抗菌肽是动物先天免疫系统的重要组成成分，其分子量一般为1.5～10 ku，它们对细菌、真菌、有包膜的病毒乃至癌细胞等均有抑制作用，故又被称为动物的“第二防御体系”^[1-2]，也因此被认为是替代抗生素的良好候选者。LEAP2 (Liver expressed antimicrobial peptide-2)抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽，最初是从人血液超滤产物中得到^[3]，被发现能抵抗革兰氏阳性的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和革兰氏阴性的灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)等细菌。鱼类中的LEAP2基因首次发现于虹鳟(Oncorhynchus mykiss)^[4]，目前，多种鱼类的LEAP2基因已经被相继分离和克隆，包括斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)^[5]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)^[6]、大黄鱼(Larimichthys crocea)^[7]、草鱼(Ctenopharyngodon idella)^[8]和鱼(Miichthys miiuy)^[9]等。但迄今为止，关于LEAP2基因外源表达方面的研究报道较少，已有的报道大多数也是基于大肠杆菌原核表达系统的重组DNA表达，例如斑点叉尾鮰^[10-11]、大黄鱼^[7]和人类^[2]LEAP2基因在大肠杆菌中的表达；至于LEAP2基因真核表达方面的研究报道则更少，仅王红亮^[12]报道了小鼠LEAP2基因在毕赤酵母中的表达，而鱼类来源LEAP2基因的真核重组DNA表达还未见报道。

本研究室在过去的几年中以斑点叉尾鮰LEAP2抗菌肽为研究对象，开展了重组DNA表达方面的研究，旨在开发用于替代抗生素的绿色饲料添加剂。就LEAP2的结构而言，除去信号肽之后的原前体肽由66个氨基酸残基组成，近羧基端的41个残基为成熟肽区域，该区域决定了LEAP2的生物学活性^[5]；4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽区域，它们在空间上可形成2对二硫键，对LEAP2的稳定和活性起了重要作用。鉴于此，在先前的研究中，本实验室以LEAP2成熟肽“mLEAP2”为研究对象，开展了基于大肠杆菌表达系统的重组DNA表达，但由于原核表达系统存在表达量低、无翻译后折叠修饰功能、易在细胞内形成包涵体等众所周知的缺点，并未获得具有良好生物学活性的重组蛋白^[10-11]。据此，本文在前期原核表达研究的基础上，以既有的原核重组表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板，通过PCR扩增含相关酶切位点的LEAP2成熟肽基因；以pPIC9K为表达载体、毕赤酵母GS115为工程菌，构建真核表达系统，以期实现斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达，并对其结构和生物学活性进行鉴定。本研究结果将为进一步探明LEAP2的生物学功能和作为绿色饲料添加剂应用于水产养殖奠定重要的基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 质粒和菌种

用作模板的“pET-32a-mLEAP2”为本实验室保存。用于质粒复制和DNA克隆的大肠杆菌DH5α购自北京天根生物科技有限公司；克隆质粒pMD19-T simple购自日本TaKaRa公司；表达载体pPIC9K及毕赤酵母GS115购自美国Invitrogen公司。

1.1.2 主要试剂和设备

DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶购自日本TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、DNA分子量标准和蛋白质分子量标准购自北京天根生物科技有限公司；超滤设备Vivaflow 200购自德国Sartorius公司；蛋白质纯化仪Profinia、IMAC柱为美国Bio-rad公司产品。超滤离心管购自美国Millipore公司。无氨基酵母氮源(YNB)培养基购自英国Oxoid公司；其他试剂均为国产分析纯。引物的合成及DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。MALDI-TOF-TOF分析委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.2 方法 1.2.1 斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽基因酶切位点的添加

设计3个分别含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点和6×his标签的引物(表 1)。第一次PCR以既有的斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽基因“mLEAP2”的原核表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板，以LF和LR1为引物，反应体系和条件如下：“pET-32a-mLEAP2”2.5 μL、正反引物各4.0 μL(10 μmol/L)、dNTP(10 mmol/L)8.0 μL、PCR缓冲液10 μL、Taq DNA聚合酶 (TaKaRa，Otsu，Japan)1 μL，用无菌水调至100 μL；94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、54.6 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循环，最终72 ℃延伸5 min。以该PCR产物为模板，以LF和LR2为引物，进行第二次PCR，反应体系和条件同上，除了退火温度改为60 ℃。将第二次PCR扩增的目的片段“mLEAP2”连接至pMD19-T质粒后用于DNA测序。

