2017,
Vol. 26
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国淡水养鱼的主要品种，其产量约占淡水养殖总产量的20%[1]。但草鱼养殖生产中病害多，其中以高发病率、高死亡率的病毒性出血病、细菌性烂鳃病、肠炎病、赤皮病等草鱼“四病”最为严重，直接影响草鱼养殖的经济效益[2-3]。近年来草鱼养殖病害防治的重要手段主要是采用抗生素类化学药物，但长期使用抗生素，势必污染水体环境，而药物的残留更是威胁人体健康，且易导致病原体产生抗药性，致使水产养殖动物病害更加难以控制。以中药理论为基础配伍中草药在防治草鱼病害上可取得良好效果，然而渔用中草药药材存在加工工艺原始，剂型单一，剂量使用偏大，适应性差，药效、药理等基础研究薄弱，尚未制定规范的产品标准和使用剂量等缺点[4-5]。
随着当今对绿色环保食品及环境保护的要求提升、免疫学技术的发展，对接种疫苗防治水产动物疾病方法的研发与应用已成为当前水产养殖的热点。国外20世纪70年代即获得首个商品化疫苗[6]，近年来更是飞速发展，在北美、南美、北欧、东亚等主要水产养殖地区设立了工业化生产基地，并在各养殖区普遍使用，收到显著效果；据不完全统计，至2012年全球商业化生产的水产疫苗已超过140种[7]，国内则已有草鱼出血病细胞灭活疫苗、鱼用嗜水气单胞菌灭活疫苗和牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗以及草鱼出血病活疫苗获得国家新兽药证书，其中鱼嗜水气单胞菌灭活疫苗、草鱼出血病活疫苗取得商品化生产批准文号[8-9]。有益微生物在水产养殖中的应用也日益被接受和重视，在短短十多年时间内，以迅猛的势头发展并应用于水产养殖业，在促进养殖动物个体健康与改善养殖环境方面起到了不可估量的作用，当前水产养殖中主要使用的益生菌有弧菌、假单胞杆菌、芽胞杆菌和一些乳酸菌[10]。
本研究通过疫苗与有益微生物联用，以分析二者在草鱼养殖中的协同作用效果，为解决当前水产养殖中病害频发、抗生素滥用、养殖环境恶化、病原耐药性加强和养殖动物药物残留等问题奠定基础，为水产养殖业朝着绿色健康养殖的方向发展提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验塘条件试验塘位于广东省中山市东升镇北洋水产养殖场，选择12口排水系统完善、壤土底质、保水性能好、旱涝无忧的相邻鱼塘，方向东南向，水深2.5 m，水面约0.13~0.17 hm2。试验前各鱼塘均已排干塘水、日晒2~3 d、回水，用二氯异氰脲酸钠进行水体消毒。将试验塘按照1-12分别编号，分别对每口池塘配置一台1.5 kW的增氧机，以防止因台风、高温低压、天气闷热造成缺氧死鱼影响试验结果。
1.2 试验组设置1-3号塘为对照组，未注射疫苗、未使用有益微生物；4-6号塘为使用有益微生物组，未注射疫苗、使用有益微生物；7-9号塘为四联苗组，注射草鱼出血病弱毒活疫苗及细菌性三联灭活疫苗、未使用有益微生物；10-12号塘为四联苗+有益微生物组，注射草鱼四联苗、使用有益微生物。
1.3 试验时间试验时间为2016年6月—2016年9月。
1.4 苗种及管理草鱼苗购自东升镇个体养殖场的同一批鱼，每池放养8 000尾，鱼种规格为10 g左右，个体健壮、无病，无疫苗注射记录。按当地传统养殖习惯，每个鱼池放养同等的混养鱼类，即鳙500~750 g/尾，750尾/hm2；鲫100~150 g/尾，6 000尾/hm2；鲤350~500 g/尾，300尾/hm2。投喂饲料均为通威“156 ”小颗粒草鱼饲料，日投放量为20%~30%，每30天根据鱼体重调整一次。日常管理按当地养殖四大家鱼的传统养殖方法管理，定期补足流失的水体。
1.5 疫苗的应用草鱼四联疫苗是由中国水产科学研究院珠江水产研究所研制的防治病毒性出血病的草鱼出血病冻干弱毒活疫苗与防治细菌性烂鳃病、肠炎病、赤皮病的细菌性三联灭活疫苗混合而成。鱼种放养前，集中在预先准备好的网箱，然后用连续注射器进行腹腔注射，0.2 mL/尾，疫苗注射后随机放养于7~12号塘，每口鱼塘放养8 000尾，做好放养记录。
