2. 中国水产科学研究院东海水产研究所 农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室, 上海 200090
浮游植物生长受到多种生物因子和非生物因子的综合影响,其中营养盐是赤潮发生的首要物质基础[1]。在赤潮发生过程中,当赤潮优势种对某种营养元素需求特别大时反而成为限制因素[2],因此, 营养盐的变化能引起海洋浮游植物群落的变动。研究发现,中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)是近年来东海赤潮高发区的主要赤潮生物[3]。硅藻和甲藻赤潮演替经常交替进行(硅藻-甲藻-硅藻),在营养盐特别是磷水平较高时,硅藻赤潮占据优势,随后当海水中磷元素消耗至较低水平时,甲藻赤潮占据优势[2]。在磷限制的富营养化海域中爆发甲藻赤潮,很可能跟甲藻的一些特殊环境适应策略有关。
米氏凯伦藻属于甲藻门(Pyrrophyta),裸甲藻目(Gymnodiniales),凯伦藻属(Karenia)。米氏凯伦藻是一种世界范围内常见的有毒有害赤潮藻[4],已在中国、澳大利亚、日本、南美、北非等水域引发过赤潮,造成了严重的经济损失[5-8]。目前国内外对米氏凯伦藻的相关研究主要集中在采用分子生物学手段结合形态特征对米氏凯伦藻分类鉴定[9-12]以及现场监测[13],米氏凯伦藻的生物行为(吞噬营养行为、种间竞争等)及影响因素对于研究赤潮的发生发展机制[14-21],以及米氏凯伦藻产生的毒素成分和毒素效应[22-24]。另外,不同营养盐条件对米氏凯伦藻的生长特性也进行了研究[25-26],但是,有关米氏凯伦藻的磷吸收动力学特性研究却不够深入[27]。针对近年来米氏凯伦藻赤潮在东海经常爆发,而且鉴于米氏凯伦藻赤潮爆发时海水中磷含量偏低的事实,很有必要深入研究不同磷水平下米氏凯伦藻的生长以及磷吸收动力学特性,从而更好地探讨米氏凯伦藻赤潮的爆发机制。
1 材料与方法 1.1 藻种来源与培养条件米氏凯伦藻由中国水产科学研究院东海水产研究所提供,采用f/2培养基培养。培养基所用海水采自浙江省舟山市嵊山岛附近(30°45′N, 122°50′E),海水pH为8.0,盐度为28,海水经过孔径为0.45 μm滤膜过滤后备用。海水和培养基储备液通过121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,在超净工作台配制所需培养基,所有培养基储备液、藻类培养所需三角瓶等全部经过高压灭菌后使用。藻类培养温度为(20 ± 1)℃,光照强度为65~70 μmol/(m2·s),光暗比为12 h:12 h,所有实验光照强度和光暗比均为这个条件。藻类培养和实验均在光照培养箱中进行(MTI-201B,Rikakikai,Japan)。所有实验采用的藻类均为培养至指数生长期藻类(根据前期实验,新接种的米氏凯伦藻在培养一周左右即进入指数生长期)。
1.2 不同无机磷浓度培养对米氏凯伦藻生长的影响实验培养实验中米氏凯伦藻的起始密度均为2 ×104 cells/mL,培养条件与前面一致。设高(HP)、中(MP)、低(LP)3个不同无机磷(Dissolved inorganic phosphorus,DIP, NaH2PO4·H2O配置)水平组,相对应的无机磷(PO43-)起始浓度分别为6.5、1.8和0.2 μmol/L(一次性培养,中间不添加营养盐)。其他营养元素浓度为f/2培养基配方浓度。培养容器为250 mL三角瓶(其中实验用藻液200 mL),每个浓度组重复3次,每天早晚固定时间手动摇动藻液2次,分别在第0、6、12、18、24、30、36、42、48和54天取样用鲁戈氏液固定,在光学显微镜(BX43, Olympus, Japan)下采用浮游植物计数框计数,并取样后在显微镜下测量米氏凯伦藻体长、体宽和相关指标,根据SUN和LIU[28]方法计算米氏凯伦藻细胞体积。同时同步测定溶液中无机磷含量,测定方法参照海洋监测规范[29]。
