2. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院, 上海 200437;
3. 赤峰学院附属医院, 内蒙古 赤峰 024005
血栓性疾病是由血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引起的疾病,具有发病率、死亡率及致残率高的特点,其导致的死亡人数占全球总死亡人数的51%,远远超过肿瘤和感染性疾病等造成的死亡人数。动脉粥样硬化及血栓栓塞并发症在国内外均为人口死亡与致残的第一位原因,是威胁中老年人身体健康的重要疾病之一[1-2]。目前,溶栓药物已经成为临床诊断心脑血管疾病的常规治疗方法,并且确定了用药指导原则[3-4]。溶血栓药物大多是纤溶酶原激活物或类似物,能直接或间接激活纤维蛋白溶解酶原变成纤维蛋白溶解酶,并降解纤维蛋白[5]。目前常用的临床溶栓药物有3类:第一代溶栓药物,以链激酶和尿激酶为代表,效果显著,但是没有特异性,容易导致全身纤溶而增加出血危险等不良反应,且链激酶具有免疫原性,可引起过敏反应[6];第二代溶栓药物,以组织型纤维酶原激活剂为代表,与第一代溶栓药相比,溶栓作用强,对纤维蛋白特异性高,对纤维酶原激活作用较弱,全身性纤溶反应低,但是大量使用仍会引起出血反应[7];第三代溶栓药物是利用基因工程和单克隆抗体技术对第二代产品进行改造制成的新型纤溶酶原激活剂产品,如瑞替普酶、替奈普酶、靶向溶栓剂等,半衰期长、特异性高、溶栓作用强,但是价格昂贵,存在一定的副作用[8]。虽然第二代与第三代溶栓药相比第一代溶栓药物有了一定的进步,但是仍存在一定的问题。因此研制效果好、副作用小的溶血栓药物具有十分重要的临床意义。
近年来,随着溶血栓基础研究的深入,提出了通过小分子化合物激活血液中存在的纤溶酶原激活剂而作用于体内的纤溶系统溶解血栓的新理论,发现了近百种小分子纤溶活性化合物,涉及到多酚、氨基磺酸或其盐、吲哚衍生物、萜、生物碱和酰胺等,它们能作用于纤溶酶原和尿激酶前体且使生理的纤溶反应平稳地进行,国内外研究开发这些化合物正成为探索新型纤溶疗法药物的一个重要途径[9]。
海洋微生物因其具有极其丰富多样的种类,并且能够生存于低温、缺氧、高压等独特的海洋生态环境中,使其能够产生具有优良生物活性且结构新颖的天然化合物,海洋微生物代谢产物已成为药物创新与新药开发的重要来源[10-11]。与一些传统的临床溶栓药物相比,从海洋生物资源中获取的小分子纤溶活性化合物,具有安全性高、成本低及来源丰富等优点。
本课题组前期从海洋微生物长孢葡萄穗霉FG216的代谢产物中发现了一种新型纤溶活性小分子化合物FGFC1(Fungi Fibrinolytic Compound 1),属于吡喃并异吲哚酮类衍生物,纯品为褐色粉末,分子量为869,易溶于甲醇等有机试剂,微溶于水 [12-13]。药效学和毒理学研究表明FGFC1是一种安全有效的溶血栓化合物,药代动力学研究发现其消除半衰期约为22.37 min[14]。但是,由于具有溶解度低、口服吸收效果差、半衰期短、水溶液遇强酸、强光及强氧化剂不稳定等特点,导致FGFC1难以制成临床所接受的普通制剂,而目前临床适用于急性心肌梗塞、急性脑梗塞等急症治疗的最好剂型是注射剂型,因此如果克服FGFC1难溶于水的缺陷,制备冻干粉针剂具有非常重要的临床意义。近年来,冻干粉针剂成为药品制剂生产中的创新剂型,其制备在低温环境下进行,不会使药物失去生物活力或发生变性,因此冻干粉针剂在有着巨大的发展潜力[15]。本课题就如何将FGFC1制成临床上可使用的安全、有效、稳定的药剂进行研究。
1 材料与方法 1.1 材料与设备FGFC1来源于上海海洋大学实验室,纯度>98%,乙酸铵为分析纯,甲醇为色谱纯,L-赖氨酸为BR级,甘露醇为药用级,碳酸氢钠、枸橼酸钠、甘露醇注射液、葡萄糖注射液、生理盐水注射液及灭菌注射用水等均为注射级。
主要仪器为Agilent 1260高效液相色谱仪、比朗FD-C-50真空冷冻干燥机和泰宏LRH-150-YG药物稳定性试验箱等。
