。
1.4.2 生物絮体细菌样品的采集与测序生物絮体菌样的采集 根据实验的进程每池每次随机取50 mL养殖水,保存于-80 ℃冰箱中。实验结束后送样至上海欧易生物医学科技有限公司进行高通量测序。
生物絮体的细菌DNA提取和PCR扩增 使用E.Z.N.A.® soil DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取生物絮体的细菌DNA,使用16S rDNA的V3V4区特异引物343F和798R进行PCR扩增。每个样本重复3次。
IlluminaMiSeq测序 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳测定,回收目标条带。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.)进行纯化并使用QuantiFluorTM-ST (Promega, U.S.)进行定量, 纯化的产物进行相应比例的混合后在IlluminaMiSeq平台进行equimolarand双末端测序。
测序数据处理由 Illumina Miseq测序所得数据进行去杂并拼接,使用Trimmomatic软件对原始双端序列进行去杂。去杂后的双端数据使用FLASH软件进行拼接。拼接后的原始数据接着进行精准去杂,去除低质量的碱基序列以及模糊碱基序列。随后对去杂后的数据采用usearch去除嵌合体序列,最终得到较优质的序列,进行下游分析。
OTU聚类和物种注释 首先进行挑选OTU步骤,即对所有的优质序列使用CD-HIT方法以97%相似度进行OTU分类,97%相似度即对应物种分类到属的一个水平分类标准。随后统计各个样品包含的OTU种类以及每个OTU中含有的序列的比例。并且对每个OTU挑选出代表序列,同时,将所有代表序列与Greengenes数据库比对,通过RDPclassifier Naive Bayesian分类算法对代表序列进行分类注释。分别在门(phylum)、纲(class)和属(genus)的分类水平上统计样本的群落丰度和组成。
1.4.3 南美白对虾生长性能的测定实验结束,随机捞起南美白对虾50尾/池,测量虾的体质量、体长。记录每个养殖系统南美白对虾的总产量(Total Production,kg/m3)、成活率(Survival Rate,RS,%)、特定生长率(Specific Growth Rate,RSG,%)、饲料系数(Feed Coefficient Rate,RFC)。计算公式如下:
式中:Nf和Ni分别为终末存活尾数和初始投放尾数,T0和T1分别为养殖第一天和最后一天,W1和W0分别为时间T1和T0的平均体质量(g),F为饲料总投喂量,Wf和Wi分别为终末总质量和初始总质量。
1.5 数据的分析与处理采用SPSS 17.0对数据进行单因素方差分析,实验结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示。
2 结果 2.1 日常水质的变化本套系统采取24 h鼓风增氧结合投糖前补充纯氧的增氧方式,整个养殖期间溶解氧能够保持在(6.80±0.70) mg/L,变化范围为5.13~7.97 mg/L。高的溶解氧水平保证系统顺利进行高密度养殖对虾。系统利用锅炉加热能较好地保持养殖水体的温度在(27.90±1.30) ℃,变化范围为23.8~29.5 ℃,保证南美白对虾顺利越冬。养殖期间,养殖水体的pH为7.80±0.13,碱度为(237.90±67.40) mg CaCO3/L,能满足硝化型生物絮体的驯化和南美白对虾的生长需求。
TAN浓度在0~25 d处于上升阶段。25 d,TAN浓度达到最高(0.81±0.14) mg/L。25~40 d,TAN浓度快速下降,40~99 d略有上升后逐渐趋于稳定水平(图 2a)。NO2--N浓度在养殖0~20 d一直处于较低水平。随着投饵量的增加,从20 d开始NO2--N浓度快速上升并在第45天到达最高(8.08±1.85) mg/L后快速下降(图 2b)。NO3--N和PO43--P浓度变化的趋势相似(图 2c和2d),在0~40 d都保持较低浓度,在40 d以后开始快速上升,直至99 d,NO3--N和PO43--P最高浓度分别达到(207.13±35.10) mg/L和(22.18±2.87) mg/L。