藻类比生长速率(μ, / d)计算按照公式
式中:N1为培养时间为t1时藻类细胞浓度;N2为培养时间为t2时藻类细胞浓度。
藻细胞体积计算按照公式
式中:V为藻细胞体积;a为藻细胞长(μm);b为藻细胞宽(μm)。
1.3 磷吸收动力学实验设计实验前将藻细胞离心收集,根据TOVAR-SANCHEZ等[30]的方法利用细胞表面离子清除剂清洗藻类细胞表面的PO43-,重复洗涤、离心2次后转入无磷培养基中,磷饥饿培养7 d以消耗细胞体内磷库,然后即可作为磷吸收动力学实验藻种。将藻种接入不同磷浓度(0.30、1.13、2.25、4.50和9.00 μmol/L)的培养基中,细胞密度为1.5 × 104 cells/mL,每个浓度设3个平行,分别在接种24 h后取样,同时用滤膜过滤后测定培养基中无机磷的浓度。
磷吸收动力学模型主要参照Michaelis-Menten方程[31-32]:
式中:S为基质中无机磷浓度(μmol/L);Ks为无机磷半饱和吸收常数(μ mol/L);ρ为无机磷吸收速率[fmol/(cell·h)];ρmax为无机磷最大吸收速率[fmol/(cell·h)],营养吸收动力学参数采用非线性最小平方估算。
1.4 数据处理利用均值±标准差(Mean ± SD)描述实验数据的数字特征。3种无机磷水平之间的生长(细胞密度、体积、体长和体宽)差异采用独立样本t检验。上述检验的显著性水平设定为0.05。数据处理采用的软件为PASW Statistics 18.0和Excel 2010。
2 结果 2.1 不同无机磷水平对米氏凯伦藻生长的影响由图 1可知,不同无机磷浓度培养对米氏凯伦藻生长的影响显著(P<0.05)。从第12天开始到实验结束,高磷组中米氏凯伦藻细胞密度均显著高于中磷组和低磷组(P<0.05)。实验中低磷组米氏凯伦藻细胞密度始终处于一个较低的水平(<5.0×104 cells/mL),且波动变化较小。中磷浓度组细胞密度18天之前细胞浓度增加幅度较快,在18天之后进入相对稳定期,变化幅度较小,细胞密度维持在10.0×104 cells/mL之上。高磷组米氏凯伦藻经过短暂的过渡期,从第6天开始进入对数期迅速增长,其增加幅度较中磷浓度组和低磷组明显,细胞密度在42天到达最高值(58.8×104 cells/mL)。
由图 2可知,不同无机磷水平培养条件下米氏凯伦藻生长速率差异非常明显(P<0.05),在低磷培养条件下,在实验开始阶段时比生长速率处于较低水平,之后比生长速率是有正有负,生长处于小幅波动状态。在中磷培养条件下,在前6天米氏凯伦藻生长较快(0.253 /d),之后比生长速率是有正有负。在高磷培养条件下,在前阶段比生长速率处于较高水平,而后有所下降,后期比生长速率也处于负值状态。
2.2 不同无机磷水平对米氏凯伦藻细胞体积的影响由图 3可知,不同无机磷水平培养对米氏凯伦藻细胞体积的影响显著(P<0.05)。低磷组米氏凯伦藻细胞体积从第6天开始到实验结束均显著高于中磷和高磷组(P<0.05)。中磷和高磷组米氏凯伦藻细胞体积会随着培养时间的增加而逐渐增大,但增加幅度较小,中磷组中米氏凯伦藻细胞体积比高磷组大,但是相差不显著(P>0.05)。从表 1可知,不同无机磷水平培养对米氏凯伦藻细胞体长和体宽的影响显著(P<0.05)。低磷组米氏凯伦藻细胞体长和体宽从第6天开始到实验结束均显著高于中磷和高磷组(P<0.05),而中磷组和高磷组米氏凯伦藻细胞体长和体宽在整个实验周期相差不明显(P>0.05,第42天除外)。
