2017,
Vol. 26
2. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306;
3. 中国科学院 遗传与发育生物学研究所, 北京 100101
MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码RNA分子,通过与靶mRNA的3'端非翻译区(3'UTR) 碱基配对进行基因转录后调控[1-2]。2000年REINHART等[3]在线虫中发现调控时序性发育的基因let-7，随后逐渐在人类、果蝇、小鼠等多种生物中鉴定出更多的miRNAs，已经发现miRNA在细胞增殖、代谢、凋亡、肿瘤形成以及免疫等众多不同的生物过程中起着重要作用[4-7]。目前，miRNAs作为动物发育过程中的一类重要调控因子而被广泛关注,它们在斑马鱼发育及正常生理过程中的调控功能也逐渐被揭示[8]。
miR-202是与细胞分化相关的let-7家族成员，其序列和功能在脊椎动物物种间具有高度保守性[9]。已有研究表明，miR-202在胃癌、乳腺癌、宫颈鳞状上皮细胞癌、大肠癌、滤泡性淋巴瘤等人类癌病中具有抑癌作用[10-14]。另一项研究表明原癌基因MYCN是miR-202的直接靶位点,可以抑制神经母细胞瘤细胞增殖 [15]。miR-202在小鼠、非洲爪蟾、大西洋圣日比目鱼成熟精巢和鸡幼崽的精巢中特异性表达[16-19]，在胚胎小鼠性腺发育与分化和功能行使上起重要作用[16]。有报道miR-202在鼠性腺中特异性表达,其表达受到上游性别决定因子sox9的调控[20]。而斑马鱼作为研究发育生物学的理想脊椎动物模型，却没有miR-202在斑马鱼早期胚胎发育中的表达量和调控作用的相关报道。
在本研究中，我们首先利用实时定量反转录PCR技术和整体原位杂交技术(Whole mount in situ hybridization WISH)检测了miR-202在斑马鱼胚胎发育过程中的表达，随后采用锁核酸(locked nucleic acid，LNA)修饰的miR-202反义核酸显微注射斑马鱼第一细胞期胚胎，发现阻断miR-202功能导致斑马鱼胚胎发育停滞在受精后4 hpf左右，证明miR-202是斑马鱼胚胎发育所必需的，本研究为miR-202在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究提供了重要基础。
1 材料与方法 1.1 材料实验用斑马鱼均为野生型AB品系，购自北京中国科学院遗传与发育生物学研究所，繁殖饲养与交配取卵参照斑马鱼手册中的方法进行。水温为28.5 ℃，明暗光照周期分别为14 h、10 h。
1.2 仪器与试剂实验仪器包括冷冻离心机5417R (Eppendorf)、Milli-Q超纯水仪( Millipore)、分光光度计Nandrop(Thermo Scientific)、微量注射泵 PLI-100A Plus、垂直拉针仪 PC-10、磨针仪 EG-400、立体显微镜Stemi 2000和荧光定量PCR仪CFX96(Bio-Rad)等。
试剂包括mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion)、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)、SYBR Green(Roche)、DEPC，苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇和异丙醇等试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 实验方法 1.3.1 LNA-anti-202、pre-miR-202的显微注射根据miRBase(http://www.mirbase.org/) 网站中miR-202成熟序列，斑马鱼LNA-anti-202和标准阴性对照LNA-anti-NC合成于Exqion公司(表 1)；斑马鱼pre-miR-202(miR-202前体)合成于Biomics公司(表 1)。所有的反义核苷酸及前体均溶解在DEPC水中。注射浓度：LNA-anti-202和LNA-anti-NC 均为200 μmol/L；pre-miR-202为10 μmol/L，注射体积为1 nL/胚胎，注射部位为动物极。所有显微注射用的胚胎均为1细胞受精卵阶段，注射后的胚胎在28.5 ℃的培养箱中培养观察，死亡的胚胎及时清除以排除对正常发育胚胎的影响。观察时间点为 1、2、4、6、8、24 hpf，用显微镜观察并拍照。
1.3.2 整体原位杂交由Exqion公司合成3'地高辛标记的miR-202探针(表 1)。收集不同发育时期的斑马鱼胚胎，即2、4、6、8、10、24 hpf，用4%多聚甲醛(PFA)溶液固定过夜(至少12 h以上)。然后保存于甲醇溶液中，置于-20 ℃备用。24 hpf的胚胎，需先用10 mg/mL胰酶消化脱去卵膜后,再用4% PFA固定。每个Eppendorf 1.5 mL EP管中加10个(最多不超过50个)胚胎，经系列甲醇/PBST(75%、50%、25%、0)水合、蛋白酶K消化(如果胚胎小于10 hpf，直接在PBST中洗2次，不需用蛋白酶K消化)和4% PFA再固定10 min。移去固定液，用PBST洗涤，然后在预杂交液中，58 ℃预杂交3 h。接着置于含20～80 nmol/L探针的杂交液中，58 ℃杂交过夜。多余的探针于58 ℃经2×SSC，0.2×SSC 洗涤，再于室温下经系列0.2×SSC/PBST 溶液(75%、50%、25%、0)洗涤，以含山羊血清的PBST溶液室温封闭探针3 h；在稀释5 000 倍的抗地高辛抗体(anti-Dig-AP)中，4 ℃过夜；未结合的抗体用1×PBST 溶液洗去，再加入显色溶液(NBT +BCIP溶液)显色1 h，迅速用终止液洗去多余的显色液，显微镜观察拍照并记录。