养殖前期,FV和TSS的含量同时增加(图 3)。随着投糖量的减少,在养殖55~75 d,FV和TSS含量出现缓慢下降。但随着投喂量的持续增加,75 d后即使没有添加碳源,FV和TSS含量仍出现上升,在养殖99 d时,最高浓度分别达到(53.67±6.03) mL/L和(709.5±95.46) mg/L。
2.2 养殖期间生物絮体的细菌群落的动态变化由图 4可知,在门水平上,整个养殖期间,Proteobacteria(变形菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)一直都是主要的优势菌群,其次是Actinobacteria(放线菌门)和Planctomycetes(浮霉菌门)。TM7门在养殖32 d和51 d成为主要优势菌群。Cyanobacteria(蓝藻细菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)在养殖周期内的变化趋势相似,在养殖1、15 d的丰度远高于养殖32~99 d的丰度。Nitrospirae(硝化螺旋菌门)在养殖1 d和15 d时,丰度较低,60 d开始呈上升趋势。
由图 5可知,纲水平上,整个养殖期间丰度一直比较高的优势菌群是α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)。黄杆菌纲(Flavobacteria)和γ-变形纲(Gammaproteobacteria)在60~99 d的含量要比1~51 d的要高。其中TM7-3在养殖32 d和51 d时含量较高,成为主要优势菌群之一。Bacilli(芽孢杆菌纲)在养殖1 d、15 d的含量较高,32~100 d的含量较低。放线菌纲(Actinobacteria)在32 d成为优势菌群之一。硝化螺旋菌纲(Nitrospira)在养殖1~51 d含量一直很低,但在60~99 d,一直在增加。
氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸氧化细菌(NOB)在60~99 d的丰度明显要比0~51 d的丰度要高(表 2)。Nitrosomonas(亚硝化单胞菌属)和Nitrosovibrio(亚硝化弧菌属)的含量极低,其中有一类属于亚硝化单胞菌科的尚未分类的菌属成为系统氨氧化细菌(AOB)的优势菌属。亚硝酸氧化细菌(NOB)中,Nitrospira(硝化螺旋菌属)的含量在1~51 d一直处于较低水平。随着投糖量减少至零,在51~72 d,其丰度快速增长,72~99 d,其丰度增长速度减缓。另一类尚未分类属的亚硝酸氧化细菌(NOB)在0~71 d尚未检测到,但在81~99 d呈增加的趋势。0~32 d,总硝化细菌的丰度波动明显,32~60 d,总硝化细菌的丰度呈多倍数量增长,60~99 d,总硝化细菌的丰度增长变化趋于平缓。
本次实验在放养密度685尾/m3条件下,养殖100 d后,总C6H12O6·H2O和总NaHCO3添加量分别占总投饵量的41.03%±7.86%和27.56%±1.93%,南美白对虾的存活率和产量分别为43.35%±7.57%和(3.03±0.59) kg/m3(表 3)。
生物絮凝养殖系统中,异养细菌利用碳源增殖需要消耗养殖水体中大量的溶解氧[7]。本研究在养殖30~65 d,每次添加碳源前都需要补充纯氧,才能保证溶解氧大于5.0 mg/L。但在65 d后不再添加碳源情况下,仅需要鼓风增氧就能满足高密度对虾的生长需求,节省了碳源成本和供氧成本。