1.2 HPLC法检测FGFC1的含量及可行性评价 1.2.1 色谱条件色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×25 mm,5 μm);流速:1 mL/min;流动相:V(甲醇)∶V(0.05 mol/L乙酸铵缓冲盐)= 85∶15;紫外检测波长:265 nm;进样量:20 μL;柱温:室温。
1.2.2 溶液的配制(1)对照品溶液:取适量FGFC1对照品,精密称定1.0240 mg,置10 mL棕色容量瓶中,甲醇溶解、定容至刻度,得到对照品溶液。(2)供试品溶液:取适量FGFC1粉针剂,加水复溶,移取0.2 mL置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度。(3)阴性对照溶液:取FGFC1粉针剂的空白辅料适量,精密称定,同“供试品溶液”方法配制。
1.2.3 系统适应性实验取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液,按1.2.1色谱条件分别进样测定。
1.2.4 标准曲线精密称取FGFC1标准品置于容量瓶中,甲醇定容,以此为母液。依次稀释母液,配置成浓度范围是0.64~256 μg/mL的标准品溶液,以1.2.1 色谱条件进样,并且以FGFC1峰面积(A)为纵坐标,标准液浓度(μg/mL)为横坐标,进行线性回归。
1.2.5 日内精密度试验取高、中、低3个浓度的标准液,连续进样5次,经高效液相进样检测后计算RSD值。
1.2.6 日间精密度试验取高、中、低3个浓度,每天进样1次,连续3天,经高效液相进样检测后计算RSD值。
1.2.7 加样回收率试验精密称取FGFC1粉针剂样品适量,配制成一定浓度的溶液(FGFC1浓度为103.22 μg/mL),然后加入102.4 μg/mL的 FGFC1标准溶液1.6~2.4 mL,进样检测后计算平均加样回收率及RSD值。
1.2.8 重复性试验取6份样品,按1.2.1条件稀释进样,并计算FGFC1含量及RSD值。
1.3 处方筛选 1.3.1 助溶剂种类的筛选FGFC1在碱性条件下相对稳定,故选择碳酸氢钠、枸橼酸钠、苯甲酸钠、去氧胆酸钠、L-赖氨酸、L-精氨酸等偏碱性物质作为助溶剂。
1.3.2 助溶剂用量选择确定助溶剂的种类后,根据FGFC1与助溶剂的比例(质量比为1∶0.5、1∶1、1∶3、1∶5、1∶10、1∶20)确定助溶剂的用量,每份取FGFC1 20 mg,加入纯化水至其完全溶解计算FGFC1的溶解度。
1.3.3 助溶剂稳定性考察将优化后的3组溶解后置于30 ℃恒温水浴锅水浴24 h,考察FGFC1的稳定性。
1.3.4 赋形剂种类的筛选选择甘露醇、葡萄糖和乳糖作为赋形剂。将FGFC1∶助溶剂∶赋形剂按一定比例混合,加入适量的纯化水,溶解后放入-20 ℃冰箱冷冻后进行真空干燥(-48 ℃、冻干48 h),考察样品的外观性状。
1.3.5 赋形剂用量选择赋形剂的添加量会对冻干样品的性状产生一定的影响,制备不同比例(FGFC1∶赋形剂)的冻干粉针剂样品,考察其复溶性和外观。
1.4 粉针剂样品质量考察 1.4.1 pH的测定将粉针剂样品加适量纯化水复溶,溶解后测定pH。
1.4.2 外观及复溶时间的测定粉针剂样品,外观性状观察,加水后振摇溶解,并记录时间[16],平行操作3份。
1.5 稳定性试验 1.5.1 与常用输液的配伍性将优化后的3种冻干粉针剂样品采用甘露醇注射液、葡萄糖注射液、生理盐水注射液50 mL进行溶解,并于30 ℃恒温水浴24 h考察样品稳定性,分别于0、4、8、12、24 h取样,测定FGFC1含量,与0 h相比较。
1.5.2 影响因素考察分别制备优化后的3种冻干粉针剂样品各3批,分为枸橼酸钠组、碳酸氢钠组和L-赖氨酸组,并进行高温、高湿、强光试验,于规定时间(5 d和10 d)取样,并检测样品中FGFC1的含量,与0 d相比较[17]。
1.5.3 加速试验分别制备优化后的3种冻干粉针剂样品各3批,分为枸橼酸钠组、碳酸氢钠组和L-赖氨酸组,并密封放置于(40±2) ℃、相对湿度75%±5%的药物稳定性试验箱中,分别于0、1、2、3个月检测FGFC1的含量、样品溶液的pH并观察外观。
