2. 上海市水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306
当外界环境改变时,微生物能改变自身的生理活动以适应坏境,其代谢活动相关蛋白质也会相应变化。浅玫瑰色链霉菌(Streptomyces roseolusDH)是一株从东海附近土壤中分离、筛选获得的野生菌株,它能以葡萄糖或甲壳素(或壳聚糖)为唯一碳源、通过不同的代谢和调控机制生长[1-2]。前期研究侧重于S.roseolus代谢壳聚糖分解酶的分离、鉴定[2]和优化分解酶的发酵工艺[3]等方面,由于对该菌株利用壳聚糖的代谢机制缺乏了解,故工业化发酵生产壳聚糖分解酶尚存不足。如能从蛋白质组学层面揭示S.roseolus代谢壳聚糖的机制,将对相关酶制剂的工业化生产产生极大的指导和推动作用。
双向电泳(2-DE)能利用蛋白质的等电点和相对分子质量差异对蛋白质进行有效的分离,该技术结合质谱分析已被广泛应用于解密生物的代谢机制[4-5]。利用蛋白质组学技术分析达坂喜盐芽孢杆菌(Halobacillus dabanensis) D-8T应对低渗冲击的代谢机制发现热激蛋白DanK、柱状决定蛋白、青霉素结合蛋白等在此应激反应中起重要作用[6]。由于前体分子对玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379产达托霉素的影响方法尚不明了,CHIMING等利用蛋白质组学技术揭示了甲基转移酶、ABC转运子、抗性蛋白等对达托霉素的合成影响重大[7]。
双向电泳已经被广泛用于细菌的蛋白组学研究,但核酸、多糖和脂类等污染物往往限制它的应用,胶条的pH、蛋白的上样量等电泳条件也将影响蛋白图谱的质量[8]。本研究通过对影响双向电泳结果的各项条件进行优化,建立了一套针对S.roseolus总蛋白的双向电泳技术体系,运用lmageMaster2D Platinum7.0软件分析未经壳聚糖诱导和经壳聚糖诱导下S.roseolus菌体总蛋白,并通过液相色谱-四级杆/飞行时间串联质谱(LC-Q-TOF-MS/MS)对差异表达的蛋白质进行分析,为揭示S.roseolus分解壳聚糖的代谢途径和调控机制积累了科学资料,也为该菌株后续的基因改造、产酶能力的提高等研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验菌株和培养条件实验用菌株从东海附近富含虾壳的土壤中分离得到的浅玫瑰色链霉菌。
培养条件:平板分离培养基成分组成(%,w/V):(NH4)2SO4 0.5,NaCl 0.5,K2HPO4 0.2,MgSO4·7H2O 0.1,胶体壳聚糖1.0,琼脂2.0。
液体种子培养基成分组成(%,w/V):蛋白胨0.5,酵母提取物0.5,NaCl 0.5,K2HPO4 0.07,KH2PO4 0.03,MgSO4·7H2O 0.05,葡萄糖0.2。
未诱导条件下S.roseolus菌体:从平板分离培养基中挑取单菌落接入100 mL液体种子培养基,30 ℃,150 r/min,培养至对数生长后期(OD600=0.9),取100 mL菌体培养液离心(5 000 r/min,15 min),弃去上清。用超纯水悬浮洗涤菌体,离心(5 000 r/min,15 min),重复3次得菌体沉淀待用。
诱导条件下S.roseolus菌体:平板分离培养基培养菌体,30 ℃培养3 d后,刮取10块平板培养基上的菌体待用。
1.2 方法 1.2.1 蛋白质提取用3 mL细胞裂解液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(m/V) CHAPS]悬浮菌体,加入蛋白酶、磷酸酶抑制剂(上海康成生物工程有限公司)各10 μL、PMSF (上海康成生物工程有限公司)15 μL,冰浴条件下裂解细胞10 min,再加入2%(V/V) IPG缓冲液和40 mmol/L DTT。冰浴中超声破碎(3 s/6 s)30 min,4 ℃离心(12 000 r/min,10 min),取上清液。