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表 1 本研究涉及RNA序列 Tab.1 Sequences of RNA |
依据Ambion公司的mirVanaTM miRNA分离试剂盒说明书分离miRNA，由分光光度计定量miRNA最终浓度。利用DNAStar设计miR-202的颈环引物序列(表 2)；用Premier 5.0软件设计miR-202引物序列并以U6 snRNA作为内参由上海生工生物技术有限公司合成(表 2)。按试剂盒说明书取1 μg的总miRNA样品，用miR-202颈环引物及U6 RT P/U6-Rev引物反转录合成cDNA第一链。实时定量qPCR按照每个处理3个重复，每个样品3次重复进行。20 μL反应体系为：2×SYBR Green,10 μL；引物，各1 μL；cDNA 模板，2 μL；加DEPC水补充至20 μL。PCR程序设定为：95 ℃，10 min；95 ℃，20 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s，共40循环；72 ℃，10 min。
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表 2 实时定量反转录PCR引物 Tab.2 Primers for real-time RT-PCR |
实时荧光定量PCR反应结束后读取Ct值，以U6 snRNA为内参基因，采用2- ΔΔCt方法计算miR-202的相对表达量。用GraphPad Prism 5 软件进行数据作图以及单因素方差分析，P＜0. 05 为显著差异。数据结果以平均值±标准差(Mean±SE) 表示。
2 结果与分析 2.1 miR-202在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达为了揭示miR-202在斑马鱼胚胎发育过程中的功能，我们首先采用实时荧光定量反转录PCR检测了miR-202在斑马鱼胚胎发育过程各个时期的表达。结果显示，miR-202在未受精的鱼卵中表达水平最高,受精后水平显著下降。miR-202在斑马鱼胚胎发育整个过程保持表达，早期发育阶段在2细胞期时表达量最高，随后降低，在2 h达到最低，在此之后水平持续上升并在72 h达到高峰(图 1)。
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图 1 miR-202在斑马鱼胚胎发育过程中各时期表达变化
Fig. 1 The expression of miR-202 during the zebrafish embryonic development
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同时我们还运用整体原位杂交检测了miR-202在斑马鱼胚胎中的表达。结果显示，miR-202在斑马鱼胚胎发育过程中持续表达(图 2)，与实时荧光定量反转录PCR结果相一致。上述结果提示我们miR-202可能在斑马鱼胚胎发育过程中起调控作用。
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图 2 miR-202在斑马鱼早期胚胎发育过程中的空间表达
Fig. 2 The spatial expression of miR-202 during the zebrafish embryonic development
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为了研究miR-202在斑马鱼胚胎发育中的功能,我们采用反义核酸LNA-anti-202注射斑马鱼受精卵来抑制miR-202的功能。结果显示miR-202的阴性对照(LNA-anti-NC)注射组胚胎在1、2、4、6和8 hpf等时间点与野生型胚胎相比均无明显发育异常(图 3a,b)。LNA-anti-202注射后在1、2和4 hpf时间点与阴性对照组和野生型胚胎相比，发育无明显异常，但是在4 hpf后胚胎发育明显异常，主要表现在胚胎发育停滞在4 hpf发育时期，并在6到8 hpf之间陆续死亡(图 3c)。
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图 3 显微注射LNA-anti-202对斑马鱼胚胎发育的影响
Fig. 3 Effect on the zebrafish embryonic development by microinjection of LNA-anti-202
(a)野生型斑马鱼胚胎； (b) 显微注射的对照组斑马鱼胚胎； (c)显微注射LNA-anti-202斑马鱼早期胚胎 (a) Wild-type zebrafish embryos; (b) LNA-anti-NC injected zebrafish embryos; (c) LNA-anti-202 injected zebrafish embryos |
为了证明上述发现是miR-202功能被抑制的结果，我们检测了LNA-anti-202注射后miR-202的水平。通过提取野生型以及注射LNA-anti-202、LNA-anti-NC的早期斑马鱼胚胎的miRNA，以U6 snRNA为内参进行实时荧光定量反转录PCR检测miR-202，结果发现注射LNA-anti-202的斑马鱼胚胎miR-202水平与野生型胚胎及注射LNA-anti-NC的胚胎相比有显著性的降低(图 4)。