1.2.2 “pPIC9K-mLEAP2”重组表达载体的构建及转化毕赤酵母GS115细胞

采用EcoRⅠ和NotⅠ对重组质粒“pMD19-T-mLEAP2”进行双酶切，将获得的目的片段“mLEAP2”与经同样酶处理过的表达载体pPIC9K连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，通过菌落PCR、双酶切和DNA测序对重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”进行鉴定。“pPIC9K-mLEAP2”经SacⅠ酶切割后电转入毕赤酵母GS115细胞，取适量涂于His^-的MD平板上，30 ℃培养至单克隆产生。

1.2.3 高拷贝酵母转化子的筛选及鉴定

将MD平板上的单菌落依次接种于G418浓度为 1.0、2.0、3.0、4.0 g/L的YPD平板，30 ℃培养2～5 d后筛选高拷贝酵母转化子；将筛选到的转化子在MM平板上培养以筛选Mut⁺或Mut^-表型；对筛选到的甲醇利用快速型高拷贝酵母转化子提取基因组DNA，以此为模板，采用pPIC9K上的通用引物5'AOX1和3'AOX1(表 1)，进行PCR鉴定。

1.2.4 斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽在毕赤酵母GS115中的表达及其纯化

挑取筛选到的酵母转化子，接种于BMG液体培养基中，29 ℃、250 r/min培养至OD₆₀₀为4，10 000×g离心后用1 800 mL BMM液体培养基重悬细胞至OD₆₀₀约为1.0，加入0.5 %甲醇诱导表达120 h，每隔24 h取培养液以备分析；收集培养液离心(10 000×g，30 min)，上清经超滤浓缩后，采用Profinia蛋白质纯化仪对其进行纯化，纯化产物用于Tricine-SDS-PAGE分析(Tricine浓度0.1 mol/L，浓缩胶、夹层胶和分离胶的浓度分别为4%、10%和16.5%)。

1.2.5 表达产物的Western-blot和MALDI-TOF/TOF分析

经Tricine-SDS-PAGE分析后的凝胶用于Western blot分析，阴性对照为含pPIC9K空载体的酵母表达上清。100 V恒压1 h，将蛋白转至PVDF膜上，依次用抗his标签鼠单克隆抗体和HRP标记山羊抗鼠IgG孵育，最后采用HRP-DAB显色试剂盒显色。目的条带经割胶后由上海中科新生命生物科技有限公司作MALDI-TOF/TOF质谱分析。

1.2.6 重组体mLEAP2的抑菌活性测定

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)37 ℃、150 r/min培养至OD₆₀₀为1.0，取1 μL与100 μL含mLEAP2的培养液上清混匀，37 ℃培养2 h；取30 μL培养液涂布于营养琼脂平板，观察细菌生长情况。空白对照为100 μL含pPIC9K空载体的酵母培养液。

2 结果与分析 2.1 “mLEAP2”基因序列验证及其构建的重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”

图 1a为通过两次PCR扩增得到的目的片段“mLEAP2”经DNA测序验证后的cDNA序列及推断的氨基酸序列，证明目的片段的5'端已添加EcoRⅠ酶切位点，3'端已添加NotⅠ酶切位点和6×his标签；除去2个酶切位点和6×his标签，其余123 bp编码了由41个氨基酸残基组成的斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽。图 1b为经过菌落PCR、双酶切鉴定和DNA测序确证后成功构建的重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”。

2.2 在毕赤酵母GS115中表达重组体mLEAP2及其Western blot鉴定

图 2a是表达不同时间段培养液上清的Tricine-SDS-PAGE分析结果，可以发现表达120 h时在近7.8 ku处有最深条带，证明此时表达量达到最高，但空白对照(含pPIC9K空载体的酵母转化子)未见此条带。随后，利用目的蛋白羧基端携带的6×his标签可与his单克隆抗体结合的原理，对表达120 h的培养液上清进行Western blot分析，结果发现在近10 ku处有明显的杂交条带(图 2b)，由此初步证明获得了预期的重组体mLEAP2(rmLEAP2)。