(1)丙酮沉淀法[9]:取一定体积的上清液置于1.5 mL微型离心管中,加入9倍体积预冷的丙酮溶液沉淀蛋白质,-20 ℃放置过夜。4 ℃离心(12 000 r/min,30 min),去除上清液,室温下放置数分钟使丙酮挥发,收集蛋白质沉淀。
(2) TCA-丙酮沉淀法[10]:取一定体积的上清液置于1.5 mL微型离心管中,加入9倍体积10%(w/V) TCA-丙酮溶液,-20 ℃过夜沉淀,4 ℃离心(12 000 r/min,30 min)收集沉淀,并用9倍体积丙酮溶液(-20 ℃预冷1 h)悬浮洗涤沉淀,-20 ℃放置1 h,4 ℃离心(12 000 r/min,30 min)收集沉淀。重复此洗涤操作两次,最后室温下放置数分钟使丙酮挥发,获得蛋白质沉淀。
(3)使用GE公司的2D clean-up试剂盒进行蛋白质纯化。
将蛋白质沉淀溶于1mL上样水化缓冲液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%(m/V) CHAPS、0.28%(m/V) DTT、0.5%(V/V) IPG缓冲液]中,冰浴放置30 min后4 ℃离心(12 000 r/min,10 min),取上清,使用蛋白质浓度定量试剂盒(TaKaRa Bradford Protein Assay Kit,宝生物工程大连有限公司)定量,-80℃分装冷冻保存。
1.2.2 双向电泳等电聚焦电泳:在24 cm的胶条槽中加入450 μL样品,将IPG胶条胶面朝下放入胶条槽,加入矿物油覆盖。设置等电聚焦程序:30 V 9 h,50 V 1 h,200 V 1 h,500 V 1 h,1 000 V 1 h,4 000 V 1 h,8 000 V 3 h,8 000 V 210 000 Vhs,500 V任意时间。
等电聚焦结束后,胶条先后在平衡液Ⅰ[6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl、29.3%(V/V)甘油、2%(w/V) SDS、0.002%(w/V)1%溴酚蓝储备液、65 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)]和平衡液Ⅱ[6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl、29.3%(V/V)甘油、2%(w/V) SDS、0.002%(w/V)1%溴酚蓝储备液、135 mmol/L碘乙酰胺]中分别平衡15 min,然后将胶条转移到12% SDS-PAGE上进行二向垂直电泳。电泳参数:第一步:以恒定功率2 W/gel,45 min;第二步:以恒定功率17 W/gel,5 h。
(1)染色方法的选择:选取24 cm、pH 3-10 IPG胶条双向电泳后,分别采用胶体考马斯亮蓝G-250法和银染法染色[11]。
(2) IPG胶条分离范围的选择:选取pH 3-10和pH 4-7的IPG胶条(24 cm)进行双向电泳后,银染。
(3)上样量的选择:选取24 cm、pH 4-7的IPG胶条,选择40、80和200 μg上样量进行双向电泳后,银染。
1.2.3 图像扫描与分析使用同一参数(分辨率:300 dpi,灰阶)对电泳凝胶进行扫描(扫描仪:中晶Bio-6000),用ImageMaster2D Platinum7.0软件进行图像分析。