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图 4 miR-202被反义抑制后在斑马鱼早期胚胎发育中的水平变化
Fig. 4 Expression of miR-202 after microinjection of LNA-anti-202
*表示差异极显著(P<0.01) *indicates there is a significant difference |
同时，我们还利用整体原位杂交技术检测了miR-202的水平。结果显示，注射LAN-anti-202后斑马鱼4 hpf胚胎与野生型相比，未检测到miR-202的表达，与实时荧光定量反转录PCR结果相一致(图 5)。
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图 5 miR-202被反义抑制后的空间表达
Fig. 5 Spatial expression of miR-202 after microinjection of LNA-anti-202
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为了证明抑制miR-202导致的胚胎发育停滞是LNA-anti-202特异性的作用，我们共注射pre-miR-202和LNA-anti-202于斑马鱼胚胎，每隔一段时间进行表型观察以及照片拍摄，记录鱼卵的畸形率以及死亡率。其结果显示，共注射pre-miR-202和LNA-anti-202后，胚胎可以度过4 hpf发育期，但是在6~24 hpf发育期陆续停滞死亡。因此pre-miR-202可以部分挽救由miR-202敲降所引起的胚胎发育停滞(图 6)。
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图 6 斑马鱼受精卵共注射pre-miR-202和LNA-anti-202
Fig. 6 Co-injection of pre-miR-202 and LNA-anti-202 rescued the zebrafish embryonic development
rescue表示pre-miR-202和LNA-anti-202共注射 rescue indicates the co-injection of pre-miR-202 and LNA-anti-202 |
早期研究发现miR-202在多种生物的性腺发育分化中特异性表达，如鸡胚性腺向雄性分化时，miR-202表达上调[21]，在性别决定基因sox9缺陷大鼠中，miR-202表达下调[20] 等，因此miR-202可作为睾丸发育分化的特征性miRNA。这也预示着miR-202可能在调控组织发育分化中起重要作用。而斑马鱼胚胎发育中涉及多种器官组织的发育与分化，但是miR-202在胚胎发育中的调控作用却鲜有研究，为了研究miR-202在斑马鱼早期胚胎发育中的调控功能，首先要研究它在胚胎发育过程中的表达。
本研究通过实时荧光定量反转录PCR技术和整体原位杂交技术发现miR-202在斑马鱼未受精卵中表达水平最高，提示miR-202是母源性分子。miR-202在整个胚胎发育过程持续表达，说明miR-202可能在斑马鱼胚胎发育整个过程中起作用。尽管有报道miR-202初始转录产物(pri-miR-202)在小鼠胚胎发育11.5 dpc性腺中有所表达，但在小鼠早期胚胎发育过程中未检测到[20]。成熟miR-202在早期胚胎发育过程中的表达也未曾有报道，提示母源性miR-202可能调控斑马鱼早期胚胎发育相关基因的表达。
通过注射miR-202的反义锁核苷酸诱导斑马鱼胚胎发育至4 hpf停滞，并在6～8 hpf之间死亡；共注射miR-202前体可以部分挽救胚胎发育异常，证实miR-202的敲降特异性可引起胚胎发育异常。这些结果证明miR-202功能是斑马鱼胚胎发育早期所必需的，其功能丧失将导致胚胎发育彻底停滞在4 hpf。共注射miR-202前体只能部分挽救miR-202反义核酸引起的发育阻滞，在证明了miR-202反义核酸作用特异性的同时，也提示我们斑马鱼胚胎发育顺利完成可能需要miR-202水平和功能的精准控制。
miR-202如何发挥调控作用是需要进一步研究的问题。由于miRNA主要通过调控下游靶基因mRNA来发挥作用，所以鉴定其靶基因是其进一步功能研究的重要部分。虽然有报道，miR-202通过调控靶基因ALR5A、LRP6、Gli2、MYCN等抑制细胞增殖从而具有抑癌作用[22]，而miR-202调控早期胚胎发育的靶基因却未曾有相关报道。斑马鱼早期胚胎发育过程基因表达是极其复杂的，胚胎发育也包含很多事件，例如三胚层的分化，细胞运动、器官的生成以及体节的形成等，涉及到Bmp信号通路、Wnt信号通路和Nodal信号通路等，这些调控因子控制着细胞的分化、运动等，其中非经典的Wnt信号对原肠的形成是至关重要的[23]。而miR-202被反义抑制引起胚胎在发育到4 hpf，即囊胚晚期(球形期)时停滞，此时期的细胞重排比任何发育阶段都要快，并且即将进入原肠期，提示miR-202可能调控细胞迁移相关因子。我们后续研究将围绕寻找miR-202的靶基因实验展开，以揭示miR-202在早期胚胎发育过程的调控机制。
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2. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai 201306, China;
3. Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China