另外,根据同步测定水体中无机磷含量发现,在培养初期(6~12 d),各实验组水体中无机磷含量均快速下降,其中低磷组水体中无机磷的含量基本上就维持在0.10 μmol/L以下直至实验结束,中磷组水体中无机磷的含量基本上就维持在0.10 ~ 0.20 μmol/L之间直至实验结束,而高磷组水体中无机磷的含量在第12天降至0.20 μmol/L以下,而后水体中无机磷含量有小幅波动,至实验结束时无机磷含量为0.27 μmol/L。结合表 1、图 3-4,当水体中无机磷含量低于0.10 μmol/L时米氏凯伦藻细胞体积、体长、体宽等明显大于无机磷含量较高水体中的米氏凯伦藻。
由图 5可见,随着水体无机磷浓度提高,米氏凯伦藻对无机磷的吸收速率不断增大。作磷吸收速率ρ对无机磷浓度S得双倒数曲线,由此求得最大吸收速率ρmax为18.587 fmol/(cell·h),半饱和常数Ks为0.490 μmol/L,米氏凯伦藻吸收无机磷的动力学过程可用米氏方程来描述,回归方程为ρ=18.587 S/(0.490 + S)。线性回归分析表明,双倒数曲线的决定系数R2=0.857 7,其线性拟合在P=0.01水平上显著。
磷在水环境中的时空分布对海洋生态系统中的初级生产过程有着决定性作用,同时对赤潮的形成和消亡也具有非常关键的作用[33]。米氏凯伦藻近年来成为东海赤潮高发区的主要有毒有害优势种,海区磷水平的变化与米氏凯伦藻生长之间的相关性研究变得尤为重要。在本实验中,高磷和中磷组中米氏凯伦藻在实验前期(第6天)藻类生长均呈指数生长,比生长速率μ分别为0.292 /d和0.254 /d,而低磷组中米氏凯伦藻细胞密度虽然也有所增加,但是比生长速率μ只有0.058 /d(图 2),米氏凯伦藻最高细胞密度随着磷水平的增加而增加,高磷组中米氏凯伦藻最高细胞密度能到58.8×104 cells/mL,中磷组则在15.0~20.0×104 cells/mL之间波动,而低磷组则在5.0×104 cells/mL之下(图 1),由此可见,低磷水平对米氏凯伦藻的生长已经产生了一定的限制作用。曹春晖等[25]在研究不同氮磷对米氏凯伦藻生长的影响时发现在适当的磷水平培养下,米氏凯伦藻比生长速率随着磷水平(0.046~1.850 mmol/L)的增加而增加,在磷酸盐浓度为0.230 mmol/L时达到峰值(0.568 /d),而后有所下降,而塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)则在磷酸盐浓度为0.036 mmol/L条件下具有最大的比生长速率(0.50 /d)[34],对于微小原甲藻(Prorocentrum minimum)而言,不同磷水平(0.003 6、0.036和0.108 mmol/L)培养下藻类比生长速率相差不大(0.42~0.45 /d),但是高磷组藻类细胞密度最高[35],在中肋骨条藻对磷的需求则更明显,在无磷或者低磷条件下其生长速率明显低于高磷条件[23]。后期研究可以对米氏凯伦藻、东海原甲藻和中肋骨条藻等[36]东海区常见赤潮生物在磷浓度设置一致的情况进行对比生长实验,从而进一步来探讨磷在硅甲藻生长周期中的作用。另外,本课题组在前期研究发现,低磷培养条件下米氏凯伦藻细胞体积会增大,添加磷元素后细胞体积又恢复正常,而东海原甲藻则无论在低磷还是添加磷元素之后其细胞体积变化不明显[26]。本研究在之前基础上设置不同磷水平,探讨到底海水中磷浓度处于何种水平时,米氏凯伦藻细胞体积会显著增大,结果表明,当海水中无机磷含量低于0.10 μmol/L时米氏凯伦藻细胞体积等明显大于无机磷含量较高水体中的米氏凯伦藻(P<0.05)。这是某些甲藻藻类遇到不良环境时的一种应激反应,当水体中磷缺乏时,藻类可以利用细胞内营养盐库的调节来缓解,甲藻具有较高的营养盐储存能力,当环境恢复到原先状态时藻类体积也恢复正常,类似的情况也出现在链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)中[37]。在东海区甲藻赤潮爆发高峰期(5月),海水中磷酸盐含量就相当低,绝大部分时间无机磷含量均低于0.10 μmol/L[38]。因此,在赤潮现场采集的米氏凯伦藻细胞体积明显大于实验室正常营养盐培养下的米氏凯伦藻细胞[39]。