1.5.4 低温试验分别制备优化后的3种冻干粉针剂样品各3批,分为枸橼酸钠组、碳酸氢钠组和L-赖氨酸组,并密封放置于4 ℃冰箱中,于8个月后测3组粉针剂的FGFC1含量、pH并观察外观。
1.5.5 数据分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析,计量资料以X±S表示,组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P< 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 HPLC法的可行性评价 2.1.1 系统适应性实验由图 1可见基质对主药峰无干扰,辅料对FGFC1的检测没有干扰。
根据HPLC法检测结果得到标准曲线及线性回归方程:y=21.631x+6.248 7,R2=1.0000。说明FGFC1在0.64~256 μg/mL范围内,本含量测定方法具有良好的线性关系。
2.1.3 日内精密度检测结果表明,高、中、低3个浓度的RSD值(n=5)分别为0.10%、0.22%、0.48%,说明含量测定方法的日内精密度良好。
2.1.4 日间精密度检测结果表明,高、中、低3个浓度的RSD值(n=3)分别为0.38%、0.47%、1.41%,说明含量测定方法的日间精密度良好。
2.1.5 加样回收率由表 1可知,平均回收率为98.72%,RSD=1.16%(n=9),说明含量测定方法可靠性强。
检测结果表明,RSD=0.68%(n=6),说明FGFC1的HPLC含量测定方法重复性良好。
2.2 处方筛选 2.2.1 助溶剂种类及用量的筛选由表 2可知,L-赖氨酸、L-精氨酸、碳酸氢钠的助溶效果最好,由于L-精氨酸作为助溶剂溶解后,溶液静置后会析出乳白色沉淀,故选择L-赖氨酸和碳酸氢钠作为助溶剂。
由表 3可知,L-赖氨酸组(1∶5)、碳酸氢钠组(1∶0.5、1∶1)及枸橼酸钠组(1∶3)的助溶效果较好,但碳酸氢钠组(1∶0.5)溶解速度慢于同组1∶1比例,枸橼酸钠组1∶3溶解速度高于1∶5,所以确定碳酸氢钠组(1∶1)、L-赖氨酸组(1∶5)和枸橼酸钠组(1∶3)助溶效果最佳。
由图 2可知,3组样品的FGFC1含量没有明显变化,说明加入3种助溶剂的FGFC1水溶液是稳定的。
由表 4可知,甘露醇的赋形效果好,因此选择甘露醇作为赋形剂。由表 5~7可知,当FGFC1∶碳酸氢钠∶甘露醇=1∶1∶5、FGFC1∶L-赖氨酸∶甘露醇=1∶5∶10、FGFC1∶枸橼酸钠∶甘露醇=1∶3∶10时,粉针剂外观良好且复溶时间低于30 s。
由表 8可知,枸橼酸钠组的pH更接近血液的pH。
由表 9可知,3种粉针剂样品的复溶时间低于30 s,且枸橼酸钠组复溶速度较快,3组外观均良好。
由图 3可知,碳酸氢钠组和L-赖氨酸组粉针剂样品在3种输液中基本稳定,枸橼酸钠组在葡萄糖和甘露醇注射液中稳定,在生理盐水中不稳定。
图 4表明,在强光条件下,L-赖氨酸组基本稳定,碳酸氢钠组与枸橼酸钠组则有一定程度的降解。相对湿度90%±5%的高湿条件下,枸橼酸钠组基本稳定,L-赖氨酸组和碳酸氢钠组都有一定程度的降解,且碳酸氢钠组降解程度大。相对湿度75%±5%的高湿条件下,枸橼酸钠组基本稳定,L-赖氨酸组和碳酸氢钠组均有一定程度的降解,并且L-赖氨酸组的降解程度高于碳酸氢钠组。60 ℃与40 ℃高温条件下,碳酸氢钠组均比较稳定,而L-赖氨酸组与枸橼酸钠组均有一定程度的降解。因此,枸橼酸钠组在高湿条件下比较稳定,在高温和强光条件下不稳定,L-赖氨酸组在强光条件下稳定,在高湿与高温条件下不稳定,且高温、高湿条件不同,降解的速度不同。碳酸氢钠组在高温条件下较稳定,在高湿与强光条件下不稳定性,且相对湿度不同,降解的速度不同。
由表 10可知,在加速试验条件下放置3个月,枸橼酸钠组粉针剂的外观没有变化,碳酸氢钠组与L-赖氨酸组粉针剂的外观产生了明显变化,3组粉针剂的pH没有发生明显变化(表 11)。图 5表明,枸橼酸钠组含量下降最慢,碳酸氢钠组次之,L-赖氨酸组降解最多。
由表 11可知,低温下贮藏8个月,枸橼酸钠组的外观无变化,碳酸氢钠组及L-赖氨酸组外观均有明显变化。表 12、图 6表明,在低温环境下,3组粉针剂的FGFC1含量和溶液pH基本不变。
