上海海洋大学学报  2017, Vol. 26 Issue (3): 383-391    PDF    
不同蛋白水平下添加抗菌肽对赤点石斑鱼影响的研究
蔡云川1, 赵书燕2,3, 林黑着2, 黄忠2, 周传朋2, 马志洲1     
1. 广东省海洋与渔业技术推广总站, 广东 广州 510220;
2. 中国水产科学研究院南海水产研究所 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300;
3. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306
摘要:评估了不同饲料蛋白水平(44%,48%,52%)和抗菌肽浓度(0.01%,0.02%)对赤点石斑鱼生长性能、血清生化、消化酶和抗氧化能力的影响。实验组分别为:D1(44%,0.01%),D2(48%,0.01%),D3(52%,0.01%),D4(44%,0.02%),D5(48%,0.02%),D6(52%,0.02%)。每组3个平行,养殖8周结果如下:一定范围内,增重率、特定生长率和饲料转化率随蛋白水平和抗菌肽浓度增加,D5组显著高于D1组(P < 0.05)。形态学指标,D6组肝体比(HSI)、脏体比(VSI)和肠系膜脂肪(IPF)显著低于D5组(P < 0.05)。同一蛋白水平下增加抗菌肽浓度可降低肌肉粗脂肪含量,D4组显著低于D1组(P < 0.05)。血清总蛋白、白蛋白含量随蛋白水平和抗菌肽浓度的增加而升高(P < 0.05),D3和D5组谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血糖显著低于其他组(P < 0.05)。D5组胰蛋白酶高于其他组(P < 0.05),D1组过氧化物酶显著低于其他组(P < 0.05)。随着抗菌肽浓度增加,胃蛋白酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性增加,且丙二醛含量降低(P>0.05)。实验结果表明,48%蛋白水平下添加0.02%抗菌肽可以提高赤点石斑鱼生长性能,增强消化酶活性和抗氧化能力,降低饲料系数。
关键词石斑鱼    抗菌肽    蛋白    生长    血清生化    抗氧化能力    

赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)俗称红斑,广泛分布于热带和亚热带海域。近几年来,除了从自然海区钓捕外,石斑鱼的人工网箱养殖方兴未艾,随着集约化养殖程度的提高,病害频发,严重制约了石斑鱼养殖业的发展。由于抗生素易残留在体内,易引起肠道菌群失衡和产生耐药性,对人类和环境产生了较大的负面影响,已严禁使用[1]。因此,寻找新型、安全的抗生素替代品来防止日益严重的病害并促进鱼类生长,已成为现代饲料科学研究的重要方向。

抗菌肽(Antibacterial peptides, ABP)是一种动物体内产生的具有对抗外源致病原的阳离子活性多肽,是先天性免疫的重要组成部分[2],与其他添加剂相比具有来源广泛,相对分子小,水溶性好,热稳定高,抗菌谱广,绿色环保等特点[3-4]。还有可提高动物生产性能,增加肠道有益菌群的作用[5],使用无毒无害的抗菌肽替代传统抗生素受到了广泛的重视[6]

蛋白质是所有水产动物有机结构和功能必不可少的营养物质,是决定鱼类生长和配合饲料性能的首要参数,是鱼类营养学家长期重视与研究的方向之一。蛋白含量不仅决定鱼类生长也影响饲料成本,蛋白含量低会阻碍鱼体生长;含量过高,饲料成本升高,且容易污染养殖水体,不利于鱼体生长和养殖环境的可持续发展[7-10]。研究表明在机体蛋白合成量变化不大的情况下,添加一定量的抗菌肽可以减少蛋白的分解,从而促进生长[11]。抗菌肽在畜禽研究中较多,对石斑鱼的影响至今尚未见报道,该实验旨在研究不同蛋白水平下添加抗菌肽对石斑鱼生长性能、血清生化、消化酶和抗氧化能力的影响,以期为日益发展的石斑鱼工厂化养殖技术推广提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验用饲料