2.3 rmLEAP2的纯化及其MALDI-TOF/TOF质谱鉴定

收集表达120 h的培养液上清，通过IMAC亲和层析对目的蛋白进行分离纯化，纯化产物经Tricine-SDS-PAGE分析后在近7.8 ku处有单一条带 (图 3)，与图 2a中的条带分子量位置相同，经Folin-酚法测定，其浓度为0.22 mg/mL，推算至表达量约为2.2 mg/L。目的条带经割胶后用于MALDI-TOF/TOF质谱鉴定(图 4)，结果显示，一级质谱的m/z 799.0至m/z 4 013.0范围内，共检测到21个峰，其中m/z为2 054.9502和2 183.042的两个峰的氨基酸序列分别为GHCSFSQPIISHHHHHH和KGHCSFSQPIISHHHHHH，分别与rmLEAP2自羧基端起的17个氨基酸残基和18个氨基酸残基的理论序列相符，由此证明纯化到的目的蛋白为预期的rmLEAP2。

2.4 rmLEAP2的抑菌活性

将枯草芽孢杆菌与含rmLEAP2的培养液上清按1∶100(V/V)混合后37 ℃培养2 h涂平板，经37 ℃、8～10 h培养后，发现平板上生长的菌落数明显减少(图 5a)；而将空白对照(含pPIC9K空载体的酵母转化子)的培养液上清经同样处理后涂平板培养，可以发现菌落长成一片(图 5b)，据此可初步证明rmLEAP2具有良好的生物学活性。

3 讨论

毕赤酵母除了具有可高密度培养、生长速度快、易于分泌表达外源蛋白、重组子稳定等优点，还可以对重组蛋白进行翻译后折叠修饰，因此被认为是良好的表达外源蛋白的宿主^[14]。本研究通过建立毕赤酵母表达系统，首次实现了斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达，一系列的鉴定实验证明了表达的产物为预期的rmLEAP2。但由于是在摇瓶中表达，pH不够稳定及溶氧量等各方面的表达条件有限，以致表达量不太高；此外，由于本次用于表达的目的基因是来自斑点叉尾鮰肝脏的天然cDNA，未根据毕赤酵母的偏爱性对密码子进行过优化，这可能也是影响表达量的一个重要原因。张宇婷等^[15]通过对N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiaB546基因)进行密码子优化，使其酶活从原来的33.1 U/mL上升至36.2 U/mL；陈惠等^[16]通过对植酸酶基因进行密码子优化，使其酶活从原来的23 667 U/mL上升至47 600 U/mL。进一步的研究将聚焦于对mLEAP2基因的密码子优化以及发酵培养条件的筛选和优化。

由于扩大制备或实际生产应用中不可能将纯化产物作为最终产品使用，而是对发酵液上清进行浓缩或干燥处理后将其作为实际应用的产品，因此发酵液上清是否具有生物学活性是至关重要的。本研究中我们将含rmLEAP2的培养液上清超滤浓缩10倍之后用于抑菌活性的测定，初步证明其具有抑制枯草芽孢杆菌的活性，但由于培养液的量以及表达量有限，未对其他细菌作进一步的抑菌效果测定。另一方面，本研究构建的重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”的信号肽基因区域按5'-3'方向依次含有1个Kex2和2个Ste13信号肽酶切位点基因，使得重组子在分泌表达时，理论上可能发生3种切割结果，而在Kex2位点处被切开的概率最高，以致2个Ste13位点所对应的氨基酸残基(EAEA)被留在目的蛋白的N端；此外，由于EcoRⅠ酶切位点(对应YV残基)位于2个Ste13位点的3'端，最终导致rmLEAP2的N末端会携带6个额外的氨基酸残基。上述情况是否会影响rmLEAP2的抑菌活性尚未知，因此，进一步的研究将聚焦于更换表达载体以期获得具天然N末端的rmLEAP2。

4 结论

本研究成功构建了斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽的真核重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”，并在毕赤酵母GS115中实现分泌表达；表达产物通过IMAC亲和层析法获得较高纯度的rmLEAP2，经Western blot分析和MALDI-TOF-TOF鉴定，证明该rmLEAP2为预期的目的蛋白。抑菌实验证明含rmLEAP2的培养液上清具有抑制枯草芽孢杆菌的活性。本研究结果为鱼类LEAP2抗菌肽的基因工程制备奠定了基础。