1.2.4 质谱分析选取差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定(北京华大蛋白质研发中心),运用Mascot search engine version 2.3.01在数据库SwissProt2015(547085 sequences)中进行搜索比对。
2 结果与分析 2.1 染色方法对双向电泳图谱的影响不同凝胶染色方法的灵敏度差异将影响蛋白点的分析和检测[12]。实验对比了银染法和考马斯亮蓝G-250染色法对S.roseolus菌体总蛋白双向电泳图谱的影响。结果如图 1所示。
考马斯亮蓝G-250染色的图谱(图 1a)横条纹较多,碱性端基本无蛋白点,蛋白质点总数较少;银染的图谱(图 1b)蛋白质点较多且比较清晰,碱性端有蛋白质点出现。对比而言:考马斯亮蓝G-250染色法灵敏度低,需要的上样量较多,导致高丰度蛋白质聚集而引起大量横条纹,且染色时间较长;而银染法灵敏度高,上样量少即可检测到蛋白质,且背景清晰、横条纹较少、染色操作时间较短。在溶杆菌属Lysobacter yanansis.sp.nov.胞内外蛋白[13]和Streptomyces avermitilis菌体蛋白[8]的研究中均采用银染法染色,以获得清晰的图谱。
2.2 IPG胶条的分离范围对双向电泳图谱的影响根据不同生物蛋白质的等电点选择合适分离范围的IPG胶条也是实验成功的必要因素。为选择适合S.roseolus菌体蛋白分离的IPG胶条,本研究分别对pH 3-10和pH 4-7的IPG胶条的分离效果进行了比较,结果如图 2所示。
由采用pH 3-10 IPG胶条的电泳图谱(图 2a)可见,S.roseolus菌体总蛋白主要分布在酸性至中性区域,碱性区域分布较少,横条纹比较多,清晰可见的蛋白质点较少,这表明蛋白可能未被有效分离;由pH 4-7 IPG胶条的电泳图谱(图 2b)可知,蛋白质点均匀分布于整块凝胶,横条纹较少,背景清晰,蛋白质点被有效分离。以上结果表明pH 4-7的IPG胶条极大提高了S.roseolus菌体总蛋白质的分辨率,更适用于后续的S.roseolus菌体总蛋白质的差异分析。在Streptomyces avermitilis[8]和Listeria monocytogenes[14]菌体蛋白质的研究中均采用pH 4-7的IPG胶条,所得电泳图谱背景清晰,蛋白质点分布均匀,以致最终分析得到的生物信息比较完整。
2.3 蛋白质纯化方法对双向电泳图谱的影响减少蛋白质丢失、去除污染杂质(如盐、去污剂、核酸、脂类等)的样品纯化方法是双向电泳技术的关键步骤之一[15-17]。本实验分别比较了丙酮沉淀法、TCA-丙酮沉淀法和2D clean-up试剂盒法纯化蛋白质的效果,结果如图 3所示。
丙酮沉淀法所得的双向电泳图谱(图 3a)在偏中性区域大量蛋白质丢失,整体蛋白质点较少,这是由于丙酮沉淀后蛋白质复溶效果差[17];TCA-丙酮沉淀法所得电泳图谱(图 3b)在偏中性区域有少量的蛋白质点出现,酸性端的蛋白质点也少量增加,由此证明TCA-丙酮法的复溶效果优于丙酮法,但TCA-丙酮法使蛋白质长时间处于低pH值状态,这将导致一些蛋白质降解或修饰,影响后期结果分析[18];2D clean-up试剂盒法所得电泳图谱(图 3c)显示,蛋白质分布的比较均匀,酸性和中性端的蛋白质点数量都有所增加,表明蛋白质恢复量较大,此方法采用了独特的沉淀剂和辅助沉淀剂,能定量沉淀样本蛋白质,去除样品中脂类、糖类等干扰物质,且沉淀过程中不会引入其他杂质,操作简单,用时较短[19]。ZHANG等[20]对Campylobacter jejuniStrain NCTC11168胞外分泌蛋白的研究和陈维等[21]对M.bovis菌体蛋白的研究中,都采用2D clean-up试剂盒对样品进行纯化以便获得质量较高的电泳图谱。