实验用抗菌肽是由国家饲料工程技术研究中心和北京中农颖泰生物技术有限公司联合开发的天蚕素抗菌肽,主要成分为天蚕素活性多肽,含量≥100万单位/g。天蚕素是一种由枯草芽孢杆菌表达,由37个氨基酸残基组成的抗菌活性多肽,分子量为3.8Ku。根据石斑鱼的营养需求配制基础饲料配方[12],以鱼粉为动物蛋白源,大豆浓缩蛋白为植物蛋白源,饲料组成和营养水平见表 1。试验设置3个蛋白质水平(44%,48%,52%),每个蛋白水平下添加2种浓度抗菌肽(0.01%,0.02%),共6种试验饲料,分别为D1 (44%,0.01%),D2 (48%,0.01%),D3 (52%,0.01%),D4 (44%,0.02%),D5(48%,0.02%),D6(52%,0.02%)。所有原料按配方称重、搅拌均匀,微量组分采用逐级扩大混匀的方法加入,各种饲料原料通过40目筛,筛上物经粉碎机粉碎后倒入搅拌机(SZ250,广州旭众食品有限公司)搅拌10 min,加入适量的水(约40%)搅拌10 min,用双螺杆挤条机(F-26,广州华南理工大学)挤压成直径2.5 mm的条形物,经造粒机(G-500,广州华南理工大学)制成沉性颗粒料,晒干后,用封口袋分装,于-20 ℃冷柜保存备用。

表 1 实验基础原料及营养组成(%干重) Tab.1 Formulation and nutrient composition of basal diet(% dry matter)
1.2 实验设计与管理

赤点石斑鱼购自广东省海洋渔业试验中心,随机挑选270尾大小均匀的石斑鱼于18个圆形玻璃纤维桶(500 L),每桶15尾[平均体质量(41.58±0.33) g],该实验共6个处理,每个处理3个平行。石斑鱼养殖实验在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地室内海水养殖系统中进行。实验开始前对石斑鱼进行饲料投喂驯化,以商品料饱食投喂一周,使之逐渐适合人工配合饲料和养殖环境。每天饱食投喂2次(8:00和16:00),投喂1 h后虹吸法去除残饵和粪便。

实验周期8周,期间流水养殖,每天定时观察石斑鱼摄食情况,玻璃纤维桶每周清洗一次,连续充气,水温27.0~30.0 ℃,pH 7.5~8.0,盐度32~34,溶解氧6.9~7.3 mg/L,氨氮总量低于0.1 mg/L。

1.3 样品采集与指标检测 1.3.1 样品采集

养殖实验结束后,饥饿24 h,将石斑鱼全部捞出,称体质量、计数。从每个桶中随机取3尾鱼测量其体质量、体长,测量完成后,用抗凝剂(1%的肝素钠,购于上海医疗器械股份有限公司)润过的注射器从尾静脉釆血,放入1.5 mL的离心管中,4 ℃静止4 h后离心(3 000 r/min,10 min,4 ℃),收集的血清分装于0.5 mL的离心管中,然后于-80 ℃的冰箱中保存以测生化指标。取血后的石斑鱼分离肝脏、肠道、胃,分别称内脏和肝脏重量,用于形态学指标分析和酶活测定,去鱼皮分离背部侧线以上肌肉,于-80 ℃的冰箱中保存,用于肌肉常规成分分析。

    (1)

式中:WGR为增重率;Wt为末质量;W0为初始质量。

    (2)

式中:SGR为特定生长率;Wt为末质量;W0为初始质量;D为实验天数。

    (3)

式中:VSI为脏体比;Wv为内脏质量;W为体质量。

    (4)

式中:HSI为肝体比;WH为肝脏质量;W为体质量。

    (5)

式中:CF为肥满度;W为体质量;L为体长。

    (6)

式中:FCR为饲料系数;WF为消耗的饲料总质量;WT最终鱼的质量;W0为起初放养鱼的质量。

    (7)

式中:IPF为肠系膜脂肪比;WI肠系膜脂肪质量;W体质量。

1.3.2 样品分析

取赤点石斑鱼背部肌肉,用于测定肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪及灰分[13]。烘箱105 ℃常压干燥法测定水分;马弗炉550 ℃灼烧法测定灰分(FO610C, Yamato Scientific Co., Ltd., Tokyo, 日本);凯氏定氮法测定粗蛋白(FOSS 2300, Hoganas, 瑞士);索氏抽提法测定粗脂肪(以丙酮为抽提剂;Soxtec Avanti 2050, Foss Tecator AB, 瑞士)。

血清生化指标(总蛋白、白蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甘油三酯、胆固醇、血糖)送至广州金域检测中心(广州,广东)采用ROCHE-P800全自动生化分析仪(Roche,Basel,瑞士)分析。