营养盐吸收动力学参数ρmax和Ks是目前最常用表达浮游植物对营养盐亲和力的参数,ρmax升高或是Ks降低均有利于浮游植物竞争营养盐[40-41]。一般来说,当水体中营养盐丰富时,具有较高ρmax的藻类能够迅速吸收营养盐储存于体内从而形成营养库[42]。对于海洋中常见的硅藻和甲藻而言,其无机磷吸收动力学特征有所不同,东海区常见赤潮生物旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus)对无机磷的最大吸收速率ρmax为20.59 fmol/(cell·h),半饱和常数Ks为0.90 μmol/L,而玛氏骨条藻(S. marinoi)对无机磷的最大吸收速率ρmax为24.03 fmol/(cell·h),半饱和常数Ks为2.02 μmol/L[42];另外一种常见赤潮生物尖刺拟菱形藻(Pseudonitzschia pungens)则具有更高的ρmax[148 fmol/(cell·h)]和Ks(1.40 μmol/L)[43],中华盒形藻(Bidduiphia sinensis)对无机磷的最大吸收速率ρmax更是比尖刺拟菱形藻高出10倍[ρmax =1 497 fmol/(cell·h)],半饱和常数Ks也达到2.398 μmol/L[44]。甲藻链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)对无机磷最大吸收速率ρmax为230 fmol/(cell·h),半饱和常数Ks为0.920 μmol/L[45],李英等[46]研究了东海原甲藻对无机磷(磷酸盐)吸收动力学特征,结果得出半饱和常数Ks为0.060 μmol/L,赵晓玮[34]得出东海区米氏凯伦藻对磷的半饱和常数Ks为0.199 μmol/L。在本实验中发现,米氏凯伦藻的ρmax为18.587 fmol/(cell·h),Ks值为0.490 μmol/L,虽然与赵晓玮[28]的实验结果有一定差异,可能是由于米氏凯伦藻不同株系造成的(前者米氏凯伦藻来自中国海洋大学藻种库,本实验米氏凯伦藻从东海区赤潮高发区分离而得),但Ks都是低于0.5 μmol/L。总之,甲藻对无机磷吸收的半饱和常数值(<1.0 μmol/L)比硅藻(> 1.0 μmol/L)要低,对无机磷的亲和力更强。当海区无机磷比较丰富的时候,由于硅藻对无机磷具有更高的最大吸收速率[>20 fmol/(cell·h)],硅藻生长速度很快,容易形成赤潮(东海区在4月海区营养盐丰富,磷酸盐含量达到0.40 μmol/L[26]),硅藻赤潮高峰过后磷酸盐含量迅速下降(东海区在5月份的磷酸盐含量降至0.09 μmol/L[26],此时,由于甲藻比硅藻对无机磷具有更高的亲和力,所以其仍能正常生长,从而形成甲藻赤潮(比如东海原甲藻、米氏凯伦藻等甲藻赤潮)。
米氏凯伦藻作为近年来东海区常见有毒有害赤潮藻,对海洋生态和水产养殖业均会产生不良影响,磷元素作为海区营养盐的重要限制性因素,因此,非常有必要对米氏凯伦藻在不同磷营养条件下的生理生化响应进行深入研究。
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2. Key Laboratory of East China Sea & Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization, Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute, Shanghai 200090, China