2.4 不同上样量对双向电泳图谱的影响蛋白质样品上样量也会在较大程度上影响双向电泳的图谱质量,上样量太少会导致电泳图谱不能反映生物体完整的生物学信息,上样量太多会导致高丰度蛋白质聚集或沉降,引起横条纹和拖尾现象的出现,不能有效分离蛋白质[22]。本实验比较了40、80和200 μg的上样量对电泳图谱的影响,以期获得最佳上样量,得到的双向电泳图谱如图 4所示。
当上样量为40 μg (图 4a)时,图谱上的蛋白质点数量明显偏少;上样量为80 μg (图 4b)时,图谱上的蛋白质点清晰可见,边界分明,横条纹较少,蛋白分布均匀;上样量为200 μg (图 4c)时,图谱背景较深,横条纹较多,蛋白质点分离较少。因此,采用80 μg上样量可获得最佳的分离效果。在地衣芽孢杆菌总蛋白[23]和Bacillus subtilis菌体蛋白[24]的研究中,也采用80 μg上样量对其进行双向电泳。
2.5 未诱导和诱导条件下浅玫瑰色链霉菌差异表达蛋白生活环境的改变会导致细菌呈现不同应激反应,与此相关的某些蛋白质也会发生差异变化[25]。AISHWARYA等[26]通过蛋白质组学技术分析抗菌药物环丙沙星对天蓝色链霉菌蛋白质表达的影响,发现24种蛋白质的表达呈显著差异,通过了解这些蛋白质在糖代谢、转录和翻译过程中的作用,阐明了这种细菌的耐药机制,这一研究有助于新抗生素的发现。
本研究选择分离范围为pH4-7的IPG胶条,采用2D clean-up试剂盒法纯化菌体总蛋白,以80 μg蛋白量上样,选择银染的染色方法,结合适宜的双向电泳参数,分别对未经壳聚糖诱导和经壳聚糖诱导条件下的S.roseolus菌体总蛋白质进行3次生物学重复实验,获得了重复率较高的双向电泳图谱(图 5)。
利用软件分析匹配,重复率可达89.4%以上。通过检测蛋白质点可得:未诱导条件下的S.roseolus菌体蛋白质电泳图谱上可检测到697±25个清晰可供分析的蛋白质点;壳聚糖诱导下的S.roseolus菌体蛋白质电泳图谱上可检测到723±14个蛋白质点。
2.6 差异表达蛋白质的鉴定分析以未诱导菌体蛋白质电泳图谱为参照,利用软件对诱导菌体的蛋白质电泳图谱进行差异分析可得:有18个蛋白质点在诱导菌株中表现出明显差异,其中14个蛋白质点表达量上调,4个蛋白质点表达量下调。选取10个差异表达量在5倍以上且表现为上调的蛋白质点(图 6)进行质谱鉴定。
根据UniProt和DAVID对差异蛋白进行功能分析可得(表 1),这10个差异蛋白主要涉及以下方面:蛋白质的生物合成、糖代谢、分子伴侣等。
(1)延伸因子G:即图 6中的1号蛋白。在蛋白质合成中的翻译延伸过程,催化核糖体的移位,是一种GTP结合蛋白,它识别并运输氨酰-tRNA翻译到核糖体上,将其定位在核糖体的A位点上,这样的定位操作加快了氨基酸合成蛋白质的进程。同时在GTP水解之后,延伸因子G还可以控制翻译的精确度[27]。
(2)丝氨酸羟甲基转移酶(EC:2.1.2.1):即图 6中的2号蛋白。通过四氢叶酸(THF)作为一个碳载体,催化丝氨酸和甘氨酸之间的可逆转换。这种反应是参与嘌呤、胸苷酸、蛋氨酸和其他重要的生物大分子合成需要一碳基团的主要来源,它是氨基酸合成和一碳代谢过程中的关键酶之一。这种蛋白还具有独立的醛缩酶活性,它通过一种古老的羟醛缩合机理合成甘氨酸和醛[26]。
(3)核糖体50S亚基蛋白L6:即图 6中的4号蛋白。23S rRNA的结合蛋白,其次级结构十分重要。它位于L7/L12基杆亚基界面附近,靠近肽基转移酶中心的tRNA结合位点[26],可与RNA结合,参与蛋白质的翻译过程。
(4)依赖DNA型RNA聚合酶(EC:2.7.7.6):即图 6中7号蛋白。以4个三磷酸核糖核苷为底物,催化DNA转录为RNA,完成蛋白质合成的第一步[26],催化反应式:
(5)翻译起始因子IF-2:即图 6中的10号蛋白。参与蛋白合成中所需的30S起始复合物的形成,并组成复合物的重要组成部分之一。还能防止甲酰甲硫-tRNA自发水解,促使其结合到30S核糖体上,在引发剂tRNA和30s起始复合物的结合中起关键作用[28]。
2.6.2 参与糖代谢的有关蛋白(1)烯醇化酶(EC:4.2.1.11):即图 6中的3号蛋白。在糖酵解过程中起重要作用,它能催化2-磷酸甘油酸的可逆转换成磷酸烯醇式丙酮酸,它在通过糖酵解降解碳水化合物的过程中是必不可少的[28]。它的催化反应式:
糖酵解初步对糖进行分解代谢生成丙酮酸,这一过程不需要氧气且可生成少量ATP,为生物机体的生理活动提供能量。其代谢产物丙酮酸经进一步氧化后进入三羧酸循环彻底被氧化并释放大量能量。
(2) N, N’-二乙酰壳二糖磷酸化酶(EC:2.4.1.280):即图 6中的6号蛋白。催化壳二糖的可逆磷酸化,使其转化为N-乙酰葡萄糖胺和α-N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸盐[27],为之后的降解反应提供底物。其催化反应式:
(3)琥珀酰辅酶A连接酶(EC:6.2.1.5):即图 6中的8号蛋白。参与三羧酸循环中琥珀酸合成的第一步,催化琥珀酸与辅酶A结合,并释放出磷酸盐[29],其催化反应式:
分子伴侣2:即图 6中的5号蛋白。分子伴侣能够维持蛋白质结构的稳定,它通过结合作用稳定蛋白质构象,防止展开的多肽错误折叠,通过有效的结合和释放, 促进多肽再折叠和正确组装。其在进化历程中没有巨大变化,是一类稳定保守的蛋白质家族,分布广泛,在各种生物体中均有发现。由于分子伴侣能够防止多肽错误折叠而导致蛋白质变性,且能够促进多肽正确组装而使蛋白质复性,所以在生物体经受高温、高盐和碳源改变等生长环境突变的情况下,分子伴侣在维持其生理活动方面有重要作用[26]。
2.6.4 与活性氧自由基清除的有关蛋白烷基氢过氧化物还原酶(EC:1.11.1.15):即图 6中的9号蛋白。依赖于NADH的过氧化物酶,应对氢和烷基过氧化物,从而保护细菌避免由宿主免疫系统引起的活性氮中间体和氧化应激反应[29],其催化反应式:2 R′-SH+ROOH → R′-S-S-R′+H2O+ROH。
3 讨论本研究通过对蛋白质纯化方法、染色方法、上样量大小和胶条的分离范围等几个方面的条件优化,建立了一套适合S.roseolus蛋白质组分析的双向电泳技术,并利用此方法对未诱导和壳聚糖诱导条件下S.roseolus菌体总蛋白质进行分离分析,获得18个差异表达蛋白,选取其中10个差异表达量在5倍以上的蛋白点进行质谱鉴定,并对其进行功能分析发现:在以壳聚糖为碳源的诱导环境下,与蛋白合成、糖代谢以及应激反应相关的蛋白表达量增加,这表明S.roseolus在壳聚糖诱导条件下,一方面大量生成与降解壳聚糖有关的蛋白,另一方面加快了分解壳聚糖初级代谢产物的活动速率,这保证在壳聚糖培养的条件下S.roseolus能快速建立相应的代谢途径过程,适应新碳源的培养环境。据有关文献的报道,通过增加延伸因子、翻译起始因子和核糖体蛋白等与蛋白合成有关的蛋白质的表达量来应对培养环境的改变在微生物中非常普遍[30]。
本研究首次对壳聚糖诱导S.roseolus差异蛋白质组学进行深入研究,并成功获得有关的差异蛋白质信息,这为后续完善S.roseolus代谢壳聚糖的生物学信息库奠定基础,也为揭示其分解壳聚糖的代谢途径和调控机制积累了科学资料,为对S.roseolus进行基因改造以提高其产酶能力提供了可能。
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