胃蛋白酶、肠道淀粉酶、肠道胰蛋白酶按照南京建成试剂盒样品处理方法制作组织匀浆,然后用试剂盒配套的试剂检测消化酶活含量。

肝脏抗氧化指标丙二醛、过氧化物酶和过氧化氢采用南京建成试剂盒(江苏,中国)分析。

1.3.3 数据处理与分析

采用Excel 2013和SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析,用单因素方差分析法(one-way ANOVA, LSD)比较各组间的显著性,当有显著性差异时,进行Duncan’s多重比较,3个重复的所有数值均以平均值±标准差来表示,P < 0.05表示有显著性差异。

2 结果 2.1 生长性能

蛋白质水平和抗菌肽添加浓度对石斑鱼生长性能的影响见表 2。低ABP浓度下,增重率和特定生长率随蛋白水平的增加而逐渐增加,高浓度下先升高后降低,D5显著高于D1(P < 0.05),与其他组无显著性差异(P>0.05)。低ABP浓度下,FCR随蛋白水平增加而逐渐减低,高ABP下,FCR先降低后升高,D5组显著低于D1组(P < 0.05)。各组间成活率无显著性差异(P>0.05)。

表 2 不同蛋白水平和抗菌肽浓度对石斑鱼生长性能的影响 Tab.2 Effect of ABP supplementation in different protein level diets on the growth performance of grouper
2.2 形态学指标

不同蛋白水平和抗菌肽浓度对石斑鱼形态学指标影响不同(表 3)。0.01%ABP浓度下,随蛋白水平增加肥满度显著增加,D3组显著高于D1组(P < 0.05);0.02%ABP浓度下,组间差异不显著(P>0.05)。同一蛋白水平下,随ABP浓度增加肥满度降低(P>0.05)。0.01%ABP浓度下,D1-D3组HSI差异不显著;0.02%ABP浓度下,HSI随蛋白水平逐渐降低,D4,D5组显著高于D6组(P < 0.05);同一蛋白水平下各组HSI差异不显著(P>0.05)。在0.01%ABP浓度下,组间VSI和IFP差异不显著(P>0.05);0.02%ABP浓度下,均随蛋白水平先增加后降低,D5组显著高于D4和D6(P < 0.05)。

表 3 不同蛋白水平下添加抗菌肽对石斑鱼形态学指标的影响 Tab.3 Effect of ABP supplementation in different protein level diets on the morphological indexes of grouper
2.3 肌肉常规成分

饲料蛋白水平和抗菌肽浓度对石斑鱼肌肉粗蛋白和灰分没有显著影响(P>0.05, 表 4)。肌肉水分随蛋白水平增加而逐渐减低,D4显著低于D6(P < 0.05)。ABP浓度对各组间肌肉脂肪含量无显著影响(P>0.05);同一蛋白水平下增加抗菌肽浓度,肌肉脂肪含量逐渐降低,D4组显著低于D1组(P < 0.05)。

表 4 不同蛋白水平下添加抗菌肽对石斑鱼肌肉常规成分的影响 Tab.4 Effect of ABP supplementation in different protein level diets on muscle composition of grouper
2.4 血清生化指标

蛋白水平和抗菌肽浓度对血清生化的影响见表 5。血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量随抗菌肽浓度增加而逐渐升高。0.01%ABP浓度下,各组血清总蛋白差异不显著(P>0.05),0.02%ABP浓度下,总蛋白含量显著增加,D6显著高于D4(P < 0.05)。蛋白水平和抗菌肽浓度显著影响血清白蛋白,同一抗菌肽浓度下,52%蛋白水平下血清白蛋白显著高于44%蛋白水平(P < 0.05);同一蛋白水平下,白蛋白含量随抗菌肽浓度增加而升高,D6显著高于D3(52%蛋白水平)(P < 0.05),其他组间差异不显著(P>0.05)。0.01%ABP浓度下,谷草转氨酶随蛋白水平增加而显著降低;0.02%ABP浓度下,谷草转氨酶先降低后增加,D5显著低于D4和D6(P < 0.05);48%蛋白水平下,谷草转氨酶随抗菌肽浓度增加而显著降低(P < 0.05),谷丙转氨酶随抗菌肽浓度增加而降低,未达到显著水平(P>0.05);52%蛋白水平下,谷丙、谷草转氨酶随抗菌肽浓度增加而显著升高,D6显著高于D3(P < 0.05);44%蛋白水平下差异不显著(P>0.05)。D3、D6胆固醇含量显著高于D4(P < 0.05),其他组差异不显著(P>0.05)。48%蛋白水平下,随抗菌肽浓度增加,血糖含量显著降低(P < 0.05),52%蛋白水平下显著升高,D6显著高于D3(P < 0.05)。