残饵和粪便的积累往往会导致养殖水体TAN和NO2--N含量升高,严重时可引起对虾中毒,影响对虾生长。GAONA等[12]研究表明富含絮体的养殖水可以维持低水平的TAN和NO2--N。但也有一些研究发现在高密度的零水交换养殖系统里,仅靠异养同化为主的水处理方式,仍然出现TAN和NO2--N积累[13]。本研究发现养殖前期,随着葡萄糖持续添加,促使了异养细菌生长,降低了TAN的浓度,但是对NO2--N的积累没起到很好的抑制效果,这与ARNOLD等[14]研究的结果相似。猜测可能因为养殖前期,异养细菌利用TAN的效率远比NO2--N要高,而且亚硝酸盐氧化细菌比氨氧化细菌挂膜速度要慢,导致了NO2--N的积累[15]。养殖第45天开始,NO2--N快速下降并伴随着NO3--N的明显积累,这表明硝化细菌尤其是亚硝酸盐氧化细菌(NOB)已经在生物絮体中挂膜成功。随着碳源的添加量减少(51~65 d),TAN浓度先升高后再次出现下降,NO2--N浓度并没有出现明显积累。因此综合TAN、NO2--N和NO3--N浓度随碳源添加量减少而变化的规律,可以初步判断硝化型生物絮体在60 d时已被驯化成熟。自养细菌的硝化作用比异养细菌的同化作用能更好抑制NO2--N浓度的积累,保证养殖水环境的安全稳定。
在养殖南美白对虾的生物絮凝系统中,NO3--N和PO43--P常常是积累的[16]。SAMOCHA等[17]在高密度零水交换养殖系统中利用沉降池去除TSS的方式,在养殖周期内平均NO3--N浓度为(220±84) mg/L。本次研究中,NO3--N浓度最高达到(207.23±35.10) mg/L,接近KUHN等[18]建议的NO3--N安全浓度(220 mg/L)。PO43--P含量在养殖0~40 d时,一直维持较低,可能是生物絮体中的聚磷菌吸收了部分的可溶性磷[19]。
随着饲料和碳源添加量的增加,异养细菌可利用碳素和氮素快速增加细菌生物量,从而增加絮体含量。SAMOCHA等[20]研究表明TSS>500 mg/L时仍然适合养殖南美白对虾。本研究在100 d的养殖周期内,系统不交换水也不去除部分TSS,TSS的含量最高达到(709.5±95.46) mg/L。随着投糖量的减少,FV和TSS浓度缓慢下降,推测可能因为投糖量的减少,部分异养细菌死亡,导致生物絮体浓度下降,但是随着投喂量的持续增加,养殖后期TSS的浓度仍会升高。受碳源、搅拌程度和细菌群落结构等因素的影响,不同的养殖环境,絮体的粒径以及疏松程度存在差异,相同FV的含量,对应的TSS含量往往不同。RAY等[21]研究表明通过外置沉降室的生物絮凝系统去除59%TSS,NO3--N可以减少60%,本研究在65 d以后不再添加碳源,系统形成了以自养硝化为主的水处理途径。这说明驯化硝化型生物絮体的高密度零水交换的对虾养殖系统在不去除部分TSS的情况下,仍能保证NO3--N和TSS浓度在适合对虾生长的范围内。
自养细菌和异样细菌的繁殖都需要消耗碱度,但相比异养细菌,自养细菌消耗的碱度更多[7]。FURTADO等[22]研究发现在零水交换的系统中, 碱度在70 mg CaCO3/L以上,pH≥7.38的条件下才能保证絮体的形成和硝化细菌的挂膜。CHEN等[23]建议要保证零水交换的系统中高效率的硝化作用,碱度应维持高于200 mg CaCO3/L。DAVIDSON等[24]报道在低水交换率的循环水系统中每投喂1 kg饲料(CP≥41%)需要添加大约0.15~0.22 kg NaHCO3,以维持碱度接近200 mg CaCO3/L。本次研究中,总NaHCO3的添加量占饲料(CP≥42%)投喂量的27.56%±1.93%,可以维持pH和碱度分别在7.80±0.13和(237.90±67.40) mg CaCO3/L。造成较高的投碱量可能因为硝化型生物絮体的形成消耗了大量的碱度以及养殖水体长期维持较高水平的pH所致。
3.2 驯化硝化型生物絮体对生物絮体的细菌群落变化的影响碳源的添加量影响生物絮体的细菌群落结构[25]。异养型生物絮凝养殖系统内生物絮体的细菌群落主要优势菌是变形菌[26-28]。变形菌成为优势菌群,有利于促进系统的有机物分解和营养物质去除。本研究中利用高通量测序技术分析养殖南美白对虾的系统中驯化硝化型生物絮体对细菌群落在整个养殖周期内的丰度变化的影响,分析结果发现受碳源添加量的影响,生物絮体的细菌群落丰度发生明显改变,厚壁菌门和硝化螺旋菌门的细菌丰度变化呈两极分化。60 d时,硝化螺旋菌门的丰度开始增加,厚壁菌门丰度下降。72 d时,因缺乏外源碳源的添加,硝化螺旋菌门的丰度(0.79%±0.95%)开始超过厚壁菌门(0.43%±0.11%)的丰度。在门水平上,异养型和硝化型生物絮体始终占优势的菌群都是Proteobacteria(变形菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)。