1.6 有益微生物的应用有益微生物为广州普麟生物制品有限公司研制的“菌优碳源”，是含多种水产益生菌如酵母菌、芽孢杆菌、硝化细菌及短链碳源的有益微生物制剂，在4-6、10-12号池塘消毒后第3天使用一次，以后视天气情况约每隔10 d使用1次，使用前开增氧机。
1.7 水质因子监测每隔10天用YSI水质分析仪测定池塘水体的氨氮、亚硝酸氮、pH、溶解氧等水质指标，用赛氏盘测定水体透明度。
1.8 血清抗体效价的测定草鱼疫苗注射后的D7、D15、D30、D60、D90分别随机捞取2~3尾草鱼，尾静脉采血于灭菌离心管中，4 ℃过夜，2 000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存。采用间接ELLISA检测血清中的抗体效价，首先用100 μg/mL浓度的S11蛋白包被ELLISA板，再添加已经稀释100倍的鱼体血清孵育，最后加载鼠抗鱼单克隆抗体，测定450 nm波长的OD值，得出血清中的抗体效价水平。
1.9 草鱼存活率统计实验结束后，排水取鱼，统计存活鱼数，计算各组的存活率、免疫保护率。
(1)
式中:SRP为免疫保护率(%)；RI为免疫组死亡率(%)；RC为对照组死亡率(%)。
1.10 草鱼生长性能测定草鱼放养后的D0、D30、D60、D90分别随机捞取30尾草鱼称重，重复3次，记录每组鱼的平均体重，计算D90时的净增重、增重率、特定生长率等生产性能指标。分别统计各组所投喂饵料的总数，计算饵料系数。
(2)
(3)
(4)
(5)
式中：WG为净增重(g)；RWG为增重率(%)；RSG为特定生长率(%)；F为饵料系数；W0为初始平均体重(g)；Wt为终末平均体重(g)；t为饲养天数(d)；Ft为总投饵量(kg)；WZ为总增重量(kg)。
2 结果 2.1 使用有益微生物对草鱼养殖水质的影响从图 1可知，养殖过程中泼洒有益微生物制剂“菌优碳源”有利于优化养殖水体环境。与空白对照组相比，有益微生物组水体中的氨氮、亚硝酸氮盐含量显著降低(P < 0.05)，在试验中、后期，氨氮浓度始终处于0.05~0.10 mg/L的较低水平，亚硝酸氮盐浓度由试验起始时的相对高浓度迅速降低，维持小于0.02 mg/L的较低水平。通过使用“菌优碳源”，使水体pH维持在8.2~8.4之间，保持养殖水体的弱碱性状态；使水体透明度保持在30~35 cm之间，优于对照组的40~50 cm；提高水体溶解氧含量，并维持在5.0~6.9 mg/L，高于对照组的4.0~5.3 mg/L(P >0.05)。
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图 1 有益微生物对养殖水体水质指标的影响
Fig. 1 The influence of beneficial microbes on water quality indicators
(a)氨氮; (b)亚硝酸氮盐; (c)pH; (d)透明度; (e)溶解氧 (a) Ammonia nitrigen; (b) Nitrite; (c) pH value; (d) Water transparency; (e) Dissolved oxygen |
从图 2可知，注射疫苗后的D7天，试验鱼已经产生抗体，增速较快，至D30时抗体效价达顶峰，随着时间延长，由D60、D90的检测结果可看出血清效价保持较为稳定、略微降低。从测定的结果分析，草鱼注射疫苗后的第7天，草鱼已经产生抗体，但抗体水平相对较低，免疫保护率不高；D15后有较高的效价，显示免疫保护作用，D30后完全激发鱼体的免疫保护作用。在注射四联疫苗的同时，不间断使用“菌优碳源”，可提高血清抗体效价水平，促进疫苗的免疫作用。
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图 2 草鱼免疫血清抗体效价检测结果
Fig. 2 The testing results of serum immune antibody titer of grass carp