表 5 不同蛋白水平下添加抗菌肽对石斑鱼血清生化指标的影响 Tab.5 Effect of ABP supplementation in different protein level diets on plasma biochemical indexes of grouper
2.5 消化酶和抗氧化能力

各组间胃蛋白酶活性无显著性差异(P>0.05)。随蛋白水平的增加,肠道胰蛋白酶先升高后降低,D5显著高于D3(P < 0.05),其他组差异不显著(P>0.05)。肠道淀粉酶随着蛋白水平升高而逐渐降低,同一蛋白水平酶活随着抗菌肽增加而升高,D4显著高于D2(P < 0.05)。44%蛋白水平下,过氧化物酶活性随着抗菌肽浓度的增加而显著升高(P < 0.05),其他蛋白水平下差异不显著(P>0.05)。随着蛋白水平和抗菌肽浓度的增加,肝脏丙二醛含量逐渐降低(P>0.05),肝脏过氧化氢酶活性逐渐升高(P>0.05, 表 6)。

表 6 不同蛋白水平下添加抗菌肽对石斑鱼消化酶和抗氧化能力的影响 Tab.6 Effect of ABP supplementation in different protein level diets on digestive enzymes, antioxidant abilities of grouper
3 讨论

本研究表明适宜蛋白水平下增加抗菌肽浓度可促进赤点石斑鱼生长和提高饲料利用率。这与水产动物湘云鲫(Carassius auratus Triploid)[14]和鲤鱼(Cyprinus carpio)[15]等的研究结果相似。研究表明抗菌肽能促进胰岛素样生长因子,加速营养物质的合成,促进动物生长[11];适宜浓度抗菌肽可以通过抑制肠道致病细菌的生长,改善肠道绒毛结构来提高营养物质的利用[16]。而罗非鱼(Oreochromis niloticus)[17]研究中表明抗菌肽对生长无显著影响,但是高剂量的抗菌肽可以增加罗非鱼的肥满度,促进脂肪的积累。抗菌肽在不同动物中效果不同,这主要与动物的品种、规格、养殖环境、抗菌肽的种类和添加量有关。

鱼类的消化能力是决定消化吸收和生长速度的关键,消化能力与消化道结构和营养水平有关[18]。本研究中随着蛋白质水平增加胰蛋白酶活性升高,胃蛋白酶活性随蛋白水平先增加后降低,淀粉酶活性不断降低。这与卵形鲳鲹(Trachinotus Ovatus)[19]、瓦氏黄颡鱼(Pseudobagrus vachelli)[20]等研究中随蛋白水平增加胃蛋白活性增加,淀粉酶活性降低的结论相似。在低蛋白水平下增加抗菌肽可以提高胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性,这可能与抗菌肽能有效地改善水产动物胃肠粘膜结构,杀灭有害微生物,保证胃肠粘膜结构和功能完整,提高了胃肠道的消化吸收能力[21]有关。也有研究表明在蛋白质合成量不变的情况下,增加抗菌肽浓度可以减少机体组成蛋白分解代谢,从而促进生长速度的提高[22]。高蛋白水平下酶活性降低,表明增加抗菌肽抑制了赤点石斑鱼的生长,可能抗菌肽抑制了肠道有益菌群的生长,影响了石斑鱼的消化吸收[23]。实验中D5(48%,0.02%)特定生长率和饲料效率高于D3(52%,0.01%)和D6(52%,0.02%),说明适宜蛋白水平下增加抗菌肽浓度可以促进生长,降低饲料系数。

在形态指标中,适宜蛋白水平下增加抗菌肽可以降低脏体比和肠系膜脂肪比,与湘云鲫研究结果相似[14]。肌肉常规成分分析中,同一蛋白水平下增加抗菌肽浓度可降低肌肉粗脂肪含量,可以看出增加抗菌肽可促进脂肪分解,增加肌肉品质,与添加抗菌肽可以降低湘云鲫[24]脂肪含量的研究结果一致,这可能与抗菌肽通过影响一系列酶的活性,加强肌肉脂肪分解代谢,抑制脂肪酸合成速度,降低了体脂肪的沉积[25]有关,还可能与抗菌肽可促进甲状腺激素T4向T3的转化,增加机体的代谢,加强体内脂肪的分解,提高机体的瘦肉率[4]有关。研究表明高蛋白水平下肌肉粗蛋白含量增加,脂肪含量降低[26],但本研究中差异不显著,这与饲料蛋白质水平和鱼的种类有关。