本文采用冷冻干燥技术制备FGFC1冻干粉针剂,冷冻干燥技术适用于对热敏感和在溶液中不稳定的药物。由于FGFC1的溶解性差,其水溶液在强光、强酸、强氧化剂条件下等均不稳定,故决定采用冻干法制备FGFC1粉针剂。冻干粉针剂具有稳定性好、含水量低和易于保存的特点[15]。
为了改善药物的溶解性,可选择加入助溶剂。选择助溶剂时应根据药物自身的结构特点和理化性质进行选择。本文根据FGFC1水溶液遇强酸、强氧化剂等均不稳定、在强碱条件下相对稳定的特性,选择偏碱性物质如枸橼酸钠、碳酸氢钠等作为助溶剂。根据助溶效果进行筛选,选择枸橼酸钠、碳酸氢钠及L-赖氨酸作为助溶剂,并确定了3种助溶剂的最佳质量比为FGFC1∶碳酸氢钠=1∶1、FGFC1∶L-赖氨酸组=1∶5 、FGFC1∶枸橼酸钠=1∶3。助溶剂比例不同,助溶效果也不同,助溶剂用量过高或过低,均会降低其助溶效果,而且助溶剂不仅增加了FGFC1的溶解度,还提高了FGFC1的稳定性(30 ℃恒温水浴24 h,FGFC1含量无变化)。
合格的冻干粉应具有良好的外观、疏松细腻,加水后溶解迅速且完全。因此,在真空冷冻干燥的过程中,常加入赋形剂起支撑作用,目前常用的赋形剂有甘露醇、葡萄糖、乳糖、左旋糖酐和聚乙烯吡咯烷酮等[18]。本文选用葡萄糖、乳糖、甘露醇作为赋形剂,考察粉针剂的外观,发现乳糖和葡萄糖作赋形剂时,粉针剂的外观不疏松饱满、部分有萎缩现象,因此选甘露醇作为赋形剂。经过赋形剂最佳用量的考察发现,助溶剂的种类不同,甘露醇的最适用量也不相同。赋形剂用量不同会影响粉针剂的外观 [19]。当赋形剂含量过低或过高时,导致复溶时间的增加。
本文以助溶效果、pH、外观及复溶时间为指标,制定了3种粉针剂[W(FGFC1)∶W(枸橼酸钠)∶W(甘露醇)=1∶3∶10,W(FGFC1)∶W(碳酸氢钠)∶W(甘露醇)=1∶1∶5,W(FGFC1)∶W(L-赖氨酸)∶W(甘露醇)=1∶5∶10],并且考察3种粉针剂的稳定性。首先,为确保临床用药安全有效,考察了3种粉针剂与3种临床常用输液的配伍性,荣敏等[20]曾做过类似研究。根据研究结果,碳酸氢钠组与L-赖氨酸组粉针剂在临床上可以使用3种注射液作为溶媒,枸橼酸钠组粉针剂在临床上应避免使用生理盐水作为溶媒,并且FGFC1粉针剂应在临用前溶解,放置于室温(低于30 ℃)下,一般不应超过24 h。
影响因素试验结果表明,高温、高湿、强光对3种粉针剂的影响程度不同。枸橼酸钠组在高湿条件下比较稳定,在高温和强光条件下不稳定;L-赖氨酸组在强光条件下稳定,在高湿与高温条件下不稳定,且高温、高湿条件不同,降解的速度不同;碳酸氢钠组在高温条件下较稳定,在高湿与强光条件下不稳定性,且相对湿度不同,降解的速度不同。在(40±2)℃、相对湿度75%±5% 的条件下进行3个月的加速试验,发现3种粉针剂的稳定性:枸橼酸钠组最好、碳酸氢钠组次之、L-赖氨酸组降解速度最快,且碳酸氢钠组和L-赖氨酸组外观产生明显变化,加速试验结果与影响因素试验结果相吻合。由于高温、高湿对3种粉针剂均有严重影响,因此进行低温试验,将3种粉针剂在4 ℃冰箱中避光密封保存8个月。低温条件下,3种粉针剂的含量、pH和枸橼酸钠组外观均没有变化,而碳酸氢钠组与L-赖氨酸组外观产生明显变化。因此,根据低温试验和加速试验的结果,确定3种处方工艺中最优化的是:W(FGFC1)∶W(枸橼酸钠)∶W(甘露醇)=1∶3∶10,FGFC1含量为10 mg,-48 ℃冷冻干燥48 h。
由于枸橼酸钠组冻干粉针剂样品在高湿条件下含量稳定,高温及强光条件下均有一定程度的降解,在低温条件下长时间储存性质稳定,因此,市售FGFC1注射剂应采用棕色瓶包装,并于4 ℃冰箱中密闭存放。
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2. Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China;
3. Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng 024005, Inner Mongolia, China