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7—9月期间，试验鱼塘都有不同程度的发病死亡现象，从死亡的病鱼剖检检查发现，有出现烂鳃、赤皮和出血病，对照组尤为严重，各组存活率见表 1。结果显示，注射草鱼疫苗的鱼塘存活率高于对照塘，注射草鱼四联苗的试验组平均存活率比对照组高29.7%，差异极显著(P < 0.01)，四联苗组的平均免疫保护率为90.9%±1.6%。
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表 1 草鱼存活情况结果统计表 Tab.1 The survival statistics of grass carp |
养殖过程中使用有益微生物制剂“菌优碳源”，有利于促进草鱼的健康生长，对提高草鱼的存活率同样有效，由表 1可见，有益微生物组存活率均值为75.2%±1.7%，高于空白对照组7.9%，差异显著(P < 0.05)。
2.5 疫苗与有益微生物联用对草鱼存活率的影响由表 1数据可见，对试验草鱼接种疫苗，同时不间断使用“菌优碳源”，相比于空白对照组及单用有益微生物组的存活率极显著提高(P < 0.01)；相比于未使用有益微生物的免疫组，存活率提高2.0%，平均免疫保护率提高5.7%，差异均不显著(P>0.05)。
2.6 草鱼的生长性能草鱼放养后的D0、D30、D60、D90分别随机捞取30尾草鱼称重，计算生长性能指标见表 2，D90时四联苗组、有益微生物组、四联苗与有益微生物联用组的日增重、净增重、增重率、特定生长率均比对照组依次提高，四联苗与有益微生物联用的促生长作用最突出，特别是其特定生长率与空白对照组差异显著(P < 0.05)。试验过程中，空白对照组、有益微生物组、四联苗组、四联苗与有益微生物联用组的总投饵量分别是200、225、290、300 kg，计算得饵料系数依次是1.77、1.71、1.75、1.69，可见3个试验组的饵料利用率均高于空白对照组。
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表 2 草鱼的生长性能统计 Tab.2 The growth statistics of grass carp |
各组在塘租、电费、人力成本、固定资产折旧等方面的费用，以及其他鱼类的收益等都基本一致，在本试验结果中不做统计，仅计算草鱼的养殖收益差异，如表 3，其中，通威“156 ”小颗粒草鱼饲料单价记为7.5元/kg，投饵量如2.6所述；有益微生物20元/瓶，每试验塘每次用1瓶，共用10次；500尾份的“四联”疫苗记为50元/组，每试验塘用16组；实验结束收获的草鱼约32 g/尾，以40元/kg的苗种价格计算产出。通过计算得出，3个试验塘草鱼的产值均极显著高于对照组(P < 0.01)，有益微生物组、四联苗组、四联苗与有益微生物联用组草鱼的收益分别为7 730、8 709、9 110元/塘，每试验组分别比对照组高875、1 854、2 255元，直接经济收益显著(P < 0.05)。
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表 3 草鱼的养殖收益 Tab.3 The benefits of grass carp aquaculture |
抗体效价的高低是衡量血清中抗体水平的一项检测指标，能够反应鱼类特异性体液免疫水平[12]。草鱼在受到外来抗原侵染时能够产生较强的免疫应答反应，如杨先乐[13]报道的草鱼出血病细胞培养疫苗对草鱼免疫后，可检测到抗体效价，且经二次免疫后，血清抗体效价比第一次免疫后的效价高；刘林等[1]用核酸疫苗免疫草鱼后，鱼体血液抗体水平逐渐增加，28 d达到最高，随后呈下降趋势，在免疫后第70天仍能检测到抗体。RENGPIPA[14]的研究发现，益生菌细胞壁上存在的肽聚糖及其裂解产物作为良好的免疫激活剂，可刺激水产动物免疫器官发育和提高免疫细胞的活性，促进肠道免疫细胞产生抗体。本研究中，经草鱼四联疫苗免疫后，各组草鱼在实验的D7就检测到了抗体，D30时达到最大值，在随后的实验时间内维持该抗体水平，且注射四联疫苗的同时使用有益微生物的试验草鱼其抗体效价要稍高于仅注射疫苗组的草鱼，说明免疫鱼对四联疫苗产生了良好的免疫应答，所注射的疫苗对供试草鱼具有较强的免疫原性，且有较长的免疫保护期，使用有益微生物可以促进草鱼机体免疫力的提高。