在纲水平上,异养生物絮体的优势菌群是Alphaproteobacteria(α-变形菌纲),而硝化型生物絮体的优势菌群有Alphaproteobacteria(α-变形菌纲)、Flavobacteria(黄杆菌纲)和Gammaproteobacteria(γ-变形纲)。本次研究检测到整个养殖过程都存在芽孢杆菌。但随着养殖的进行,因外源碳源的缺乏,芽孢杆菌的增长受到抑制。值得注意的是,本次研究在生物絮凝养殖系统中首次检测到丰富的待定门TM7。TM7-3纲属于TM7门的一个分支,属于一类环境耐受力超强的异养型细菌,可以利用碳源增长并与酸杆菌、厚壁菌等发生竞争关系,极易大量繁殖且具致病性[29]。本研究中TM7-3在32、51 d期间发展成优势菌群之一,分别占18.06%和33.23%。这可能是养殖前期碳源的添加也刺激了TM7-3的增长,导致芽孢杆菌等异养菌等增长受抑制而含量较低。这表明高含碳量的养殖水体也存在一定的风险,可能会促使某些致病性异养细菌在竞争中处于优势。
养殖系统的硝化细菌往往需要5~7周的时间去培养才能显著减低TAN和NO2--N的浓度[9, 14, 30]。本次研究中,整个系统中硝化细菌群落结构比较单一,氨氧化细菌(AOB)仅有一类属于亚硝化单胞菌科的尚未分类的菌属在整个养殖周期内是优势菌属(0.01%~1.06%)。硝化螺旋菌门的Nitrospira(硝化螺旋菌属)属于亚硝酸盐氧化菌(NOB)的主要优势菌属,参与氧化NO2--N成为NO3--N的过程[31]。尽管高通量检测发现在养殖初期已存在氨氧化细菌,但Nitrospira(硝化螺旋菌属)含量极低,甚至在养殖15 d和32 d检测不到它们的丰度,在72 d后发展成为了生物絮体中硝化细菌的优势菌属(0.79%~1.23%)。猜测可能是受外源碳源添加的影响,异养细菌的繁殖抑制硝化螺旋菌属的增长,导致NO2--N在养殖前期出现积累。直到45 d,NO2--N的浓度开始出现下降,这与前人的研究发现基本一致。猜测可能是一方面高浓度的NO2--N刺激了亚硝酸盐氧化细菌的快速增长,另一方面TSS的持续增加为硝化细菌的顺利挂膜提供充足的场所。微生物的生长需要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。由硝化细菌的丰度变化趋势可知,本研究中硝化细菌在60~72 d,开始由对数期(32~60 d)进入稳定期(72~99 d),硝化细菌的丰度的增长速度减缓并趋于平稳波动,TAN和NO2--N浓度均处于较稳定的低水平,标志着成熟的硝化型生物絮体已被成功驯化。
3.3 驯化硝化型生物絮体对南美白对虾生长性能的影响研究证实生物絮体能为养殖对象提供营养来源[32-34]。自养型生物絮体和异养型生物絮体均能提升南美白对虾的生长和存活[35]。
蒲利云等[36]利用循环系统养殖南美白对虾成虾,养殖周期为152 d, 对虾的存活率为48.16%~56.72%, 产量为2.99~3.47 kg/m3。张许光等[37]研究在异养型生物絮凝系统养殖南美白对虾,每天按饲料(42%CP)投喂量的70%在水体中添加赤砂糖,养殖周期113 d,对虾的存活率为25.0%~75.3%,产量为1.53~4.01 kg/m3。本次研究在驯化硝化型生物絮体系统中养殖南美白对虾, 65 d后不添加碳源的情况下,直至收获时,总投糖量/总投饵量为41.03%±7.86%, 产量(3.03 kg/m3)和存活率(43.35%)与上述报道结果相近,但均高于刘军等[38]利用温棚高位池换水系统养殖南美白对虾的产量(0.6~0.7 kg/m3)和存活率(32.3%~38.9%)。这表明对虾生活在富含硝化型生物絮体的系统中,也能保证健康生长和存活,提高养殖效益。本次研究表明养殖前期利用碳源的添加,提升异养型生物絮体的含量,使系统顺利渡过硝化细菌缓慢增长期并为硝化细菌的附着提供场所,直至NO2--N浓度下降,NO3--N浓度升高,开始逐渐降低投糖量至零,系统转为培养硝化型生物絮体的调控方式,可以有效地调控水质,保持稳定的养殖水环境,促进对虾的健康生长,降低投入成本和提高养殖利润,这对生物絮凝养殖系统管理的更新具有重要推进作用。
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