血糖、甘油三酯和总蛋白反映了机体对碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的情况[27],血清总蛋白、白蛋白反映了蛋白质代谢和营养水平[28],球蛋白反应了机体免疫水平。本研究表明适宜蛋白和抗菌肽水平可以提高蛋白质在体内的吸收、沉积和利用,提高机体非特性免疫水平。有研究表明抗菌肽可以提高血清免疫球蛋白A和G含量,增加脾脏白细胞介素-2mRNA表达[29]。血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶反应机体肝功能状况,高蛋白水平下谷丙转氨酶含量高于其他蛋白水平,谷草转氨酶没有显著影响,这与罗非鱼[30]的研究结果相似。同一蛋白水平下增加抗菌肽浓度可以降低血清甘油三酯、胆固醇和血糖含量,这可能与添加适宜浓度的抗菌肽可以促进蛋白质的代谢和利用,降低其他物质的代谢,导致肠系膜脂肪比和脏体比增加有关。

鱼类与脊椎动物一样,也易受到氧自由基的影响,MDA反映了机体过氧化和自由基水平,抗氧化酶系统主要依靠超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等[31]。研究表明,添加0.015%抗菌肽可以提高锦鲤(Cyprinus. carpio var. Jian)血清CAT、溶菌酶活性[32],增强鲤鱼血清溶菌酶和补体旁路途径活性[33],添加0.015%和0.02%的天蚕素抗菌肽可以提高湘云鲫血清CAT活性,降低MDA的含量[14]。本研究同一蛋白水平下增加抗菌肽浓度可以降低MDA,增加POD和CAT活性,说明添加抗菌肽可以诱导石斑鱼抗氧化系统的激活,增强机体消除抗氧化自由基的能力。

由实验可以看出,适宜蛋白水平下添加抗菌肽,可以促进赤点石斑鱼生长、降低脂肪积累、增加肠道消化酶活性和肝脏抗氧化能力,D5(48%,0.02%)组生长性能、消化酶活力和抗氧化能力较高。

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Effect of antibacterial peptides supplementation in different protein level diets on grouper (Epinephelus akaara)
CAI Yunchuan1, ZHAO Shuyan2,3, LIN Heizhao2, HUANG Zhong2, ZHOU Chuanpeng2, MA Zhizhou1     
1. Guangdong Ocean and Fishery Technology Extension Center, Guangzhou 510220, Guangdong, China;
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment; Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture; South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, Guangdong, China;
3. School of Life Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Abstract: This experiment was conducted to assess the effects of dietary protein (44%, 48% and 52%) and antibacterial peptide (0.01% and 0.02%) on growth performance, serum biochemistry, digestive enzyme and antioxidant abilities of grouper (Epinephelus akaara). The experimental diets were named as:D1 (44%, 0.01%), D2 (48%, 0.01%), D3 (52%, 0.01%), D4 (44%, 0.02%), D5 (48%, 0.02%) and D6 (52%, 0.02%). Each diet was fed to 3 replicates and the experiment lasted for 8 weeks. The results show as follows:In certain range, Weight gain (WG), specific growth rate (SGR) and feed conversion ratio increased with protein level and ABP concentration increasing, and D5 was significantly higher than D1 (P < 0.05). The morphological indexes, Hepatosomatic index (HSI), Viscerosomatic index (VSI) and Intraperitoneal fat index (IPF) of D6 were significantly lower than D5 (P < 0.05). Crude fat content of fish fed diet D4 was significantly lower than D1 (P < 0.05). Serum total protein (TP) and albumin (ALB) increased with protein and ABP increasing (P < 0.05), glutamic-pyruvic transaminase (ALT), glutamic oxalacetic transaminase (AST) and glucose (GLU) were lower in D3 and D5 (P < 0.05). Trypsase of D5 was higher than other groups (P < 0.05), and Peroxidase (POD) of D1 was significantly lower than other groups (P < 0.05). ABP could increase Pepsin, Catalase (CAT), POD and decrease Malondialdehyde (MDA) content (P>0.05). The result shows 0.02% ABP supplementation at 48% protein level can improve growth, increase digestive enzyme activities and antioxidant abilities, and decrease FCR.
Key words: grouper     antibacterial peptides     protein     growth     serum biochemical indices     antioxidant abilities