3.2 草鱼四联疫苗的免疫效果联合疫苗是将两种或两种以上的疫苗以混合或同次使用等方式进行免疫接种，以预防多种或不同血清型的同种传染病的一种手段，该疫苗的各抗原成分不会相互竞争，因此它能对一种以上的疾病起到免疫保护作用[15]。多个研究结果显示，注射草鱼四联疫苗对草鱼赤皮、烂鳃、肠炎及出血病等草鱼“四病”有很好的预防作用，经济效益显著增加[16-19]。本试验中注射草鱼四联苗的试验组草鱼在试验期间发病少，摄食活跃，体态健康，存活率比对照组极显著提高(P < 0.01)，平均免疫保护率达90.9%±1.6%，取得了很好的免疫效果，说明接种草鱼四联疫苗能有效地增强草鱼对“四病”的抵御能力，注射四联苗是防治草鱼“四病”的有效措施之一。
3.3 有益微生物对池塘水质因子的影响水质调节是养殖过程的重要环节，对池塘使用有益微生物制剂，通过微生物的氧化、氨化、硝化、反硝化、硫化、解磷和固氮等作用，快速降解水产养殖环境中的有机污染物，能形成优势种群有效抑制有害微生物和有害藻类的生长繁殖，在水产养殖生产中使用可达到优化养殖环境、增强养殖生物抗病能力、促进快速生长等综合效果。通常由枯草芽孢杆菌、光合细菌、硝化细菌、酵母菌和乳酸菌等多种有益微生物所组成的复合型微生物制剂，比使用单一光合细菌或硝化细菌的净化作用更迅速、时间更持久[20-21]。本试验中，定期泼洒的“菌优碳源”有益微生物制剂，是一种由芽孢杆菌、酵母菌、硝化细菌及短链有机碳源组成的复合微生物制剂，通过多种有益微生物的快速增长，对氨氮、亚硝酸盐、有机酸的快速消耗，同时吸收水体无机氮的浮游藻类快速增多，通过光合作用释放氧气，得以平衡水体pH、增加水体溶氧，最终实现水环境物质能量的良性循环，使得各项水质指标在D20后保持稳定、健康状态，优化了养殖环境，促使鱼体健康生长。
3.4 有益微生物对草鱼的影响有益微生物也是一种良好的免疫激活剂，提高机体免疫力的形式多样，可提升溶菌酶活性及白细胞活力，还能促进机体免疫器官的生长、发育和成熟，从根本上增强机体免疫能力[22-23]，也可通过促进免疫细胞活性、增强体液和激素的水平来达到抗病防病的作用[24]，HNANSEN[25]的研究则表明，细菌通过鱼体口腔进入，在消化道内定植，而后部分益生菌分泌细菌素抑制或杀死周围其他异种有害菌群，通过对体内固定位点的竞争，使益生菌自身在体内占到优势，降低病害菌的数量和密度，起到防病害的作用[26]。本研究中，有益微生物试验组草鱼的“四病”发生减少，存活率比空白对照组提高7.9%(P < 0.05)，结合四联疫苗使用时更能维护鱼体健康，比单注射疫苗存活率还提高2.0%，显然有益微生物一定程度上增强了草鱼的机体免疫力和抗病害能力。
3.5 草鱼四联疫苗与使用有益微生物的协同效益草鱼四联疫苗与有益微生物以其安全、高效、无副作用等特点，在草鱼病害防控及机体免疫力提高方面展示了较好的协同效益，养殖效果最佳。在养殖过程中，注射四联疫苗使草鱼获得强的免疫保护力，增强抗病害能力，再使用有益微生物制剂，一方面促进鱼体免疫力的提高，另一方面改良水质、优化养殖环境，减少鱼体的环境应激反应，在二者的共同作用下，草鱼的存活率提高，鱼体生长速度增加，带来可观的直接经济效益，有益微生物组、四联苗组、四联苗与有益微生物联用组草鱼的收益分别比对照组高875、1 854、2 255元，差异显著(P < 0.05)。此外，在草鱼高密度精细养殖过程中使用疫苗及有益微生物产品可减少用药，提高水产品安全保障，并减排养殖废水、降低养殖业对环境的污染，保护环境，建立环境友好型的养殖技术，具有良好的社会收益，极具推广应用价值。
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